一种提取食用植物油中残留蛋白的方法
【专利摘要】本发明提供了一种提取食用植物油中残留蛋白的方法，该方法利用SDS提取液分离出食用油中的残留蛋白，经浓缩、纯化后，可利用电泳技术分析蛋白质，获得残留蛋白的电泳图谱，还可以应用质谱技术鉴定残留的主要蛋白质种类。
【专利说明】一种提取食用植物油中残留蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取食用植物油中残留蛋白的方法，属生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]食用油中残留的痕量蛋白是潜在的过敏原，也可用作‘分子印迹’——区分不同种类、来源甚至品牌的食用油，还可作为食用油品质和生产工艺的辅助检测指标。由于食用油的理化性质及其生产工艺特点，从非极性的食用油中提取、分离残留的蛋白质十分困难。
[0003]长期以来，市场上各种食用油的质量参次不齐，以次充好、以假充真的情况较为严重，如将低价位或劣质油掺入高质量油中进行销售，损害消费者利益，危害消费者健康。目前，从食用油中提取足量残留蛋白质用于后续定性和定量研究的方法仍未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提取食用油的残留蛋白，为解决上述问题，本发明了提供一种快速简便的从食用油中提取残留蛋白的方法。
[0005]本发明的技术方案是以下述方式实现的:
一种提取食用植物油中残留蛋白的方法，它由以下步骤组成:
(1)向离心管中加入 36~44ml食用油和9~IIml提取液混合均匀；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以8000~12000g的离心力离心4~6 min ；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.5~3.5 ml50%TCA，充分混合后，冰浴15~25 min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以8000~12000g的离心力离心8~
12min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.5~2.5 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以10000~14000g的离心力离心4~6min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7 )室温晾干步骤(6 )得到蛋白质沉淀。
[0006]一种提取食用植物油中残留蛋白的方法，它由以下步骤组成:
Cl)向离心管中加入38~42ml食用油和9.5~10.5ml提取液混合均匀；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以9000~IlOOOg的离心力离心4.5~5.5min ；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.75~3.25 ml50%TCA，充分混合后，冰浴17.5~22.5 min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以9000~IlOOOg的离心力离心9~
11min ；(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.75~2.25 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以11000~13000g的离心力离心4.5~5.5min,离心后弃上清,得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
[0007]—种提取食用植物油中残留蛋白的方法，它由以下步骤组成:
(1)向离心管中加入40ml食用油和IOml提取液混合均匀；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以1000Og的离心力离心5min；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入3ml 50%TCA，充分混合后，冰浴20 min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以1000Og的离心力离心10min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入2ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以12000g的离心力离心5min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
[0008]所述提取液由0.2% SDS, pH 7.5，0.1 MTris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成。
相对于现有技术，本发明简便快速，I h即可完成；适用性广，可用于各种食用油中残留蛋白质的提取分离；成本低，不需要昂贵的试剂盒；产率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为某品牌压榨花生油中残留蛋白的SDS-PAGE电泳分析图谱。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
(1)向离心管中加入36~44ml食用油和9~Ilml提取液混合均匀；提取液由0.2% SDS,pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以8000~12000g的离心力离心4~6 min； (3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.5~3.5 ml50%TCA，充分混合后，冰浴15~25 min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以8000~12000g的离心力离心8~
12min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.5~2.5 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以10000~14000g的离心力离心4~6min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
[0011]实施例2
(I)向离心管中加入38~42ml食用油和9.5~10.5ml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以9000~IlOOOg的离心力离心4.5~
5.5min ；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.75~3.25 ml50%TCA，充分混合后，冰浴17.5~22.5 min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以9000~IlOOOg的离心力离心9~11 min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.75~2.25 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以11000~13000g的离心力离心4.5~5.5min,离心后弃上清,得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
[0012]实施例3
(O向离心管中加入36ml某品牌压榨花生油和9ml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成； (2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以8000g的离心力离心4min；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.5 ml 50%TCA，充分混合后，冰浴15min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以8000g的离心力离心8min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.5 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以1000Og的离心力离心4min,离心后弃上清，
得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。可提取出28.5yg残留蛋白。
[0013]实施例4
