利用两个连接物制备羟烷基淀粉衍生物的方法

专利名称：利用两个连接物制备羟烷基淀粉衍生物的方法
利用两个连接物制备羟烷基淀粉衍生物的方法本发明涉及一种制备羟烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)将任选氧化的羟 烷基淀粉与包含至少两个官能团-O-NH2的化合物(D)或其盐反应，和b)将步骤a)获得的 羟烷基淀粉衍生物与包含至少两个独立地选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的 酮基的官能团的化合物(L)反应。具体而言，化合物(L)包含至少两个独立地选自醛基、半 缩醛基、-CH (OH)2、缩醛基、酮基和缩酮基的官能团W1和^。在巧或^中任一个或WjPW2 是酮基-C(O)-R的情况中，R优选选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取 代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。此外，本发明涉及通过所示方法可获得的和/ 或获得的羟烷基淀粉衍生物，尤其是羟乙基淀粉衍生物，及其用途。另外，本发明涉及特定 的羟烷基淀粉衍生物，尤其是这样的羟乙基淀粉衍生物。羟烷基淀粉(HAS)，尤其是羟乙基淀粉(HES)，是天然存在的碳水化合物聚合物支 链淀粉的取代的衍生物，其在玉米淀粉中以高达95重量％的浓度存在，且在体内由α-淀 粉酶降解。特别是HES显示出有利的生物学性质，并在临床中用作血容量置换剂和用于血 液稀释治疗(Sommermeyer 等人，1987，Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278 ；Weidler 等 X, 1991, Arzneimittel-forschung/Drug Res. ，41，494—498)。现有技术中描述了一些制备羟乙基淀粉衍生物的方法。DE26 16 086公开了血红蛋白与羟乙基淀粉的偶联，其中，在第一步骤中，交联剂 (如bromocyane)结合羟乙基淀粉，随后血红蛋白连接到中间产物上。HES使用的一个重要方面是稳定应用于例如循环系统以获得特定的生理效应的多 肽。这些多肽的一个具体例子是促红细胞生成素，它是分子量大约为34，OOOkDa的酸性糖 蛋白，对于调节血液循环中血红细胞的水平是必需的。多肽和酶应用的公知的问题是，这些蛋白质经常不能显示出理想的稳定性。尤 其是，促红细胞生成素具有相对短的血浆半衰期(Spivak和Hogans，1989，Blood 73，90 ； McMahon等人，1990，Blood 76，1718)。这意味着，治疗血浆水平迅速丧失，因而必须进行重 复的静脉施用。此外，在某些情况下，观察到对于肽的免疫反应。人们普遍认为，当多肽与聚合物分子偶合时，多肽的稳定性可以得到改善，且对于 这些多肽的免疫反应降低。WO 94/28024公开了用聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性的多肽显示出降低的免疫 原性和抗原性，并在血流中的循环明显长于非偶联的蛋白质，即具有更长的清除率。但是， PEG-药物偶联物显示出一些缺点，例如，它们没有显示出可以由体内降解途径的元件识别 的天然结构。因此，除了 PEG-偶联物外，已经制备了其他偶联物和蛋白质polymerates。WO 02/080979公开了包含活性剂和羟烷基淀粉的偶联物的化合物，其中，活性剂 和羟烷基淀粉或者直接连接或者通过连接化合物连接。关于直接连接，活性剂和羟烷基淀 粉的反应在包含至少10重量％的水的水性介质中进行。没有给出涉及连接到活性剂中包 含的连接羰基上的羟烷基淀粉衍生物的例子，既没有醛基或酮基，也没有缩醛基或半缩醛 基。WO 03/074087公开了羟烷基淀粉蛋白偶联物，其中，羟烷基淀粉和蛋白质分子之
10间的结合是共价的，且是由末端醛基或由醛基的反应产生的官能团与蛋白质的官能团偶合 产生的。WO 03/074088公开了羟烷基淀粉与低分子量化合物的偶联物，其中，羟烷基淀粉 和低分子量化合物之间的结合是共价的，且是末端醛基或由醛基的反应产生的官能团与低 分子量化合物的官能团偶合产生的。WO 2005/014024公开了由氨氧基或其衍生物官能化的聚合物，偶联物，其中，官能 化的聚合物通过肟连接基团与蛋白质共价偶合，还公开了制备官能化聚合物的方法，制备 偶联物的方法，通过本发明的方法获得的官能团化聚合物，通过所述方法获得的偶联物，和 包含至少一种偶联物的药物组合物，以及所述偶联物和组合物用于预防或治疗人类或动物 身体的用途。WO 2005/092390公开了羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物，其中，这些偶联物通过羟 烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质之间的共价键合形成，以及公开了制备这些偶联 物的方法和这些偶联物的用途。WO 2004/024777公开了羟烷基淀粉衍生物，尤其是可通过羟烷基淀粉与连接化合 物的伯氨基或仲氨基反应的方法获得的羟烷基淀粉衍生物。根据特别优选的实施方式，WO 2004/024777公开了可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物羟烷基淀粉与连接化合物 的伯氨基或仲氨基反应，产生的反应产物通过连接化合物的至少一个其他的反应基团与多 肽，优选与糖蛋白，尤其优选与促红细胞生成素反应。特别优选的羟烷基淀粉是羟乙基淀 粉。根据WO 2004/024777，羟烷基淀粉且优选羟基乙基淀粉在反应之前没有被氧化的其还 原末端与连接化合物反应。WO 2004/024776公开了羟烷基淀粉衍生物，尤其是可通过下述方法获得的羟烷 基淀粉衍生物羟烷基淀粉与交联化合物伯氨基或仲氨基反应，或者与两个交联化合物反 应，其中产生的羟烷基淀粉衍生物具有至少一个能够与另一种化合物的官能团Y反应的官 能团X，且其中该基团Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或硫醇基。根据特别优选的实施 方式，WO 2004/024776涉及可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物羟烷基淀粉与交 联化合物的伯氨基或仲氨基反应，产生的反应产物任选地进一步与第二交联化合物反应， 其中产生的羟烷基淀粉衍生物具有至少一个能够与另一种化合物的官能团Y反应的官能 团X，且其中该基团Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或硫醇基，且产生的反应产物与多肽， 优选与如AT III、干扰素β或促红细胞生成素的多肽，尤其优选与促红细胞生成素反应， 该多肽包含这些官能团Y中的至少一种。尤其优选的羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。根据WO 2004/024776,羟烷基淀粉，优选羟基乙基淀粉，在反应之前任选氧化的还原末端与连接化 合物反应。WO 2004/024776没有提到下述方法将HAS与第一连接化合物反应制备的HAS 衍生物与第二连接化合物经过HAS衍生物的官能团-O-NH2与第二连接化合物的官能团的 反应(其中，获得肟连接)进行反应。涉及血红蛋白通过间隔物(spacer)连接到多糖上的方法的DE 3029 307 Al也没 有提及通过将HAS与第一连接化合物反应制备的HAS衍生物经HAS衍生物的官能团-O-NH2 和第二连接化合物的官能团的反应(其中，获得肟连接)而与第二连接化合物反应的方法。WO 2005/092928公开了羟烷基淀粉(优选羟乙基淀粉)与蛋白质的偶联物，其中， 这些偶联物通过羟烷基淀粉或羟烷基淀粉衍生物的至少一个醛基与蛋白质的至少一个氨
11基之间的还原胺化反应形成，使得羟烷基淀粉或其衍生物通过甲亚胺(azomethine)连接 或氨基亚甲基(aminomethylene)连接与蛋白质共价连接。WO 2005/092928还涉及制备这 些偶联物的方法及这些偶联物的特定用途。US 2006/0194940A1公开了水溶性聚合物链烷醛。其中，公开了与聚合物反应的 保护醛试剂。虽然一般地提及多糖，但特别优选的聚合物是聚乙二醇。US 2006/0194940A1 并没有公开淀粉或尤其是改性淀粉(例如羟烷基淀粉)。因此，US 2006/0194940A1没有公 开涉及将特定连接化合物与羟烷基淀粉偶合的具体方法。上述情况也存在于US7157546B2、 EP 1591467A1 和 WO 2004/022630A2 中。US 6，916，962B2公开了未保护和保护形式的氨基乙缩醛交联化合物。该文件中没 有公开有关该交联化合物可能与聚乙二醇之外的聚合物的偶合。特别是，us 6，916，962B2 没有公开淀粉，更不用说改性淀粉如羟烷基淀粉。因此，US 6，916，962B2没有公开给定 的连接化合物与羟烷基淀粉偶合的具体方法。上述情况也存在于US 6，956，135B2和WO 03/049699A2 中。US 5，990，237公开了包含保护的醛基的结构。包含这些结构的化合物优选与聚乙 二醇偶合，且偶合经过作为含保护的醛基的化合物中包含的官能团的卤素进行，该卤素基 团与聚乙二醇的羟基反应。本发明的目的是提供一种获得羟烷基淀粉衍生物的新的方法。本发明的进一步目的是提供一种考虑给定的羟烷基淀粉衍生物与生物活性物质 的氨基的优选反应条件的情况下获得羟烷基淀粉衍生物的新的方法。本发明的进一步目的是提供新颖的羟烷基淀粉衍生物，尤其是羟乙基淀粉，特别 地，其特征在于羟烷基淀粉(尤其是羟乙基淀粉)与给定的生物活性剂(尤其是蛋白质) 之间的新型间隔物结构。因此，本发明涉及一种通过以下步骤制备羟烷基淀粉(HAS)衍生物的方法a)将任选氧化的羟烷基淀粉与包含至少两个官能团-O-NH2的化合物(D)或其盐 反应，和b)将步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物与包含至少两个独立地选自醛基、适当保 护的醛基、酮基和适当保护的酮基的官能团W1和W2的化合物(L)反应。I.羟烷基淀粉在本发明中，术语“羟烷基淀粉” (HAS)指已被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。 本发明优选的羟烷基淀粉具有式(I)的构成(constitution) 其中，HAS'是羟烷基淀粉分子的其余部分，且RpR2和R3独立地为氢、直链或分支
12羟烷基或-[(CR1R2) m0] n [CR3R4]。-OH基团，其中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢和烷基，优选氢 和甲基，m是2至4，其中，m个CR1R2基团中的残基R1和R2可以相同或不同；η为0至20，优选0至4 ；ο是2至20，优选2至4，其中，ο个CR3R4基团中的残基R3和R4可以相同或不同。优选地，R1、R2和R3独立地为基团-(CH2CH2O) η_Η，其中，η是整数，优选是0、1、2、3、 4、5或6，且特别地，礼、R2和R3独立地为氢或2-羟乙基。在式(I)中，淀粉分子的还原末端显示为非氧化形式，且HAS的末端糖单元显示为 半缩醛形式，其可以根据例如溶剂的不同与(游离的)醛形式相平衡。用于本发明的缩写 HAS'指在HAS分子的还原末端没有末端糖单元的HAS分子。这可以由用于本发明的术语 “羟烷基淀粉分子的其余部分”来表示。用于本发明的术语“羟烷基淀粉”并不局限于其中末端糖部分包含在式(I)中为 简洁起见所描述的羟烷基礼、R2和/或R3的化合物，还指其中存在于任何位置的至少一个 羟基(在末端糖部分中和/或在羟烷基淀粉分子的其余部分HAS'中)被羟烷基队、R2和 /或民取代的化合物。包含两个或多个不同羟烷基的羟烷基淀粉也是可能的。HAS中包含的至少一个羟烷基可以包含一个或多个，尤其是两个或多个羟基。根据 优选的实施方式，HAS中包含的至少一个羟烷基包含一个羟基。词语“羟烷基淀粉”还包括其中烷基被单取代或多取代的衍生物。在本文中，优选 烷基被卤素(尤其是氟)或芳基取代。此外，羟烷基的羟基可以被酯化或醚化。此外，可以使用直链或分支的取代或未取代的链烯基代替烷基。羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物，在本发明中也可以使用其他 淀粉衍生物。例如，包含酯化羟基的衍生物是有用的。这些衍生物可以是，例如，未取代的 2-12个碳原子的单或二羧酸的衍生物或其取代的衍生物。特别有利的是未取代的2-6个碳 原子的单羧酸衍生物，尤其是乙酸衍生物。在本文中，乙酰淀粉、丁酰淀粉和丙酰淀粉是优 选的。此外，未取代的2-6个碳原子的二羧酸的衍生物是优选的。在二羧酸衍生物的情况下，有用的是二羧酸的第二羧基也被酯化。此外，二羧酸的 单烷基酯的衍生物也适用于本发明中。对于取代的单或二羧酸，取代基可以优选地与上述对于取代的烷基残基的取代基 相同。淀粉酯化技术是本领域已知的(参见，例如，Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry 第 2 卷，1998，WiIey-VCH, ffeinheim, New York,尤其是第 4. 4 章， Esterification of Cellulose(ISBN 3-527-29489-9))。根据本发明优选的实施方式，使用上述式(I)的羟烷基淀粉。HAS'中包含的其他 糖环结构可能与明确描述的糖环相同或不同，区别在于它们缺少还原末端。对于式⑴的残基礼、R2和R3,没有特别的限制。根据优选的实施方式，R1^ R2和 R3独立地为氢或在各自的烷基残基具有2到10个碳原子的羟烷基、羟基芳烷基或羟基烷芳 基。优选氢和具有2至10个碳原子的羟烷基。更优选羟烷基具有2至6个碳原子，更优选2到4个碳原子，甚至更优选2到3个碳原子。在优选的实施方式，羟烷基淀粉是羟乙基淀 粉，其中，R1、R2和R3独立地为氢或(CH2CH2O) n_H基团，其中，η是整数，优选是0、1、2、3、4、5 或6。因此，“羟烷基淀粉”优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟基丁基淀粉，其中，羟 乙基淀粉和羟丙基淀是特别优选的，且羟乙基淀粉是最优选的。烷基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或分支的，且被适当取代。因此，本发明还涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R1, R2和R3独立地为氢 或具有2至6个碳原子的直链或分支羟烷基。因此，礼、R2和R3优选可以为氢、羟己基、羟戊基、羟丁基、羟丙基(如2-羟丙基、 3-羟丙基、1-羟异丙基)、羟乙基(如2-羟乙基)，氢和2-羟乙基是特别优选的。因此，本发明还涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，R1, R2和R3独立地为氢 或2-羟乙基，其中至少一个残基礼、R2和R3是2-羟乙基的实施方式是特别优选的。羟乙基淀粉(HES)对于本发明的所有实施方式是最优选的。因此，本发明涉及如上所述的方法和HAS衍生物，其中，聚合物是羟乙基淀粉，且 衍生物是羟乙基淀粉(HES)衍生物。HAS，尤其是HES，主要由分子量分布、取代度和C2 (；取代比来表征。有两种描 述取代度的可能方式HAS取代度(DS)对于取代的葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例相对地进 行描述。HAS的取代模式也可以描述为摩尔取代度(MS)，其中计算每个葡萄糖部分的羟乙 基的数目。在本发明中，HAS(优选HES)的取代模式被称为MS，如上所述(也参见 Sommermeyer 等人，1987，Krankenhauspharmazie, 8 (8)，271-278，尤其是第 273 页)在HES分子全部水解后，通过气相色谱法测定MS。给出各个HAS (尤其是HES)起 始原料的MS值。假定，在本发明方法的步骤a)和b)的衍生化过程中MS值不受影响。HAS (尤其是HES)溶液作为多分散的组合物存在，其中各个分子在聚合度、分支位 点的数目和模式及取代模式方面与其它分子不同。HAS(尤其是HES)因此是具有不同分子 量的化合物的混合物。因此，在统计方法的帮助下，通过平均分子量确定特定的HAS(尤其 是HES)溶液。在本文中，Mn计算为取决于分子数目的算术平均值。可选择地，Mw(或MW)， 重均分子量，代表取决于HAS (尤其是HES)质量的单位。在本文中，数均分子量通过等式1定义 其中，ni是摩尔质量为Mi的种类i的分子数目。E表示值是平均值，但横线(line)按照惯例通常省略。Mw是重均分子量，由等式2定义
其中，ni是摩尔质量为Mi的种类i的分子数目。I,表明值是平均值，但横线按照惯例通常省略。优选用于本发明中的羟烷基淀粉(尤其是羟乙基淀粉)具有1到大约IOOOkDa, 更优选大约1至大约800kDa，更优选大约1至大约500kDa，更优选大约2至大约400kDa， 更优选大约5至大约300kDa，更优选大约10至大约200kDa，尤其是大约50至大约150kDa 的平均分子量(重均)。羟乙基淀粉可以进一步显示出0. 1至3、优选0. 1至2、更优选0. 1 至0. 9或0. 4至2、优选0. 4至1. 3的优选摩尔取代度，和显示出对于羟乙基优选2至20的 C2 C6取代的比例。用于本发明的术语“平均分子量”涉及根据Sommermeyer等人，1987， Krankenhauspharmazie, 8 (8) ,271-278 禾口 Weidler 等人，1991, Arzneim. -Forschung/Drug Res. ,41,494-498所述的LALLS-(小角激光光散射)-GPC方法测定的重量。另外，对于 IOkDa和更小的平均分子量，用预先通过LALLS-GPC证明的标准进行校准。根据本发明优选的实施方式，使用的羟乙基淀粉的平均分子量是大约1至大约 IOOOkDa,更优选大约1至大约800kDa，更优选大约1至大约500kDa，更优选大约2至大约 400kDa,更优选大约5至大约300kDa，更优选大约10至大约200kDa，尤其是大约50至大约 150kDa。此外，HAS (尤其是HES)的摩尔取代度为优选大约0. 1至大约3，优选大约0. 4至 大约 1. 3，如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1· 2 或 1. 3。具有大约5至300kDa、优选50到150kDa的平均分子量的HES的例子是具有0. 1 至 3，优选是 0.4 至 1.3，如 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1.2 或 1.3 的摩尔取代度
的 HES。至于C2 C6取代的比例，所述取代比优选在2到20，更优选2到15，甚至更优选 3至12的范围内。除了羟烷基淀粉之外的其它淀粉一般情况下，也可以使用除了上述羟烷基淀粉(尤其是羟乙基淀粉)之外的其他 淀粉进行本发明的方法和制备本发明的衍生物，条件是这些淀粉也包含以半缩醛形式(任 选地与(游离的)醛形式相平衡)存在的还原末端，该还原末端可以被适当氧化以产生相 应的氧化形式。特别地，可以使用高度分支的、未取代的或低取代的淀粉产物，即具有比支 链淀粉明显更高的分支度，并具有糖原的α -1，6分支程度，或者甚至超过这一点，并且如 果取代的话，仅具有高达0. 3，优选0. 05到0. 3的摩尔取代度MS的淀粉。此处使用的术语 高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物的MS(摩尔取代度)是指每脱水葡萄糖单元的羟 乙基或羟丙基基团的平均数。通常通过测定样品中羟乙基或羟丙基基团的含量和对其中存 在的脱水葡萄糖单元的计算分配来测量MS。也可以通过气相色谱法测定MS。可以通过气相 色谱甲基化分析以聚合物中的0-1，4，6-糖苷连接的脱水葡萄糖的摩尔％测定分支度。每 种情况下分支度是平均值，因为本发明的高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物是多分散的化合物。所述高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物中葡萄糖单元通过α-1，4_和 α-1，6_键连接。分支度是指以全部脱水葡萄糖中以总体的摩尔％计的α-1，4，6_连接葡 萄糖单元的比例。C2/C6比例表示仏处与(；处取代的比例。高度分支的、未取代或低取代 的淀粉产物具有可通过在分支酶帮助下的转糖苷步骤获得的优选6%至50%的分支度。甚 至更优选地，分支度为10至45，更优选20至40 (如20、25、30、35或40)。也优选为大于20 至40，优选大于20至30如21到40，优选21至30。可用于这一目的的起始原料在原则上可以为任何淀粉，但优选具有高比例支链淀 粉的蜡质淀粉(waxy starch)或支链淀粉部分本身。淀粉产物(涉及这些“其他淀粉”) 用于本发明必要的分支度以脱水葡萄糖的摩尔％表示在8%到20%的范围内。这意味着， 可用于本发明目的的淀粉产物平均每12. 5至5个葡萄糖单元具有一个α -1，6连接，因而 具有一个分支点。优选的高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物具有超过10%至高达 20%，且尤其是11%至18%的分支度。较高的分支度意味着本发明的淀粉产物的较高溶 解度和这些溶解的淀粉产物在体内的较高的生物利用度。特别优先具有超过10%，尤其是 11%至18%的分支度的未改性淀粉产物。可以通过以使用所谓分支或转移酶的酶效应组装 (enzymatic assembly)为靶标，在适当情况下接着用羟乙基或羟丙基对游离的羟基进行部 分衍生化而制备高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物。代替这种方法，可以通过使用所 谓分支或转移酶的酶效应组装将羟乙基化或羟丙基化的淀粉转化成为高度分支的、未取代 或低取代的淀粉产物。从具有高达10%分支度的小麦淀粉通过酶作用获得的分支淀粉产物 本身是已知的，并在例如 WO 00/66633A 中有描述。WO 00/18893A、US 4，454，161、EP 0 418 945A.JP 2001294601A或US 2002/065410A公开了合适的分支或转移酶和其获得方法。后 一公开描述了具有超过4%至高达10%或更高的分支度的未改性的淀粉产物。可以以本身 已知的方法完成酶促转糖苷作用(transglycosilation)，例如，通过在6至8的pH值和25 至40°C的温度的温和条件下在水溶液中，与适当的酶一起温育蜡质玉米淀粉、由具有高支 链淀粉含量的马铃薯获得的马铃薯淀粉、或由大米、木薯、小麦、具有高支链淀粉含量的小 麦、玉米、具有高支链淀粉含量的玉米、或者具有高直链淀粉含量的玉米获得的淀粉。分子 量Mw用于高度分支的、未取代或低取代的淀粉产物时是指重均分子量。这可以通过各种方 法由本身已知的方式测定，即通过凝胶渗透色谱(GPC)或高压液相色谱法(HPLC)结合光散 射和RI检测测定。取代淀粉优选的(2/(6比是5至9的范围。高度分支的、未取代或低取 代的淀粉产物的高分支度提高其水溶解性至羟乙基或羟丙基取代可完全或基本上分散的 程度，以将淀粉保持在溶液中。可以经过腹膜的通透性限制以合适的方式增加高度分支的、 未取代或低取代的淀粉产物的平均分子量。可以用于这种情况中的特征变量也是所谓底部 分BF90% (作为较小分子部分的比例的量度的90%峰面积的分子量)的GPC值。通过在 跨腹腔膜吸收急剧降低的同时适当提高分子量可以达到更大的超滤(UF)效率。同时，由内 源性淀粉酶的降解作用产生的(其不再进一步由淀粉酶降解)且存储在器官或组织中的高 分子量残留片段不再出现或此时只以较低的程度出现。II.步骤 a)在本发明方法的步骤a)中，任选氧化的HAS与包含至少两个官能团-O-NH2的化 合物(D)或其盐反应。在优选的实施方式中，HAS在与化合物(D)反应之前没有被氧化。在特别优选的实施方式中，HAS在与化合物(D)反应之前没有被氧化的HAS的至少一个还原末端与化合 物⑶反应。用于本发明中的术语“HAS在至少一个还原末端反应”可能涉及HAS主要通过其还 原末端反应的过程。术语“主要通过其还原末端”涉及统计上超过50 %、优选至少55 %、更优选至少 60 %、更优选至少65 %、更优选至少70 %、更优选至少75 %、更优选至少80 %、更优选至少 85%、更优选至少90%、还更优选至少95%如95%、96%、97%、98%或99%的给定的反应 所采用的HAS分子通过每HAS分子至少一个还原末端反应的过程，其中通过至少一个还原 末端反应的给定的HAS分子可以在给定的同样反应中通过所述聚合物分子中包含的且为 非还原末端的至少一个另外的适当官能团反应。如果一个或多个HAS分子通过至少一个还 原末端并同时通过这一(这些)HAS分子中包含的且不是还原末端的至少一个另外的适当 官能团反应，那么，这些HAS分子的所有反应的官能团(所述官能团包括还原末端)统计学 上优选超过50 %、优选至少55 %、更优选至少60 %、更优选至少65 %、更优选至少70 %、更 优选至少75 %、更优选至少80 %、更优选至少85 %、更优选至少90 %、还更优选至少95 %如 95%、96%、97%、98%或 99%是还原末端。用于本发明中的术语“还原末端”涉及HAS分子的末端醛基，其可以作为醛基和/ 或作为相应的半缩醛形式和/或作为缩醛基存在，所述缩醛基具有下面的结构
如果上述式(I)的残基-OR3是-O-CH2-CH2-OH,则其可以存在。如果HAS在与化合物⑶反应之前被氧化，那么在一个实施方式中，该反应可以进 行以使得至少两个醛基按照下式被引入HAS中 根据本发明的这一实施方式，可使用能够氧化聚合物的至少一个糖环以产生具有 至少一个、优选至少两个醛基的开放的糖环的各氧化剂或氧化剂的组合。通过下面的反应 路线举例说明该反应，其显示聚合物的糖环被氧化以产生具有两个醛基的开放环 合适的氧化剂其中有高碘酸盐，如高碘酸碱金属盐或其两种或多种的混合物，优 选高碘酸钠和高碘酸钾。在优选的实施方式中，在步骤a)中，化合物⑶或其盐通过至少两个官能 团-O-NH2中的至少一个与羟烷基淀粉的醛基和/或半缩醛基和/或缩醛基反应，特别地化 合物(D)或其盐通过至少两个官能团-O-NH2中的至少一个与羟烷基淀粉的至少一个还原 末端反应，且其中羟烷基淀粉在步骤a)的反应前没有被氧化。在优选的实施方式中，用于步骤a)中的化合物(D)具有式(II)的结构H2N-O-R4-O-NH2 (II)或其盐，其中，R4选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未 取代的亚烷基(亚烷基链中可能含有杂原子)、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚 芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基及取代或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷 基(heteroaralkylene)和取代或未取代的亚烷杂芳基(alkheteroarylene)。化合物D)的 盐优选是其中官能团-O-NH2被质子化且各基团-O-NH3+相互独立地具有药学上可接受的阴 离子(如氯离子、硫酸氢根、硫酸根、碳酸根，碳酸氢根、柠檬酸根、磷酸根和/或磷酸氢根) 的化合物D)。在优选的实施方式中，其中，R4选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分 支的、取代或未取代的亚烷基(且在亚烷基链中不合有杂原子)、取代或未取代的亚芳基、 取代或未取代的亚芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基及取代或未取代的亚杂芳基、取代或 未取代的亚杂芳烷基和取代或未取代的亚烷杂芳基，R4可以被1至4个，优选1个选自C1-C6 烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和叔丁基)、卤素(如氯、溴)、羟基和巯基的取代基 取代。在一个优选的实施方式中，式(II)的化合物⑶中的R4选自C1-C12亚烷基、C6-C14 亚芳基和_[ (CR5R6)m0]n[CR7R8]。-，其中，R5、R6、R7和R8彼此独立地选自氢、烷基和芳基，m是 2至4 ;n为0至20，和ο是2至20，其中在η为0的情况下，ο不是0。优选地，式(II)的化合物(D)中的R4 为 _[(CR5R6)m0]n[CR7R8]o-^，R5、R6、MP R8彼此独立地选自氢、C1-C6烷基和C6-C14芳基，m为1或2，η为1至5 ；和ο为1或2，最优 选地，其中，R5、R6、R7和R8彼此独立地选自氢和C1-C6烷基，优选选自氢、任选取代的，优选 非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基，尤其是氢，m是2，η是1和ο是2。在一个特别优选的实施方式中，用于步骤a)的化合物(D)是 禾口/ 或 禾口/ 或H2N-O- (CH2CH2O) 6_ΝΗ2或其盐，尤其是 或其盐。步骤a)中的反应优选在以下条件下进行HAS溶于水性介质中，优选在反应缓冲 液中，并加入化合物(D)。优选的反应缓冲液是，例如，柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、磷 酸钠缓冲液、碳酸钠缓冲液、硼酸钠缓冲液、水。优选反应缓冲液的PH值为2到9，更优选3 至7，更优选4至6，最优选大约5。基于HAS衍生物的Mn，化合物⑶与HAS的摩尔比优选彡200，更优选彡100。特 别优选的化合物⑶与HAS的摩尔比为90到10，更优选80到30，甚至更优选70到50。在大约0°C至大约40°C，更优选10°C至30°C的温度下，优选在室温下搅拌反应混 合物。优选反应进行大约5至大约30小时，更优选大约15至大约25小时。优选通过超滤或渗析将获得的羟烷基淀粉衍生物与反应混合物分离，优选超滤后 接着冻干分离的羟烷基淀粉分离。在一种替代的实施方式中，从反应混合物沉淀出羟烷基 淀粉衍生物，尤其是通过加入醇(优选2-丙醇)或通过超滤和/或冻干分离。获得的沉淀 物可以通过常规步骤纯化，尤其是通过离心、渗析、超滤和/或冻干。在一种替代的实施方式中，步骤a)另外包括在步骤b)之前将获得的羟烷基淀粉 衍生物还原。尤其是，根据这一实施方式，由或者还原末端(优选HES)或者由上述的开环 氧化反应获得的至少一个醛基(优选还原末端)与化合物(D)的基团-O-NH2反应获得的 肟连接基团-CH = N-O-还原为基团-CH2-NH-O15在此实施方式中，还原可以在合适的还原 剂(如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-( 二甲 基氨基)_吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲 基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或 三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH3或NaBH4)的存在下，在大约10°C至大约80°C的温度下 进行大约5小时至大约24小时(如过夜)。