(1)向离心管中加入38ml某品牌压榨花生油和9.5ml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以9000g的离心力离心4.5min ；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.75 ml 50%TCA，充分混合后，冰浴17.5min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以9000g的离心力离心9min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.75 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以IlOOOg的离心力离心4.5min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。可提取出29.25 yg残留蛋白。
[0014]实施例5
(O向离心管中加入40ml某品牌压榨花生油和IOml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以1000Og的离心力离心5min；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入3ml50%TCA，充分混合后，冰浴20min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以1000Og的离心力离心10min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入2ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以12000g的离心力离心5min,离心后弃上清，
得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。可提取出30yg残留蛋白。
[0015]实施例6
(1)向离心管中加入42ml某品牌压榨花生油和10.5ml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以IlOOOg的离心力离心5.5min ；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入3.25ml 50%TCA，充分混合后，冰浴22.5min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以IlOOOg的离心力离心11min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入2.25ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以13000g的离心力离心5.5min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。可提取出30.75 yg残留蛋白。
[0016]实施例7
(O向离心管中加入44ml某品牌压榨花生油和Ilml提取液混合均匀；提取液由0.2%SDS, pH 7.5,0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT 组成；
(2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以12000g的离心力离心6min；
(3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入3.5ml 50%TCA，充分混合后，冰浴25min ；
(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以12000g的离心力离心12min ；
(5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入2.5ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀；
(6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以14000g的离心力离心6min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀；
(7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。可提取出31.5yg残留蛋白。 [0017]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
【权利要求】
1.一种提取食用植物油中残留蛋白的方法，其特征在于:它由以下步骤组成: (1)向离心管中加入36~44ml食用油和9~IIml提取液混合均匀； (2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以8000~12000g的离心力离心4~6 min ； (3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.5~3.5 ml50%TCA，充分混合后，冰浴15~25 min ； (4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以8000~12000g的离心力离心8~12 min ； (5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.5~2.5 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀； (6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以10000~14000g的离心力离心4~6min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀； (7 )室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
2.根据权利要求1所述的提取食用植物油中残留蛋白的方法，其特征在于:它由以下步骤组成: Cl)向离心管中加入38~42ml食用油和9.5~10.5ml提取液混合均匀； (2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以9000~IlOOOg的离心力离心4.5~5.5min ； (3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入2.75~3.25 ml50%TCA，充分混合后，冰浴17.5~22.5 min ； (4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以9000~IlOOOg的离心力离心9~11min ； (5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入1.75~2.25 ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀； (6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以11000~13000g的离心力离心4.5~5.5min,离心后弃上清,得蛋白质沉淀； (7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的提取食用植物油中残留蛋白的方法，其特征在于:它由以下步骤组成: (1)向离心管中加入40ml食用油和IOml提取液混合均匀； (2)将步骤(1)得到的食用油和提取液的混合液以1000Og的离心力离心5min； (3)取步骤(2)离心后的食用油和提取液的混合液的下层水相，加入3ml 50%TCA，充分混合后，冰浴20 min ；(4)将步骤(3)得到的下层水相和TCA的混合物以1000Og的离心力离心10min ； (5)将步骤(4)离心后的下层水相和TCA的混合物弃上清，加入2ml 80%冷丙酮冲洗沉淀，回收沉淀； (6)将步骤(5)得到的冷丙酮冲洗的沉淀以12000g的离心力离心5min,离心后弃上清，得蛋白质沉淀； (7)室温晾干步骤(6)得到蛋白质沉淀。
4.根据权利要求 1或2或3所述的提取食用植物油中残留蛋白的方法，其特征在于:所述提取液由 0.2% SDS, pH 7.5,0.1 mol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, 10 mmol/L DTT 组成。
【文档编号】C07K1/30GK103992370SQ201410124871
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】王伟, 吴晓林, 熊二辉 申请人:河南农业大学