在如上所述的替代实施方式中，在步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物直接用于步 骤b)中而不进行任何进一步的化学反应，优选不进行还原。III.步骤 b)在本发明方法的步骤b)中，步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物与包含至少两个独 立地选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的酮基的官能团W1和W2的化合物(L)反应。本发明中所用的术语“醛基”也包含醛合水(即-CH(OH)2)和对应于该醛基的半缩酸基。作为可能的“保护的醛基”，可以举例提及合适的缩醛基。作为可能的“保护的酮 基”，可以举例提及合适的缩酮基。因此，根据本发明的优选实施方式，化合物(L)包含至少两个独立地选自醛基、半 缩醛基、-CH(OH)2、缩醛基、酮基和缩酮基的官能团W1和W2。甚至更优选，化合物型(L)包含至少两个独立地选自半缩醛基、-CH(OH)2、缩醛基 和缩酮基及-C(O)-R基团(其中，R选自氢、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支 的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基)的官能团。在优选的实施方式中，在基团-C (0) -R是酮基的情况下，残基R选自C1-C6烷基和 C6-C14芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁 基、异丁基和叔丁基。在优选的实施方式中，化合物(L)通过该至少两个官能团W1和W2中的至少一个与 步骤a)获得的羟烷基淀粉或其盐的至少一个官能团H2N-O-反应。至于如以下标记为“A”的缩醛基或缩酮基，不存在特别的限制。在本发明中，术语 “缩醛基”还包括硫缩醛和氮缩醛，且术语“缩酮基”还包括硫缩酮和氮缩酮。根据本发明的 优选实施方式，基团A是式(IIa)的残基 其中，Z1和Z2各个独立地为0或S或NRX，优选为0，其中，Rx是H或低级烷基(如甲基、 乙基或丙基如正丙基或异丙基或C (0) -Ry，其中Ry优选选自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至 更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁 基)；A1和A2各个独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苯甲基、1，1， 1-三氯乙基、硝基苯甲基、甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基，或形成式(lib)的环 其中，A1和A2 —起为任选适当取代的-(CH2)2-或任选适当取代的-(CH2)3-或任选 适当取代的-(CH2CH(CH3))-,和其中，A3是H或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、苯甲基。优选，Z1和Z2中的至少一个是0，更优选Z1和Z2都是0。至于残基A3，根据本发明 缩醛基是优选的，即A3优选是H。如果A是缩酮基，优选A3是甲基。因此，根据本发明可以想象的缩酮基A特别是 以下的
或根据优选的实施方式,A1和A2各个是甲基或乙基，甚至更优选乙基。因此，根据本 发明，特别优选的缩醛基A是-CH(OCH3)2或-CH(OC2H5)2,尤其是-CH(0C2H5)2。根据其中A1 和A2形成式(IIb)的环的进一步的实施方式，A1和A2—起优选是-(CH2)2-。至于这一实 施方式，根据本发明尤其优选的缩醛基A是 进一步可以想象的缩醛基可以是，例如， 在本发明的特别优选实施方式中，用于步骤b)中的化合物(L)是双官能团交联化 合物。这种双官能团交联化合物除了独立地选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的 酮基的至少两个官能团W1和W2之外，不包含进一步的官能团。这些进一步的官能团可以是 任选适当保护的醛基和/或酮基，但还可以是其他官能团，例如，在任选适当保护的各情况
下，氨基、硫醇基、羧基、羟基、卤素基团等。在优选的实施方式中，用于步骤b)中的化合物(L)具有式(III)的结构W1-R9-W2 (III)，其中，R9选自化学键(优选单键)、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支 的、取代或未取代的亚烷基(亚烷基链中可能含有杂原子)、取代或未取代的亚芳基及取代 或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基及取代或未取 代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未取代的亚烷杂芳基，WJPW2基团(如上述定义)中的任一个或双个独立地选自醛基、适当保护的醛基、 酮基和适当保护的酮基，优选选自醛基、半缩醛基、-CH(OH)2、缩醛基、酮基和缩酮基，甚至 更优选选自半缩醛基、-CH(OH)2、缩醛基和缩酮基及基团-C(O)-R,其中R选自氢、饱和或不 饱和、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。甚至 更优选地，基团R选自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的 甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。优选R9是取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚烷基。特别地，R9是未取代 的C6-C14亚芳基或-(CH2)n-(η优选为1-6)，最优选亚苯基。优选R9是未取代的。如果R9是 取代的，它可以被1至4个、优选1个选自C1-C6烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和 叔丁基)、卤素(如氯、溴)、羟基和巯基的取代基取代。在优选的实施方式中，用于步骤b)中的化合物(L)选自在1，2_、1，3或1，4位被 两个官能团W1和W2取代的苯，所述两个官能团W1和W2独立地选自-CH = 0、半缩醛基、缩醛 基、缩酮基、-CH(OH)2和基团-C(O)-R,其中R选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或 不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基，优选选自C1-C6烷基和C6-C14芳基， 甚至更优选选自氢、任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基 和叔丁基。根据本发明的优选实施方式，化合物(L)的两个官能团W1和W2都是-CH = 0。在以下情况下，本发明的这种实施方式是特别优选的-由化合物(L)的基团-CH= 0与根据步骤a)获得的HAS衍生物的基团-O-NH2 反应产生的肟连接，-或者如上所述由化合物(D)与羟烷基淀粉的反应产生的肟连接，和由化合物(L)的基团-CH = 0与根据步骤a)获得的HAS衍生物的基团-O-NH2反应产生的肟连接，在步骤b)获得的HAS衍生物与以下详述的生物活性剂BA反应之前不进行还原。至于本发明的这一优选实施方式，优选的化合物(L)是，例如， 根据本发明的另一优选的实施方式，化合物(L)的一个官能团W1或W2是适当保护 的醛基或酮基，优选是适当保护的醛基，另一个官能团优选是未保护的醛基或酮基，更优选 是未保护的醛基。在以下情况下，本发明的这一实施方式是特别优选的-由化合物(L)的基团-CH= 0与根据步骤a)获得的HAS衍生物的基团-O-NH2 反应产生的肟连接，-或者如上所述由化合物(D)与羟烷基淀粉反应产生的肟连接和由化合物(L)的 基团-CH = 0与根据步骤a)获得的HAS衍生物的基团-O-NH2反应产生的肟连接在由步骤b)获得的HAS衍生物与以下详述的生物活性剂BA反应之前进行还原。 特别是，化合物(L)的官能团巧或^是保护的醛基或酮基，优选是适当保护的醛基，其在用 于还原上述肟连接的反应条件下是稳定的。适当的保护基应当是稳定的这样的反应条件是 例如，3至8的pH值、如作为还原剂NaCNBH3存在下的还原条件。对于官能团W1和W2的适 合的保护基是本领域的技术人员已知的，因此，可以由本领域的技术人员根据用于还原上 述肟连接的相应的还原条件来选择。至于本发明的这一优选的实施方式，可设想的化合物 (L)是，例如， 正如以下所述的，如果在由步骤b)获得的衍生物与以下详述的生物活性剂BA的 反应获得的HAS衍生物在由步骤b)获得的HAS衍生物和BA之间应包含两个还原的肟连接 (即-CH2-NH-O-)和优选亚甲胺连接(即-CH2-NH-)，特别选择本发明的这一实施方式。步骤b)中的反应优选在极性溶剂(优选DMF)或水/极性溶剂的混合物(优选具 有一定量极性溶剂的水/DMF，优选DMFS 50% (ν ν)，更优选<30% (ν ν))中进行。
基于HAS衍生物的Mn，化合物(L)与步骤a)获得的HAS衍生物的摩尔比优选 (200，更优选≤100，尤其是≤20。更优选，化合物(L)与步骤a)获得的HAS衍生物的摩 尔比是70到1，更优选40到2，甚至更优选10至5。反应混合物优选在5至80°C、更优选10至60°C、更优选20到50°C、甚至更优选 30至50°C和甚至更优选35至45°C (如大约35、40或45°C )的温度下搅拌。反应优选进行大约5至大约30小时，更优选大约15至大约25小时。优选通过超滤或渗析将获得的羟烷基淀粉衍生物与反应混合物分离，优选超滤后 接着冻干分离的羟烷基淀粉分离。在替代的实施方式中，羟烷基淀粉衍生物从反应混合物 沉淀出来，尤其是通过加入醇和/或酮(优选丙酮和乙醇的混合物)。获得的沉淀物可以通 过常规步骤纯化，尤其是通过离心、渗析、超滤和/或冻干。在替代的实施方式中，步骤b)另外包括还原获得的羟烷基淀粉衍生物。尤其是， 根据这一实施方式，通过化合物(D)的-O-NH2基团与化合物(L)的基团巧或^反应获得的 肟连接基团-O-N = CH-还原为基团-O-NH-CH2-,和/或如果适宜的话，在步骤a)中通过羟 烷基淀粉和化合物(D)的基团NH2-O-反应获得的基团-CH = N-O-还原为基团-CH2-NH-0-。 在该实施方式中，可能在化合物(L)可能存在的醛基或酮基进行适当保护之后，例如，在 用于还原上述肟连接基团的反应条件下稳定的合适保护基的形式(例如合适的缩醛的形 式)，还原可以在大约10°C至大约80°C的温度下，在合适的还原剂，如NaBH(OAc)3、硼氢化 钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼烷络合物、N-乙基 二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼 烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH3 或NaBH4的存在下进行5小时至24小时(如过夜)。如已经描述的，代替步骤b)之后的保 护基W1和W2，也可以使用化合物(L)作为步骤b)的起始材料，其已包含在用于还原上述肟 连接基团的反应条件下是稳定的适当保护的基团W1或W2。在替代的实施方式中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物可以直接用于步骤C)而 不进行任何进一步的化学反应，优选不进行还原。在优选的实施方式中，步骤a)获得的羟烷基衍生物可以在步骤b)中与基于儿的 大约2至大约70当量的化合物(L)反应， 特别是在极性溶剂(如DMF或DMF/水的混合物(10 90, ν ν))中，在室温或 者在大约40°C和随后在室温下，反应时间为大约10至大约24小时。获得的HAS衍生物然 后可以用乙醇/丙酮的1 l(v ν)的混合物进行沉淀，沉淀物然后可以溶解于极性溶剂 (如DMF)中，并再次沉淀。然后可以将沉淀物溶于水，并超滤和冻干。优选地，反应混合物可 以用水1 l(v ν)稀释，获得的沉淀物可以进行过滤或离心，并再次用水1 l(v ν) 稀释，获得的溶液然后可以进行超滤和冻干。
因此，本发明涉及具有以下结构的HAS衍生物(在下文中，假设化合物(L)与从步 骤a)获得的HAS衍生物的反应通过化合物(L)的官能团W1发生) 和/或相应的环结构(在HAS或HES的还原末端与化合物(D)之间包含非还原肟 连接的所有以下结构式中，以上显示的开环结构还应当包括如下所示的相应的环结构) 和/ 或 根据不同的反应条件和/或交联化合物的特定的化学性质，C-N双键可以以E或Z 构象存在，其中，两种形式的混合物也可能以一定的平衡分布而存在；至于用于本发明目的 的相应环结构应视为等同于上述的开放结构，并取决于反应条件和/或交联化合物的特定 的化学性质，这些HAS衍生物可以在平伏或直立位置存在N原子，其中，两种形式的混合物 也可以以一定的平衡分布而存在。因此，根据优选的实施方式，本发明还涉及HAS衍生物，优选HES衍生物，其中甚至 更优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约 500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约 200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15 和甚至更优选3至12的C2 C6取代比
禾口/ 或 根据其他优选的实施方式，本发明还涉及上述2种结构的HAS衍生物，优选HES衍
生物，其中，替代 化合物 用作化合物(L)。根据进一步的实施方式，本发明还涉及HAS衍生物，优选HES衍生物，其中甚至更 优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约 500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约 200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15 和甚至更优选3至12的C2 C6取代比
HAS 根据其他的优选实施方式，本发明还涉及上述2种结构的HAS衍生物，优选HES衍 生物，其中，替代 用作化合物(L)。根据进一步的实施方式，本发明还涉及HAS衍生物，优选HES衍生物，其中甚至更 优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约 500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约 200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15 和甚至更优选3至12的C2 C6取代比
根据其他的优选实施方式，本发明还涉及上述2种结构的HAS衍生物，优选HES衍
生物，其中，替代
用作化合物(L)。在上述公开的包含末端基团W2的各HAS衍生物中，W2选自醛基、适当保护的醛基、 酮基和适当保护的酮基，优选选自醛基、半缩醛基、-CH(OH)2、缩醛基、酮基和缩酮基，甚至 更优选选自半缩醛基、-CH (OH) 2、缩醛基、缩酮基和基团-C (0) -R (其中，R选自氢、饱和或不 饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基)。甚 至更优选地，在基团-C (0) -R是酮基的情况下，R选自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更优选 选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。根据本发明的优选方式之一，其中肟连接在下面所描述的步骤C)的反应之前没 有被还原，基团W2优选是未保护的醛基或未保护的酮基，尤其是未保护的醛基。因此，举例来说，本发明还涉及HAS衍生物，优选HES衍生物，其中甚至更优选HES具有大约1至大约 lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大约2至大约 400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约200kDa、尤其是大约50至大约 150kDa 的平均分子量，和 0. 1 至 3、优选 0. 4 至 1. 3 如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、0. 9,1. 0,1. 1、 1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C2 C6 用作化合物(L)。根据本发明另一种优选的实施方式，其中肟连接在下面所描述的步骤C)的反应 之前被还原，基团W2:-如果在还原过程之前作为未保护的醛基或酮基存在的话，在肟连接的还原反应 之前对其进行适当保护；-或者，已经作为用作步骤b)中的起始材料的化合物(L)中的适当保护的醛基或 适当保护的酮基而存在。因此，至于包含还原的肟连接的HAS衍生物，举例来说，本发明还涉及HAS衍生物， 优选HES衍生物，其中甚至更优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约 800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约 300kDa、更优选大约10至大约200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1 至 3、优选 0.4 至 1.3 如 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩尔取代度，和 优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至12的C2 C6取代比
至少一种生物活性剂BA反应。用于步骤c)中的至少一种生物活性剂BA包含至少一个官 能团-NH2。为了这种情况和本发明的目的，BA也表示SH2N-BA'，其中BA'是BA的其余部 分。根据本发明的一种实施方式，从步骤b)获得的具有未保护的醛基或未保护的酮 基(优选未保护的醛基)作为基团W2的HAS衍生物在任选地通过例如超滤、渗析和/或沉 淀的方法适当纯化后，在本发明的步骤c)中与BA反应。根据本发明的另一种实施方式，从步骤b)获得的具有保护的醛基或保护的酮基 (优选保护的醛基)作为基团W2的HAS衍生物在任选地通过例如超滤、渗析和/或沉淀的 方法适当纯化后，适当地进行保护的基团向相应的醛基或酮基的转化，其中产生的HAS衍 生物在与BA反应之前进行适当的纯化和/或分离步骤。向醛基或酮基的转化优选通过酸 催化的水解反应进行。该反应优选在以下条件下进行0到100°C、更优选10到80°C和更 优选20到60°C的温度，优选1到6、更优选1至5、更优选1到4、更优选1至3和甚至更优 选1到小于3的pH值。可以通过本领域的技术人员熟知的方法，例如，通过渗析或超滤，实 现水解反应产物的纯化和缓冲液交换(buffer exchange) 0转化的材料可以作为固体从溶 液中回收，例如通过冷冻干燥。根据本发明的更另外的一种实施方式，从步骤b)获得的已优选经过纯化的HAS衍 生物适当地进行保护基团W2向相应的醛基或酮基的转化，其中产生的HAS衍生物直接与BA 反应，即，不进行包含醛基或酮基的HAS衍生物的独立的合适纯化和/或分离步骤。向醛基 或酮基的转化优选通过酸催化的水解反应进行。该反应优选在以下条件下进行0到10°C、 更优选10到80°C和更优选20到60°C的温度，优选1到6、更优选1至5、更优选1到4、更 优选1至3和甚至更优选1到小于3的pH值。可以直接或在调整pH到与BA反应相容的 值后将水解反应产物与缓冲溶液中的BA混合。根据本发明的更另外的一种可以设想的实施方式，从步骤b)获得的已优选经过 纯化的HAS衍生物直接与BA反应，即，在允许保护的基团向相应的醛基或酮基原位转化而 不需要单独的合适纯化和/或分离步骤和不需要单独的保护基团向相应的醛基或酮基转 化的步骤的反应条件下与BA反应。至于本发明的生物活性物质(BA)，这些化合物可能包含一个或多个用于本发明的 阶段(ii)的偶合的氨基。对于BA本身不包含适于这种偶合的氨基的情况，可以设想在使 BA进行步骤(ii)之前，通过本领域的技术人员已知的方法进行适当的官能化而将至少一 个这样的氨基引入BA。用于本发明中的术语“生物活性物质”(BA)涉及可以影响生物有机体(包括但不 限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人类)的任何物理或生化性质的物质。具体地，用于本 发明中的术语“生物活性物质”涉及用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或动物的疾病或 另外地提高人类或动物的身体或精神健康的物质。活性物质的例子包括但不限于肽、多 肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂类、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、细胞、病 毒、脂质体、微粒(microparticle)和胶束。优选本发明的生物活性物质包含天然的氨基。蛋白质的例子包括但不限于促红细胞生成素(EPO)如重组人EPO(rhEPO)或EPO 模拟物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重组人G-CSF (rhG-CSF)、α -干扰素(IFN- α )、 β-干扰素(IFN-β)或Y-干扰素(IFN-γ)如IFN-α禾口 IFN-β，如重组人IFN-α或
32IFN-β (rhIFN- α 或 rhIFN-β )、白介素例如，IL-1 至 IL-34，如 IL-2 或 IL-3 或 IL-11，如 重组人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII，如因子VIII、因 子VII、因子IX、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因 子XIII、丝氨酸蛋白酶抑制剂如α 1-抗胰蛋白酶(AlAT)、活化蛋白C(APC)、纤溶酶原激活 物如组织型纤溶酶原激活物(tPA)，如人类组织纤溶酶原激活物(hTPA))、AT III如重组 人AT IIKrhAT III)、肌红蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子如表皮生长因子 (EGF)、血小板生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、脑源性生长因子(BDGF)、神经 生长因子(NGF)、B细胞生长(BCGF)、脑源性的神经营养生长因子(BDNF)、睫状神经营养因 子(CNTF)、转化生长因子(如TGF-α或TGF-β )、BMP(骨形态发生蛋白)、生长激素如人 生长激素(hGH)、肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β、生长抑素(somatostatine)、促生长素 (somatotropine)、生长调节素(somatomedine)、血红蛋白、激素或激素原如胰岛素、促性腺 激素、黑色素细胞刺激素(α -MSH)、曲普瑞林(triptorelin)、下丘脑(hypothalamic)激素 (如抗利尿激素(ADH)和催产素以及释放激素和释放抑制激素)、甲状旁腺激素、甲状腺激 素(如甲状腺素、促甲状腺激素、促甲状腺素释放素)、降钙素、胰高血糖素、胰高血糖素样 肽(GLP-1、GLP-2 等)、exendines (如 Exendin-4)、瘦素(Ieptin)、加压素、胃泌素、胰泌素 (secretin)、整联蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH等hmelanoside-刺激激素、脂蛋白和载脂 蛋白(如3 0-8、3 04、3 0-1^)、免疫球蛋白(如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段)、水蛭 素、组织途径抑制剂、植物蛋白(如植物凝集素或蓖麻毒蛋白)、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、抗原 Ε、α-蛋白酶抑制剂、豚草过敏原、黑色素、寡赖氨酸(oligolysine)蛋白、RGD蛋白或这些 蛋白质之一的任选相应的受体；催乳素或其突变体，如G129R (其中，在129位的野生型氨基 酸甘氨酸被精氨酸取代)(这一突变体的商品名称是“LactoVert”)，和这些蛋白质或受体 的功能性衍生物或片段、抗体或抗体片段、或替代的蛋白质支架(scaffold)。用于本发明中 的术语“替代的蛋白质支架”涉及具有类似于特定抗体的结合能力的分子，其中，所述分子 基于替代的非抗体蛋白骨框架。在本文中，可以提及A. Skerra，Τ. Hey等人和H. K. Binz的 文章(见下文的参考文献列表)。活性物质优选选自抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药物、抗利尿药、抗胆碱能药、抗心 律失常药、止吐药、镇咳药、抗癫痫药、抗组胺药、抗真菌药、antisympathotonics、抗血栓 药、雄激素、抗雄激素、雌激素、抗雌激素、抗骨质疏松药(antiosteoporotics)、抗肿瘤药 物、血管扩张药、其他抗高血压药、解热药、镇痛药、抗炎药、β "受体阻滞剂、免疫抑制药和 维生素。活性物质的某些另外的、非限制性的例子是阿仑膦酸(alendronate)、amikazin, 阿替洛尔、脒唑硫嘌呤、西咪替丁、可乐定、替可克肽(cosyntropin)、环丝氨酸、去氨加 压素、双氢麦角胺、多巴酚丁胺、多巴胺、ε-氨基己酸、麦角新碱、艾司洛尔、法莫替丁、 氟卡尼、叶酸、氟胞嘧啶、呋塞米、更昔洛韦、胰高血糖素、hydrazaline、异丙基肾上腺素、 氯胺酮、碘塞罗宁、LHRH、merpatricin,甲基多巴、美托洛尔、新霉素(neomicin)、尼莫 地平、制霉菌素、催产素、酚妥拉明、苯肾上腺素(phenyl印hrine)、普鲁卡因胺、普鲁卡 因、普萘洛尔、利托君、索他洛尔、特布他林、硫胺素、替鲁膦酸(tiludronate)、妥拉唑林 (tolazoline)、甲氧苄氨嘧啶、氨丁三醇、加压素；氨磷汀、胺碘达隆、氨基己酸、对氨基马 尿酸 内(aminohippurate sodium)、M鲁米特、乙酉先丙酸(aminolevulinic acid) >
33氨基水杨酸、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、天冬酰胺酶、蒽环类(anthracycline)、蓓萨罗 丁(bexarotene)、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡麦角林、卡培他滨、卡钼、卡 莫司汀、苯丁酸氮芥(chlorambucil!)、西司他丁钠、顺钼、克拉屈滨(cladribine)、氯曲 膦酸(clodronate)、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、喜树碱、13-顺视黄酸、全反式视黄 酸；达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、去铁胺、地塞米松、双氯芬酸、己烯雌酚、多西他赛、 多柔比星、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非索非那定、氟达拉滨、氟氢可的松、 氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他米特、吉西他滨、肾上腺素、左旋多巴、羟 基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、依立替康、伊曲康唑、戈舍瑞林、来曲唑、甲酰四氢 叶酸、左旋咪唑、赖诺普利(Iisinopril)、左旋甲状腺素钠(lovothyroxine sodium)、洛 莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、重酒石酸间羟胺、甲氨喋呤、甲氧氯普 胺、美西律、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳洛酮、烟碱、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利钼、帕米 膦酸(pamidronate)、喷司他丁、普卡霉素(pilcamycin)、卟吩姆(porfimer)、泼尼松、丙 卡巴胼(procarbazine)、丙氯拉嗪、昂丹司琼、雷替曲塞(raltitrexed)、西罗莫司、链佐 星、他克莫司、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾酮、四氢大麻酚、沙利度 胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、维甲酸、戊柔比星(valrubicin)、长春碱、长春新碱、长 春地辛、长春瑞滨、多拉司琼、格拉司琼；福莫特罗、氟替卡松、亮丙瑞林(leuprolide)、咪 达唑仑、阿普唑仑、两性霉素B、鬼臼毒素(podophylotoxins)、核苷类抗病毒药物、芳酰基 腙类、舒马曲坦；大环内酯类抗生素如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素 (clarithromycin)、环酯红霉素(davercin)、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺 方 霉素(spiromycin)、麦迪霉素、柱晶白霉素(Ieucomycin)、美欧卡霉素(miocamycin)、 罗他霉素、andazithromycin和swinolide A ；氟喹诺酮类药物如环丙沙星、氧氟沙星、左 氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星(moxifloxicin)、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙 星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普 卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖苷类如庆大霉素、奈替米星、 草履虫素(paramecin)、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素、万古霉素、替考拉 宁(teicoplanin)、雷莫拉宁(rampolanin)、麦地拉宁、粘菌素(colistin)、达托霉素、短杆 菌肽、甲磺酸粘菌素(colistimethate)；多粘菌素类如多粘菌素乙(polymixin B)、卷曲霉 素、杆菌肽、青霉烯类；青霉素类包括青霉素敏感剂，如青霉素G、青霉素V ；抗青霉素酶剂， 如甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴 性微生物活性剂，如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、cillin及galampicillin ；抗假单胞 菌青霉素，如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素，如头孢泊肟、 头孢丙烯、头孢布坦(ceftbuten)、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头 孢拉定(c^phradrine)、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢利定、头孢克洛、头孢羟氨苄、 头孢来星(c印haloglycin)、头孢氨呋肟、头孢雷特(ceforamide)、头孢噻肟、头孢曲秦、氰 乙酰头孢菌素(cephacetrile)、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢 美唑(cefinetazole)、头孢他啶、氯碳头孢和拉氧头孢，及单环β-内酰胺(monobactam) 类，如氨曲南；及碳青霉烯类，如亚胺培南、美罗培南、喷他脒羟乙基磺酸盐、硫酸沙丁胺醇、 利多卡因、奥西那林硫酸盐、丙酸倍氯米松(beclomethasonedipr印ionate)、曲安西龙乙酰 胺、布地奈德丙酮化合物、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠和酒石酸麦角胺；紫杉烷类、如紫杉醇；SN-38和tyrphostines。因此，技术人员已知为“小分子”的化合物根据本发明也是可以想象的生物活性物 质。用于本发明中的术语“小分子”涉及蛋白质和寡核苷酸之外的生物活性化合物，但是， 包括最多50个氨基酸的肽。这种小分子典型的例子如前述段落所列。寡核苷酸的例子是适体(aptamer)。作为可以想象的生物活性物质另外提到的是 肽核酸(PNA)。在一个特别优选的实施方式中，用于步骤C)中的至少一种生物活性剂BA选自肽、 多肽、蛋白质和多肽或蛋白质的功能性衍生物、片段或模拟物。优选地，肽选自促红细胞生成素(EPO)如重组人EPO (rhEPO)或EPO模拟 物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重组人G-CSF (rhG-CSF)、α -干扰素(IFN- α )、 β-干扰素(IFN-β)或Y-干扰素(IFN-γ)如IFN-α禾口 IFN-β，如重组人IFN-α或 IFN- β (rhIFN- α 或 rhIFN- β )、白介素例如，IL-I 至 IL-18，如 IL-2 或 IL-3，如重组人 IL-2 或IL-3 (rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子ΙΙ-ΧΙΙΙ，如因子VIII、因子VII、因子IX、 因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、α 1-抗 胰蛋白酶(AlAT)、活化蛋白C(APC)、纤溶酶原激活物如组织型纤溶酶原激活物(tPA)，如人 类组织纤溶酶原激活物(hTPA))、AT III如重组人AT III (rhAT III)、肌红蛋白、白蛋白 如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)、成纤维 细胞生长因子(FGF)、脑源性生长因子(BDGF)、神经生长因子(NGF)、B细胞生长(BCGF)、 脑源性的神经营养生长因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因子(如TGF-α 或TGF_i3)、BMP(骨形态发生蛋白)、生长激素如人生长激素、肿瘤坏死因子(如TNF-α或 TNF-β)、生长抑素、促生长素、生长调节素、血红蛋白、激素或激素原(如胰岛素、促性腺激 素、黑色素细胞刺激素(α-MSH))、曲普瑞林、下丘脑激素(如抗利尿激素(ADH)和催产素以 及释放激素和释放抑制激素)、甲状旁腺激素、甲状腺激素(如甲状腺素、促甲状腺激素、促 甲状腺素释放素)、降钙素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2等)jxendines (如 Exendin-4)、瘦素(Ieptin)、加压素、胃泌素、胰泌素、整联蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH 等)、melanoside-刺激激素、脂蛋白和载脂蛋白(如apo_B、apo-E、apo-La)、免疫球蛋白 (如IgG, IgE, IgM, IgA和IgD及其片段)、水蛭素、组织途径抑制剂、植物蛋白(如植物凝 集素或蓖麻毒蛋白)、蜂毒、蛇毒、免疫毒素、抗原Ε、α -蛋白酶抑制剂、豚草过敏原、黑色 素、寡赖氨酸蛋白、RGD蛋白或这些蛋白质之一的任选相应的受体；和这些蛋白质或受体的 功能性衍生物或片段。多肽甚至更优选选自促红细胞生成素(EPO)如重组人EPO(rhEPO)、集落刺激 因子(CSF)如G-CSF，如重组人G-CSF (rhG-CSF)、α 1-抗胰蛋白酶(AlAT)、因子IX、 α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)或Y-干扰素(IFN-γ )如重组人IFN-α或 IFN- β (rhIFN- α 或 rhIFN- β )，尤其是 AlAT、因子 IX、IFN- a、G-CSF 和 ΕΡ0。在优选的实施方式中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物在步骤C)中通过在步骤 b)通过化合物(L)引入羟烷基淀粉衍生物中的官能团W2与该至少一个生物活性剂的氨基 反应，官能团W2选自醛基或酮基，优选选自-CH = 0、半缩醛基、-CH(OH)2和基团-C(O)-R(其 中，R选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或 未取代的芳基)。在优选的实施方式中，在基团-C(O)-R是酮基的情况下，残基R选自C1-C6烷基和C6-C14芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基和叔丁基。在一个实施方式中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物在步骤C)中通过生物活性 剂的至少一个官能团-NH2与在步骤b)通过化合物(L)引入羟烷基淀粉衍生物中的选自醛 基或酮基，优选选自-CH = 0、半缩醛基、-CH(OH)2和基团-C(O)-R的官能团W2反应，其中， 在步骤c)中使用的至少一个生物活性剂中包含的至少一个官能团-NH2是多肽或蛋白质的 N-末端氨基。在优选的实施方式中，步骤C)在还原胺化的反应条件下进行。还原胺化的反应条 件是本领域技术人员已知的。特别地，在这些条件下，通过选自-CH = 0、半缩醛基、-CH(OH)2 和基团-C(O)-R的官能团W2与生物活性剂BA的-NH2基团的反应获得的基团-CH = N-还 原为-CH2-NH-O在一种替代的实施方式中，步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物或步骤b)获得的羟 烷基淀粉衍生物都不在相应的步骤后进行还原，只有步骤c)的反应在还原条件下进行，更 优选地，其中，步骤c)用适当的还原剂进行，所述适当的还原剂如NaBH(OAc)3、硼氢化钠、 氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼烷络合物、N-乙基二异 丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络 合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH3或 NaBH40因此，本发明还涉及HAS衍生物(优选HES衍生物)，其中甚至更优选HES具有大 约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、更优选大 约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约200kDa、尤其是大 约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0.9,1. 0,1. 1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更优选3至 12的C2 C6取代比 和/ 或
HAS'
OH
2 CH
\o
(H和/ 或
HASf
OH
R-4
I
O
OR, H
-O-
-N—C*"“Rg CH=N-H H,
-BA'
OwwwRj* O
1
CH
_ A.
CH
Ir
ι
■
NN _
-BA'
-O_R:~O-
-N=C-H
-Rr—C-N-BA*
9 H, H优选是，除其他外，本发明涉及HAS衍生物(优选HES衍生物)，其中甚至更优选 HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约500kDa、 更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约200kDa、 尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、0. 5、0. 6、 0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1.2或1.3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15和甚至更 优选3至12的(2 C6取代比
HAS'
OR3 H
C=N-和/ 或
37HAS
OR, H2 H
CH
導
H 根据其他优选的实施方式，本发明还涉及上述4种结构的HAS衍生物，优选HES衍 生物，其中，替代
用作化合物(L)。
根据进一步的实施方式，本发明还涉及HAS衍生物(优选HES衍生物)，其中甚至更优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约 500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约 200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15 和甚至更优选3至12的C2 C6取代比
和/ 或 和/ 或 禾P/或 根据其他优选的实施方式，本发明还涉及上述4种结构的HAS衍生物，优选HES衍 生物，其中，替代 化合物 用作化合物(L)。根据进一步的实施方式，本发明还涉及HAS衍生物(优选HES衍生物)，其中甚至 更优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至大约 500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至大约 200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如0. 4、 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2到15 和甚至更优选3至12的C2 C6取代比 和/ 或 和/ 或 在上述确定的各种含有BA'的HAS衍生物(优选HES衍生物)中，BA'优选选自 IFN- α ‘ ,G-CSF' ,EPO' ,AlAT'和因子 IX'，尤其是 IFN-α'。因此，根据特别优选的实施方式，本发明涉及HAS衍生物(优选HES衍生物)，其中 甚至更优选HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大约1至 大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约10至 大约200kDa、尤其是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至1. 3如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩尔取代度，和优选 2 至 20、更优选 2 至Ij 15和甚至更优选3至12的C2 C6取代比和/ 或
0 -
NH
1,
CH
H H
C=N-IFNaIpha'和/ 或
HAS,.
—O^^-^O^s/^O"·^=日h~-C-N-IFNaIpha'尤其是
HAS'
ha' P al
IFN
H"'
CH

CH
I
NH
I
O
O --
-N
C在优选的实施方式中，优选选自IFN-α、G-CSF, ΕΡ0、AlAT和IX因子，尤其是 IFN-α的生物活性剂BA溶于水性介质中，优选缓冲液，尤其是醋酸钠缓冲液。水性介质可 能另外含有添加剂，如洗涤剂和/或分散剂，特别是选自SDS、Chaps、Tween 20, Tween 80、 Nonidet P-40和Triton X 100。如果使用洗涤剂和/或分散剂，其优选以大约0. 05重量％ 至大约3重量％，优选大约0. 5重量％的量存在。生物活性剂BA的水溶液优选具有大约为3至大约9、尤其是大约4至大约7的pH值。在一个实施方式中，将步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物添加到如上所述的生物 活性剂BA的水溶液中。优选地，随后加入合适的还原剂，如NaBH(OAc)3、硼氢化钠、氰基硼 氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-( 二甲基氨基)吡啶硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺
42硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二 甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合物)，优选NaCNBH3或NaBH4。在替代的实施方式中，可以将步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物加入任选的 水溶液中，然后加入生物活性剂BA，优选蛋白质。优选地，随后加入合适的还原剂，如 NaBH(OAc)3、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4-( 二甲基氨基)-吡啶硼 烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络合 物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络合 物)，优选 NaCNBH3 或 NaBH4。在步骤c)中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物与生物活性剂BA(优选选自 IFN- α、G-CSF、EP0、因子IX和A1AT，尤其是IFN- α )的反应优选在大约3至大约7，尤其是 大约4至大约6的ρΗ值下进行。在步骤c)中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物与生物活性剂BA(优选选自 IFN-α、G-CSF、ΕΡ0、AlAT和因子IX，尤其是IFN- α )的反应优选在大约0°C至大约25°C, 尤其是大约0°C或大约5°C或大约10°C或大约21°C的温度下进行。步骤c)的反应时间取决于温度、步骤b)获得的衍生物HAS (尤其是HES)与生物 活性剂BA的比例及HAS衍生物和生物活性剂BA的绝对浓度。基于步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物的重均分子量(Mw)，在步骤C)中，步骤b) 获得的羟烷基淀粉衍生物与生物活性剂BA的摩尔比一般为大约0.1 1至200 1，优选 大约1 1到大约100 1当量，优选摩尔比为大约1 1到大约40 1，特别地摩尔比为 大约1 1到大约20 1，优选在生物活性剂选自IFN-α、G-CSF、EP0、A1AT和因子IX，尤 其是IFN-α的情况下。在特别优选的实施方式中，用于步骤C)中的在步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物 的浓度高于大约10% m/v，尤其是高于大约15% m/v。在优选的实施方式中，生物活性剂BA (尤其是选自IFN-a、G_CSF、EP0、A1AT和因 子IX，特别是IFN-a )的浓度高于大约1毫克/毫升，优选高于大约2毫克/毫升，尤其高 于大约4毫克/毫升。可以用常规方法分离步骤C)获得的反应产物，如液相色谱，例如，离子交换色谱 法、SEC、HPLC或任何其他方法。反应可以在纯化之前通过稀释、降低反应温度、加入伯氨基 化合物(例如，氨基酸)或这些方法的组合来停止。在一个特别优选的实施方式中，在步骤a)中，未氧化的羟烷基淀粉(优选羟乙基 淀粉)在羟烷基淀粉的一个还原末端通过一个官能团-O-NH2与化合物(D)
H2hr0s^"0^^0、NH2反应，并且在步骤b)中，步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物通过官能团-O-NH2与 化合物(L)
43
的一个官能团-CH = 0反应。 在步骤c)中，上述步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物优选与选自IFN-α、G-CSF, EPO、因子IX和AlAT，尤其是IFN-α的生物活性剂BA反应，其中，在步骤c)中，步骤b)获 得的羟烷基淀粉衍生物在还原胺化条件下与IFN-α反应，尤其是在合适的还原剂存在下， 如NaBH (OAc) 3、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、有机硼烷络合化合物(如4- ( 二甲基氨基)-吡啶 硼烷络合物、N-乙基二异丙基胺硼烷络合物、N-乙基吗啉硼烷络合物、N-甲基吗啉硼烷络 合物、N-苯基吗啉硼烷络合物、二甲基吡啶硼烷络合物、三乙胺硼烷络合物或三甲胺硼烷络 合物)，优选NaCNBH3或NaBH4。已令人惊讶地发现，当进行上述方法时，尤其是在对于上述的步骤c)的优选条件 下，可以高产率(如高达80%的产率，如70%至80%的范围内)获得步骤b)获得的羟烷基 淀粉衍生物与生物活性剂BA的反应产物。V.药物组合物和用涂本发明还涉及包含治疗有效量的可通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物的药 物组合物，尤其是当所述方法包括步骤a)至步骤c)时，优选其中生物活性剂BA优选选自 IFN-α、G-CSF、EP0，尤其是IFN-α。药物组合物可以包含通常的药用赋形剂。本文所用的“治疗有效量”是指对于给定的条件和施用方案提供治疗效果的量。至于如上所述包含含有BA'的HAS衍生物的本发明药物组合物，HAS衍生物可 与药物赋形剂组合使用。一般情况下，HAS衍生物为可与适当的固体或液体形式的药物赋 形剂结合的固体形式。作为赋形剂，碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、 缓冲剂、酸、碱及其组合可能被提及。碳水化合物，如糖、衍生的(derivatized)糖(如糖 醇(alditol)、醛糖酸(aldonic acid)、酯化的糖和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具 体的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨 糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如棉子糖(raffmose)、松三糖、麦芽 糖糊精、葡聚糖、淀粉等；及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇 (葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇(pyranosyl sorbitol)、肌醇等。赋形剂还可以包括无机 盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组 合。本发明的药物组合物还可以包含用于防止或阻止微生物生长的抗菌剂，如苯扎氯铵、 苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol及其 组合。本发明的药物组合物还可以包含抗氧化剂，例如，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟 基茴香醚(butylatedhydroxyanisole)、丁基化轻氧甲苯(butylated hydroxytoluene) > 次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸钠(sodiumformaldehyde sulfoxylate)、焦亚硫酸钠及其组合。本发明的药物组合物根据还可以包含表面活性剂，例 如，聚山梨醇酯(polysorbate)或pluronics山梨聚糖酯；脂质，如磷脂(如卵磷脂和其他
磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺酸)和脂肪酸酯)；类固醇类如胆固醇；和螯合剂如EDTA或锌。本发明的药物组合物还可以包含酸或碱，如盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、 三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合，和/或氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、 氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及 其组合。一般来说，赋形剂在本发明的药物组合物中以0. 001重量％到99. 99重量％、优选 0. 1重量％到99. 9重量％的量存在，每种情况下基于药物组合物的总重量计算。本发明的组合物优选用于适于皮下或静脉或肠胃外注射的制剂。为此，适当的赋 形剂和载体是，例如，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、谷氨酸钠、甘露醇、山梨醇、聚山梨 醇酯80、HSA和注射用水。可以每周施用组合物3次，优选每周2次，更优选每周1次，最优 选每两周1次。优选地，药物组合物以以下的量施用0. 01微克/千克-6毫克/千克患者体重， 优选0. 01-10微克/千克患者体重，更优选0. 1-5微克/千克，尤其是0. 1-1微克/千克或 0. 2-0. 9微克/千克，最优选0. 3-0. 7微克/千克，和最优选0. 4-0. 6微克/千克体重。一般来说，优选每剂施用10微克至6毫克，优选10微克至200微克，优选15微克 至100微克。本发明还涉及作为治疗剂或预防剂的可通过上述方法(尤其是包括步骤a)至c)) 获得的羟烷基淀粉衍生物。本发明还涉及可通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备治疗选自癌症 (如毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤和/或AIDS相关卡波济氏肉瘤)、尖锐湿 疣、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，优选慢性乙型肝炎和丙型肝炎的疾病的药物的用途，所 述方法尤其是包括步骤a)至步骤c)，且步骤c)中生物活性剂BA是IFN- α。本发明还涉及可通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备治疗选自癌症 患者例如接受骨髓抑制化疗的癌症患者、接受诱导或巩固化疗的患有急性髓性白血病的患 者和/或接受骨髓移植的癌症患者、进行外周血祖细胞收集和治疗的患者和患有严重慢性 中性粒细胞减少症的患者的患者中的疾病的药物的用途，所述方法尤其是包括步骤a)至 步骤c)，且步骤c)中生物活性剂BA是G-CSF。本发明还涉及可通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备治疗贫血如慢 性肾衰竭患者、齐多夫定治疗的HIV感染患者、化疗的癌症患者的贫血、或用于减少手术患 者的异体输血的药物的用途，所述方法尤其是包括步骤a)至步骤c)，且步骤c)中生物活性 剂BA是EPO。本发明还涉及可通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备预防或治疗癌 症(尤其是乳腺癌)的药物的用途，所述方法尤其是包括步骤a)至步骤c)，且步骤c)中生 物活性剂BA是促乳素或其变异体。本发明还涉及通过施用治疗有效量的可根据上述方法获得的羟烷基淀粉偶联物 治疗选自以下患者的疾病的方法癌症患者如接受骨髓抑制性化疗的癌症患者、接受诱导 或巩固化疗的患有急性髓性白血病的患者和/或接受骨髓移植的癌症患者、进行外周血祖 细胞收集和治疗的患者和患有严重慢性中性粒细胞减少症的患者；贫血如慢性肾衰竭患 者、齐多夫定治疗的HIV感染患者、化疗的癌症患者的贫血；或用于减少手术患者的异体输 血；和癌症、尤其是乳腺癌。本发明还参照以下非限制的实施例更详细地进行描述
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图1显示通过SDS凝胶电泳对粗制蛋白60/1. 0偶联物的分析。道 X:Mark 12MW Standard (Invitrogen, Karlsruhe, D)从顶部到底部以kDa计的分子量标志物:200、116、97、66、55、37、31、22、14、6、
3· 5、2· 5 ο 14. 3kDa ο 14. 3kDa ο图3显示根据实施例6. 1，Intron A对于NIH标准品的增殖活性的曲线图。 图4显示根据实施例6. 2，HES-IFN- α的体外活性的曲线图。 图5显示根据实施例7. 2，HES-IFN-α的半衰期的曲线图。 图6显示通过SDS凝胶电泳对根据实施例8的HES-G-CSF偶联反应的分析。 道 M:Mark 12MW Standard(Invitrogen, Karlsruhe, D)从顶部到底部以kDa计的分子量标志物:200、116、97、66、55、37、31、22、14、6、
3· 5、2· 5 ο道1 :10微克反应混合物HES60/0. 7-G-CSF 道2 :10微克反应混合物HES60/1. O-G-CSF 道3 :10微克反应混合物HES100/1. O-G-CSF道4 :10微克反应混合物HES100/1. 3-G-CSF 道 5 :5 微克 rh-metG-CSF图7显示通过SDS凝胶电泳对根据实施例9获得的粗制蛋白-HES60/1. 3偶联物 的分析。
道 A :3. 7 微克 IFN-α。 道B :Q4的合成。 道C :Q5的合成。
道 Y =Roti -Mark STANDARD (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, D) 从顶部到底部的分子量标志物200kDa、119kDa、66kDa、43kDa、29kDa、20kDa、
道D :Q8的合成。 道E :Q9的合成。 道 F :10 微克 IFN-α。 道G :5微克IFN-α。 道 H :2. 5 微克 IFN-α。 道I :1微克IFN-α。
图2显示通过SDS凝胶电泳对粗制蛋白-HES 100/1. 0偶联物的分析。 道 X=Roti -Mark STANDARD(Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, D) 从顶部到底部的分子量标志物200kDa、119kDa、66kDa、43kDa、29kDa、20kDa、
道A :R83的合成。 道B :R84的合成。 道C :R85的合成。
道X :Roti _Mark STANDARD (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karl sruhe, D)从顶部到底部以kDa计的分子量标志物245、123、77、42、30、25. 4、17。道A 10微克反应混合物HES60/1. 3-EP0实验部分HES和HES-衍生物的规格Mw 重均分子量Mn 数均分子量通过凝胶渗透色谱法结合光散射检测器测定Mw和Mn。MS =摩尔取代度HES的每个脱水葡萄糖残基的平均羟乙基取代基数目在HES分子全部水解后，通过气相色谱法测定MS。没有通过实验确定醛基 (Aldehydo)-HES的MS值。相反，给出各HES起始原料的MS值。假定在衍生化过程中，MS 的值不受影响。HES 60/1. 0 HES 60/1. 0 (Supramol Parenteral Products GmbH, Rosbach)Mw :62kDaMn :35kDaMS: 1.01醛基-HES-60/1. 0 (如实施例1. 2b所述合成)Mw :63kDaMn:35kDaMS: 1.01HES100/1. 0 HES 100/1. 0 (Supramol Parenteral Products GmbH, Rosbach)Mw :93kDaMn :4IkDaMS :1. 01醛基-HES 100/1. 0 (如实施例1. 2a所述合成)Mw :92kDaMn 4IkDaMS: 1· 01IFN- α 规格干扰素α _2b，其在欧洲药典中有描述干扰素α -2b的浓缩液，欧洲药典，01/2002 1110实施例1 醛基-HES衍生物60/1. 0和100/1. 0的合成实施例1. 1 由 HES 60/1. 0 和 100/1. 0 制备羟氨基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0将 HES A(B ^,MW = C kDa,Lot D，供应商 Supramol ParenteralProducts GmbH, Rosbach, D)Ampuva /K (Fresenius-Kabi, BadHomburg, D) 白勺中夕夜(F 毫升，0.IM的醋酸钠，ρΗ 5.2)中，并加入0-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]-羟胺(G克， 如Boturyn等人Tetrahedron 53(1997)第5485-5492页中所述以2步骤用市售起始材料
47制备)。在室温下搅拌H小时后，将反应混合物加入2-丙醇(I毫升)中。在4°C通过离心 收集沉淀的产物。将粗制产物溶于水(J毫升)中，相对于Milli-Q水(SnakeSkin渗析管， IOkDa MWCO, Perbio SciencesDeutschland GmbH, Bonn, D)渗析 50 小时，并冻干。分离的
产物的产率为L%。
表1 羟氨基-HES衍生物的合成实施例1. 2 由羟氨基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0 制备醛基-HES 60/1. 0 和 100/1. 0将羟氨基-HES A(B克，丽=C kDa，如实施例D所述制备)溶解于溶解在E毫 升 DMF(月太合成级，Biosolve, Valkenswaard, NL)中，并力口入对駄酸(F 克，Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) 0在室温下振摇G小时后，将反应混合物慢慢加入1 1 的丙酮和乙醇混合物(H毫升，ν/ν)中。在4°C通过离心收集沉淀的产物，再溶于DMF(Ε毫 升)中，并用如上所述的丙酮和乙醇混合物(H毫升，ν/ν)沉淀。离心后，沉淀物溶于水(Ε 毫升，Milli-Q)中，相对于 Milli-Q 水(SnakeSkin 渗析管，IOkDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D)渗析I小时，并冻干。分离的产物的产率为M%。 表2 醛基-HES衍生物的合成实施例2HES (60/1.0)-IFN-α偶联物的合成实施例2. IHES (60/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :Q4)的合成缓冲液交换在20°C下，在 Amicon Ultra-4 浓缩器(Millipore, 5kDa MWC0)中以 7. 500xg 离心 IFN- α溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)20分钟。通过用反应缓冲液(0. IM的 醋酸钠，ρΗ4. 0)稀释残留溶液至5毫升并如所述的离心16分钟重复洗涤过程3次。用反 应缓冲液调整最终体积至1. 15毫升(计算的浓度为8. 7毫克/毫升)。蛋白质浓度没有通 过实验检测。偶联作用将醛基-HES 60/1. 0(623毫克，如实施例1.2b所述制备，20当量)溶于蛋白质溶 液(1.15毫升，8.7毫克/毫升，如上所述制备)中，并用移液管充分混合该混合物。在冰 上孵育15分钟后，加入预冷却的氰基硼氢化钠溶液(40微升，在反应缓冲液中为1. 24M，Fluka, Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, D)，并在 0°C下孵育反应混合物 6 小时。 加入氰基硼氢化钠时观察到沉淀。通过加入3毫升反应缓冲液和2. 97毫升含有350mM的 赖氨酸(Merck，Darmstadt，D)的0. IM醋酸钠来终止反应。用反应缓冲液稀释混合物至10 毫升，并在纯化前在冰上存储过夜。通过SDS-PAGE分析反应混合物(见图1)。实施例2. 2HES (60/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :Q5)的合成缓冲液交换在20°C下，在 Amicon Ultra-4 浓缩器(Millipore, 5kDa MWC0)中，以 7. 500xg 离 心IFN- α的溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)20分钟。通过用反应缓冲液(0. IM 的醋酸钠，ΡΗ4. 0)稀释残留溶液至5毫升并如上所述离心16分钟，重复洗涤过程3次。用 反应缓冲液调整最终体积至0. 926毫升(计算的浓度为10. 8毫克/毫升)。该蛋白质浓度 没有经实验检验。偶联作用将醛基-HES 60/1. 0(309毫克，如实施例1.2b所述制备，10当量)溶于蛋白质溶 液(0.926毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制备)中，并用移液管充分混合该混合物。加入 预冷却的氰基硼氢化钠溶液(20. 3微升，在反应缓冲液中为1.24M，Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,D)，并在21°C下孵育反应混合物2小时。通过加入3毫升反应 缓冲液和1. 5毫升含有350mM赖氨酸(Merck，Darmstadt，D)的0. IM的醋酸钠来终止反应。 用反应缓冲液稀释混合物至10毫升，并在纯化前在冰上存储过夜。通过SDS-PAGE分析反 应混合物(见图1)。实施例2. 3HES (60/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :Q8)的合成缓冲液交换在20°C 下，在 Vivaspin 6mL CONCENTRATOR (Viva Science, 5kDa MWCO，Hannover, D)中，以3. 939xg离心IFN-α的溶液(5. 32毫升，10毫克，1. 88毫克/毫升)45分钟。通 过用反应缓冲液(0. IM的醋酸钠，pH 4.0)稀释残留溶液至6毫升并如上所述离心40分钟， 重复洗涤过程3次。用反应缓冲液调整最终体积至1. 0毫升(计算的浓度为10毫克/毫 升)。该蛋白质浓度没有经实验检验。偶联作用将醛基-HES 60/1. 0(232毫克，如实施例1.2b所述制备，7. 5当量)溶于蛋白质溶 液(1.0毫升，10毫克/毫升，如上所述制备)中，并用移液管充分混合该混合物。在冰上孵 育15分钟后，加入预冷却的氰基硼氢化钠溶液(100微升，在反应缓冲液中200mM，Fluka, Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, D)，并在 10°C下孵育反应混合物 7 小时。用 100当量的赖氨酸(1. 95毫升，在反应缓冲液中的0. 2M盐酸赖氨酸(Fluka Biochemica, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D), pH 4.0)和IOmM甲硫氨酸(650微升，在反应缓冲液中的 0. IM 甲硫氨酸(FlukaBiochemica，Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D)，pH 4. 1)终止反应。 用反应缓冲液稀释混合物至6. 5毫升，并在纯化前在冰上存储过夜。通过SDS-PAGE分析反 应混合物(见图1)。实施例2. 4HES (60/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :Q9)的合成缓冲液交换如实施例2. 3 所述，用 Vivaspin 6mL CONCENTRATOR交换 IFN- α 溶液(5. 32 毫升，
4910毫克，1.88毫克/毫升)的缓冲液为0. IM的醋酸钠(pH 4. 0)，并在0°C下，在浓缩器中 孵育该溶液15分钟。偶联作用加入醛基-HES 60/1. 0溶液(155毫克，如实施例1. 2b所述制备，在5mL反应缓冲 液(0. IM的醋酸钠，pH 4. 0)中为5当量，在冰上预冷却)，并在10°C下以3. 939xg离心混 合物2. 5小时。向大约700微升反应混合物的剩余体积中加入预冷却的氰基硼氢化钠溶液 (5 毫升，在反应缓冲液中 20mM，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，D)。在 10°C下以3. 939xg离心溶液18小时，并在纯化前在冰上存储。通过SDS-PAGE分析反应混 合物(见图1)。实施例3HES (100/1.0)-IFN-α偶联物的合成实施例3. IHES (100/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :R83)的合成将IFN- α的原液(19. 68毫升，37毫克，1. 88毫克/毫升)等分到两个Vivaspin 15R浓缩器(Viva Science, 5kDa MWCO, Hannover, D)中，各用反应缓冲液(0. IM的醋酸钠 缓冲液，PH 4. 0，用 Ampuwa 水(Fresenius-Kabi，Bad Homburg, D)制备)稀释至 18 毫升， 并在21°C下以3. 939xg离心36分钟。通过用反应缓冲液稀释残留溶液至18毫升并如所述 离心35分钟，重复洗涤过程3次。用反应缓冲液调整合并的蛋白质溶液的体积至3. 47毫 升(计算的蛋白质浓度为10. 8毫克/毫升)。该蛋白质浓度没有经实验检验。将醛基-HES 100/1. 0 (1. 156克，如实施例1. 2a所述制备，12当量)溶于反应缓 冲液(1.628mL)中，并加入蛋白质溶液(1. 736毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制备)。在 0°C下孵育30分钟后，加入预冷却的氰基硼氢化钠溶液(100微升，在反应缓冲液中为58. 2 毫克 / 毫升，Fluka，Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，并充分混合该混合物。 加入NaCNBH3时形成少量细沉淀。在混合过程中溶液澄清，用反应缓冲液调整其体积至4. 6 毫升，并在0°C孵育该混合物18小时。通过SDS-PAGE分析反应混合物(见图2)。实施例3. 2HES (100/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :R84)的合成将醛基-HES 100/1. 0(462毫克，如实施例1.2a所述制备，4. 8当量)溶于蛋白质 溶液(1.736毫升，10. 8毫克/毫升，如实施例3.1所述制备)中。在0°C下孵育30分钟 后，加入预冷却的氰基硼氢化钠溶液(50微升，在反应缓冲液中为58. 2毫克/毫升，Fluka， Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen，D)，并充分混合该混合物。加入 NaCNBH3 时形 成少量微细的沉淀物。在混合过程中溶液澄清，用反应缓冲液调整其体积至2. 3毫升，并在 0°C孵育该混合物17. 5小时。通过SDS-PAGE分析反应混合物(见图2)。实施例3. 3HES (100/1. 0) -IFN- α 偶联物(Lot :R85)的合成将IFN-α原液(10. 63毫升，20毫克，1. 88毫克/毫升)用反应缓冲液(0. IM的 醋酸钠缓冲液，PH 4.0，用 Ampuwa 水(Fresenius_Kabi，BadHomburg，D)制备)稀释到 18 毫 升，并在 21°C下以 3. 939xg 在 Vivaspinl5R 浓缩器(Viva Science, 5kDa MWCO, Hannover, D)中离心40分钟。通过用反应缓冲液稀释残留溶液至18毫升并如所述离心35分钟，重 复洗涤过程3次。用反应缓冲液调整蛋白质溶液的体积至1. 85毫升(计算的蛋白质浓度 为10. 8毫克/毫升)，40微升用反应缓冲液将稀释至1毫升，并以反应缓冲液作为对照在 279nm进行测量。用18000的摩尔消光系数和OD279 (0. 382)计算蛋白质的量为18. 9毫克， 得到蛋白质回收率为95%。
50
将HES-醛100/1. 0(616毫克，如实施例1.2a所述制备，6当量)溶于蛋白质溶液 (1.85毫升，10. 8毫克/毫升，如上所述制备)中。加入氰基硼氢化钠(3. 2毫克，Fluka， Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，并充分混合该混合物。加入 NaCNBH3 时形成 少量微细的沉淀物。在混合过程中溶液澄清，并在21°C孵育混合物2小时。通过SDS-PAGE 分析反应混合物(见图2)。实施例4HES-IFN- α偶联物的SDS PAGE分析对从实施例2和实施例3获得的反应混合物的含有10微克蛋白质的样品(由 各反应混合物中的计算蛋白浓度确定相应的体积)进行研究。XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)和 ConsortE143 电源(CONSORTnv，Turnhout, B)用 于SDS凝胶电泳。根据生产商的说明书，使用4-12% Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS 电泳缓冲液(两个都来自 Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)。实施例5IFN- α -HES偶联物的纯化5. IHES-IFN- α 的纯化在室温下，使用人KTA explorer 10设备进行全部样品的纯化。在使用的前一 天，用IM NaOH以1毫升/分钟的流速对含有10毫升Q-S印harose Fast Flow的柱进行处 理，再生，然后用缓冲液A(20mMTriS/HCl，pH 8. 0)平衡。在无菌条件下，用缓冲液以1 8 将样品稀释，并通过使用样品泵以1. 5毫升/分钟的流速应用。在用25毫升的缓冲液A洗 涤样品泵后，进一步以1. 5毫升/分钟的流速用30毫升缓冲液A清洗柱子。通过以1. 2毫 升/分钟的流速使用0% -100%的线性梯度的超过60毫升的缓冲液B (在20mM的Tris/ HCl中0.3M NaCl,pH 8.0)和用20毫升缓冲液B进行等强度运行来进行洗脱。通过以1. 2 毫升/分钟的流速使用30毫升的缓冲液C(在20mM的Tris/HCl中为1. 5MNaCl，pH 8. 0)、 接着是10毫升缓冲液B对柱进行再生。通过使用50毫升缓冲液A和1. 5毫升/分钟的流 速为下次运行进行再平衡。5. 2材料与方法设备AiCTA explorer 10 (Amer sham Pharmacia Biotech)，具有M P-903混合器M-925，带有0. 6毫升的室监测器UV-900，带有10毫米流动池监测器pH/C-900泵P-95O (样品泵)软件Unicorn 版本 3. 21ft =Amersham Biosciences XK 16/20柱材料Q_S印haroseFast Flow，编号 17-0510-01，批号 307552柱体积10毫升5. 2. 1 方法缓冲液A :20mM Tris/HCl, pH 8. 0缓冲液B 在 20mM Tris/HCl 中的 0. 3M NaCl，pH 8. 0缓冲液C 在 20mM Tris/HCl 中的 1. 5M NaCl，pH 8. 0体积 步骤缓冲液流速
25毫；升平衡100%缓冲液A1. 5毫升/分钟
加载样品2-3毫升/分钟
25毫；升洗涤样品泵100%缓冲液A3. 0毫升/分钟
30毫；升洗出未结合的样品100%缓冲液A1. 5毫升/分钟
开始分级分离
60毫；升洗脱，线性梯度0-100%缓冲液B1. 2 I 升/分钟
20毫；升洗脱，等强度100%缓冲液B1. 2 I 升/分钟
30毫；升再生100%缓冲液C1. 2毫升/分钟
10毫；升再生100%缓冲液B1. 2毫升/分钟
停止分级分离
50毫；升再平衡100%缓冲液A1. 5毫升/分钟
检测:280nm，260nm，220nm
电导率
分级分离:1，5毫升级分
5. 2. 2方法
缓冲液A:10mM Tris/HCl, pH 8.0
缓冲液B在 20mM Tris/HCl 中的 0. 3M NaCl，pH 8.0
缓冲液C在 20mM Tris/HCl 中的 1. 5M NaCl，pH 8.0
体积步骤缓冲液流速
25毫；升平衡100%缓冲液A1. 5 I 升/分钟
加载样品2. 0毫升/分钟
15毫；升洗涤样品泵100%缓冲液A3. 0 I 升/分钟
30毫；升洗出未结合的样品100%缓冲液A1. 5 I 升/分钟
开始分级分离
60毫；升洗脱，线性梯度0-100%缓冲液B1. 2毫升/分钟
20毫；升洗脱，等强度100%缓冲液B1. 2毫升/分钟
30毫；升再生100%缓冲液C1. 2 I 升/分钟
10毫；升再生100%缓冲液B1. 2 I 升/分钟
停止分级分离
50毫；升再平衡100%缓冲液A1. 5 I 升/分钟
检测:280nm，260nm，220nm
电导率
分级分离:1，5毫升级分
5. 3结果
5. 3. 1实施例2. 1的样品
根据方法5. 2. 1纯化
开始体积10毫升，用缓冲液A以1 8稀释=80毫升
级分80/1.5毫升
运行号QS172 Q04
由于样品组合物中的高赖氨酸含量，蛋白质偶联物的主要部分不能结合到柱上。 因此，进行进一步的纯化步骤。5. 3. 2实施例2. 1的样品样品组合物来自实施例5. 3. 1的220毫升流量。根据5. 2. 1的方法进行纯化开始体积220毫升，用缓冲液A以1 2稀释=440毫升流速3，5毫升/分种(加载样品)级分80/1.5 毫升运行号QS172Q045. 3. 3实施例2. 2的样品根据5. 2. 1的方法进行纯化开始体积10毫升，用缓冲液A以1 8稀释=80毫升级分80/1.5毫升运行号QS173Q05由于样品组合物中的高赖氨酸和甲硫氨酸浓度，蛋白质偶联物的主要部分不能结 合到柱上。因此，进行进一步的纯化步骤。5. 3. 4实施例2. 2的样品样品组合物来自实施例5. 3. 3的220毫升流量。根据5. 2. 1的方法进行纯化开始体积220毫升，用缓冲液A以1 2稀释=440毫升流速3，5毫升/分种(加载样品)级分80/1.5毫升运行号QS177Q055. 3. 5实施例2. 3的样品根据5. 2. 1的方法进行纯化开始体积6. 5毫升，用缓冲液A以1 3稀释=20毫升运行号QS176Q085. 3. 6实施例2. 4的样品根据5. 2. 1的方法进行纯化开始体积0. 8毫升，用缓冲液A以1 25稀释=20毫升级分80/1.5 毫升运行号QS175Q095. 3. 7实施例3. 1的样品根据5. 2. 2的方法进行纯化开始体积4. 6毫升，用缓冲液AWl 17稀释=80毫升，用48微升12. 5%的氨 溶液调整PH值至8-8，5级分80/1.5 毫升运行号QS183R835. 3. 8实施例3. 2的样品根据5. 2. 2的方法进行纯化开始体积2. 3毫升，用缓冲液AWl 17稀释=40毫升，用48微升12. 5%的氨溶液调整PH值至8-8，5级分80/1.5 毫升运行号QS184R845. 3. 9实施例3. 3的样品根据5. 2. 2的方法进行纯化开始体积2. 5毫升，用缓冲液AWl 17稀释=43毫升，用48微升12. 5%的氨 溶液调整PH值至8-8，5级分80/1.5 毫升运行号QS177R855. 4结果比较测定实施例5. 3 的合并级分Q48-24、Q58-23、Q89-24、Q97-16、R839-20、R849-20、 R859-20的蛋白质浓度。在280nm和221nm处，用RP-HPLC测定蛋白质浓度。用标定函数 以外标IFN-α进行定量。使用消光系数ε = 0. 9054ml mfcnT1进行光度测定的浓度的计
笪弁。由于使用标准品α -干扰素CRS-IFN-α _2b，其具有1. 724毫克/毫升的蛋白浓 度。为了校准，使用10微克、20微克和40微克的浓度。由校准标准的两次注射的平均面积 计算校准值。为了计算样品的蛋白质浓度，进行两次注射，并计算平均面积。 对于所有进一步的研究，蛋白质浓度指HPLC(221nm)的值。实施例6 干扰素α抗病毒活性生物测试的描述测试程序的描述干扰素α的抗病毒活性
经过在细胞培养基中预稀释测试物后，制备系列的2倍稀释液。在96孔微量滴定 板中，向新胰蛋白酶化的MDBK细胞(40. 000每孔细胞)中加入稀释的干扰素，每个稀释度 重复四次。在37°C下孵育测试24小时(每孔总体积175微升)。随后，向各孔(除了阳性对照孔外)中加入50微升稀释的VSV原液，导致0. 1的
感染复数。在各个测试中包括以下对照接受病毒加细胞培养基(而不是干扰素)的12个孔 (ja^iMj，和接受细胞培养基(而不是干扰素)和病毒的12个孔(阳件对照)。在37°C下孵育这些测试42小时。孵育期结束时，用50微升的MTT溶液(在细胞培养基中，至少2毫克/毫升)代 替各孔的细胞培养上清液。孵育细胞3小时。通过向各孔加入100微升异丙醇/盐酸(具 有40mM HCl的异丙醇)溶液溶解由增殖细胞形成的紫色甲播(formazan)染料。随后，在 微滴定板读板器中在570/630nm下测量溶液的吸光度值。对于干扰素的各稀释度，在干扰素和VSV存在下生长的MDBK细胞的增殖活性如下 计算
((4个干扰素处理孔的平均吸光度W阴性对照的平均吸光度T)* 100
(阳性对照的平均吸光度)-(阴性对照平均吸光度)对于各个测试物，在4个独立的测试中确定干扰素α的抗病毒活性。实施例6. 1 Intron A相对于NIH标准品的抗病毒活性在所有实验中，相对于NIH 标准品的 rhIFN-α 2a(NIAID，NIH, Bethesda, USA, GxaO 1-901-535)校准的 Intron A(干扰素-α 2b，Schering-Plough)用作内部实验室基 准。NIH标准品具有9000IU/毫升的比活性。在测试中，内部实验室基准Intron A具有 8, 487, OOOIU/毫升的比活性。Intron A与NIH标准品rhIFN- α 2a相比的增殖活性如图3所示。实施例6. 2 干扰素-α -HES偶联物相对于Intron A的抗病毒活性在实施例6所述的分析系统中，相比于未修饰的IFN-α起始原料、Intron A和 Pegasys (Roche)对偶联物(Q4、Q5、Q8、Q9、R83、R84、R85)进行测试。计算该材料的 CPE50 浓度。所有IFN-α -HES偶联物保留了抗病毒活性，其明显高于Pegasys。相比于未修饰的IFN- α起始原料和Intron A，IFN- α -HES偶联物的相对体外活 性如图4所示。实施例7 IFN- α -HES偶联物的体内生物活性(小鼠的PK研究)实施例7. 1 小鼠血清对分析系统的影响在细胞培养基(对照)和小鼠血清(1 40稀释和1 80稀释)中制备干扰 素-α的稀释液。如实施例6所述进行测试。对于对照、1 40稀释的小鼠血清以及1 80稀释的小鼠血清，在两个独立的测 试中测定干扰素-α的抗病毒活性。结果表明1 40和1 80稀释的小鼠血清不影响 对于干扰素-α的抗病毒活性的生物测定。实施例7. 2 小鼠体内研究
在抗病毒测试中测定合并的血清的抗病毒活性。每次，从2只小鼠(雌性BALB/ c小鼠，8周鼠龄)收集血清，在静脉注射30微克/千克(基于蛋白质含量)的IFN-α或 IFN- α -HES偶联物2小时、4小时、12小时和24小时后处死小鼠。解冻血清样品，并通过涡旋(和稀释)完全均一化。在细胞培养基中制备系列的 2倍稀释液。解冻小瓶的(稀释的)Intron Α，并通过涡旋完全均一化。在细胞培养基中制 备系列的2倍稀释液。如实施例6所述，由1 2稀释系列的剂量响应曲线确定CPE-分析 的EC50-稀释度。与未修饰的起始原料和Pegasys相比，确定该材料的半衰期。由EC50-稀释相对于 注射后时间的半对数作图计算半衰期。对于HES-IFN- α :Q4、Q5、Q8、Q9、R83、R84、R85检测 长达24小时的抗病毒活性。如从图5中看出，半衰期介于6至8.7小时之间。对于未修饰 的干扰素-α，血清的抗病毒活性过低而不能计算血清半衰期。在K. R. Reddy等人Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586中，测定了大鼠中IFN-α的血清半衰期(静脉 注射)为2小时。实施例8 =HES-G-CSF偶联物的合成对于偶合反应(反应条件见下表)，在醋酸盐缓冲液(10mM，pH4_5)中配制的 rh-metG-CSF的溶液(例如，Neupogen⑧或生物等效制剂)填充到配备有磁力搅拌棒的50 毫升Falcon管中。各醛基-HES (al_HES)衍生物(类似于实施例1制备)溶于反应缓冲液 (0. IM的醋酸钠，pH 5.0)中，并在搅拌(-200rpm)下慢慢逐滴加到蛋白质中以产生30 1 的HES衍生物/G-CSF比例。持续搅拌直到样品看起来均一化。通过在搅拌器搅拌下加入 25倍浓缩的NaCNBt3溶液(0. 5M ；终浓度为20mM)再次开始反应。在设置为10°C的冰箱中 不进行进一步搅拌孵育Falcon管过夜(16小时)。制备HES-G-CSF偶联物的偶合条件 通过SDS-PAGE分析(参照图6)显示Gh
实施例9 =HES-EPO偶联物的合成缓冲液交换在20°C下，在Vivaspin15R浓缩器(Viva Science, IOkDa MWCO，Hannover，D)中， 以3. 939xg离心EPO溶液(17. 5毫升，35毫克，2毫克/毫升，例如，Epocrit 或生物等效 制剂)30分钟。通过用反应缓冲液(0. IM的醋酸钠，pH 5. 0)稀释残留溶液至18毫升并如 所述离心35分钟，重复洗涤过程2次。偶联作用将醛基-HES 60/1. 3(类似于实施例1制备，2. 893克，40当量)溶于蛋白质溶液 和反应缓冲液至最终体积为6.0毫升。用移液管充分混合该混合物，并在0°C孵育。加入 氰基硼氢化钠溶液(430微升，在0°C预冷却的反应缓冲液中300mM，Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)，在用移液管混合并离心后得到5. 4毫克/毫升的最终计算 蛋白质浓度和45% [w/v]的最终HES浓度。在冰上孵育反应混合物19小时。通过SDS凝 胶电泳分析反应混合物的样品(10微克)。XCellSure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D)和 Consort E143 电源(CONSORTnv，Turnhout, B)用于 SDS 凝胶电泳。根据 生产商的说明书使用4-12% Bis-Tris凝胶和还原条件下的MOPS SDS电泳缓冲液(两个都
来自nvitrogen GmbH, Karlsruhe, D)。
WO 03/049699A2US 5, 990, 237Kle讓 D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry 第 2 卷，1998，Wiley-VCH， ffeinheim, New York，特别是 4. 4 章，Esterif ication ofCellulose (ISBN 3-527-29489-9)WO 00/66633AWO 00/18893AUS 4，454，161EP 0 418 945AJP 2001294601AUS 2002/065410AK. R. Reddy 等人 Advaced Drug Delivery Reviews 54(2002)第 571-586 页
59
权利要求
一种制备羟烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)将任选氧化的羟烷基淀粉与包含至少两个官能团 O NH2的化合物(D)或其盐反应，和b)将步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物与包含至少两个独立地选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的酮基的官能团W1和W2的化合物(L)反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述羟烷基淀粉具有式(I)的结构 其中，HAS'是羟烷基淀粉分子的其余部分，且礼、R2和R3独立地为氢或直链或分支羟烧基基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，礼、1 2和1 3独立地为(CH2CH20)n-H基团，其中，n 是整数，优选是0、1、2、3、4、5或6。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述羟烷基淀粉在步骤a)中与化合物 (D)或其盐反应之前不氧化。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，化合物(L)包含至少两个官能团巧和 w2，其独立地选自醛基、半缩醛基、-ch(oh)2、缩醛基、酮基和缩酮基，优选选自半缩醛基、-CH (OH) 2、缩醛基、缩酮基和-c (0) -R基团，其中R选自氢、饱和或 不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基， 其中，在-C (0) -R基团是酮基的情况下，残基R优选选自(「(；烷基和C6-C14芳基，甚至更优 选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，在步骤a)的反应之前未氧化的所述羟 烷基淀粉在羟烷基淀粉的还原末端与化合物(D)或其盐反应。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，化合物(D)或其盐在步骤a)中通过所 述至少两个官能团-O-NH2中的至少一个与羟烷基淀粉的醛基和/或半缩醛基反应。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，化合物(D)或其盐通过所述至少两个 官能团-O-nh2中的至少一个与羟烷基淀粉的还原末端反应，且其中，所述羟烷基淀粉在步 骤a)的反应之前未氧化。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述步骤a)进一步包括在步骤b)之 前对获得的羟烷基淀粉衍生物进行还原。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，化合物(L)通过所述至少两个官能 团Wi和W2中的至少一个与步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物或其盐的至少一个官能团 h2n-O-反应。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述用于步骤a)中的化合物(D)具有 式(II)的结构 或其盐，其中，R4选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取 代的亚烷基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚芳烷 基、取代或未取代的亚烷芳基、及取代或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和 取代或未取代的亚烷杂芳基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，R4选自亚烷基丄6-(14亚芳基和_[(CR5R6) m0]n[CR7R8]。-，其中，R5、R6、R7和R8彼此独立地选自氢、烷基和芳基，m是2至4 ;n为0至20， 和o是2至20，其中，在n为0的情况下，o是不是0。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，化合物(D)中的R4是-[(CR5R6)m0]n[CR7R8]。-， 其中，R5、R6、R7和R8彼此独立地选自氢、Q-C；烷基和C6-C14芳基，m是2，n是1和o是2。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，用于步骤a)中的化合物(D)是或其盐。
16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，用于步骤b)中的化合物(L)是双官能 交联化合物。
17.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，用于步骤b)中的化合物(L)具有式 (III)的结构m an)，其中，&选自化学键，优选单键、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亚烷基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基及取代或未取 代的亚杂芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基和取代或未取代的亚 杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未取代的亚烷杂芳基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，&是取代或未取代的亚芳基或取代或未取代 的亚烷基，特别地其中，&是未取代的C6-C14亚芳基或_(CH2)n_，n优选为1-6，优选是亚苯 基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述R9是未取代的C6-C14亚芳基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述用于步骤b)中的化合物(L)是
21.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤b)进一步包括对获得的羟烷基 淀粉衍生物进行还原。
22.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤b)中获得的羟烷基淀粉衍生物c)与至少一种生物活性剂反应。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述用于步骤c)中的所述至少一种生物活性 剂包含至少一个官能团-NH2。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述用于步骤c)中的所述至少一种生物 活性剂选自肽、多肽、蛋白质及多肽或蛋白质的功能衍生物、片段或模拟物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多肽选自促红细胞生成素(EP0)如重组人 EPO(rhEPO)或EP0模拟物、集落刺激因子(CSF)如G-CSF，如重组人G-CSF(rhG-CSF)、a -干 扰素(IFN- a )、日-干扰素(IFN- 3 )或Y -干扰素(IFN- y )如IFN- a和IFN- 3，如重组 人 IFN-a 或 IFN-0 (rhIFN-a 或 rhIFN-0 )、白介素例如 IL-1 至 IL-18，如 IL-2 或 IL-3， 如重组人IL-2或IL-3(rhIL-2或rhIL-3)、血清蛋白如凝血因子II-XIII，如因子VIII、因 子VII、因子IX、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子X、因子XI、因子XII、因 子XIII、a 1-抗胰蛋白酶(A1AT)、活化蛋白C(APC)、纤溶酶原激活物如组织型纤溶酶原激 活物(tPA)，如人类组织纤溶酶原激活物(hTPA)、AT III如重组人AT III(rhAT III)、肌 红蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子 (PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、脑源性生长因子(BDGF)、神经生长因子(NGF)、B细胞 生长(BCGF)、脑源性的神经营养生长因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因 子如TGF-a或TGF-0、BMP (骨形态发生蛋白)、生长激素如人生长激素、肿瘤坏死因子如 TNF-a或TNF-0、生长抑素、促生长素、生长调节素、血红蛋白、激素或激素原如胰岛素、促 性腺激素、黑色素细胞刺激素(a-MSH)、曲普瑞林、下丘脑激素如抗利尿激素(ADH)和催产 素以及释放激素和释放抑制激素、甲状旁腺激素、甲状腺激素如甲状腺素、促甲状腺激素、 促甲状腺素释放素、降钙素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2等)、exendines 如Exendin-4、瘦素、加压素、胃泌素、胰泌素、整联蛋白、糖蛋白激素(如LH、FSH等)、 melanoside-刺激激素、脂蛋白和载脂蛋白如ap0-B、ap0-E、ap0-La、免疫球蛋白如IgG、IgE、 IgM、IgA、IgD及其片段、水蛭素、组织途径抑制剂、植物蛋白如植物凝集素或蓖麻毒蛋白、蜂 毒、蛇毒、免疫毒素、抗原E、a -蛋白酶抑制剂、豚草过敏原、黑色素、寡赖氨酸蛋白质、RGD 蛋白质或任选这些蛋白质之一的相应的受体；催乳素或其突变体，如G129R，其中129位的 野生型氨基酸甘氨酸被精氨酸取代，及这些蛋白质或受体的功能衍生物或片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述多肽选自促红细胞生成素(EP0)如重组人 EPO(rhEPO)、集落刺激因子(CSF)如重组人 G-CSF (rhG-CSF)、a -干扰素(IFN- a )、0 -干 扰素(IFN- 3 )、y -干扰素(IFN- y )如重组人 IFN- a 或 IFN- 3 (rhIFN- a 或 rhIFN- 3 )、 A1AT和因子IX。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述多肽是IFN-a。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述多肽是G-CSF。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述多肽是EP0。
30.根据权利要求22至29中的任一项所述的方法，其中，步骤b)中获得的所述羟烷基 淀粉衍生物在步骤c)中通过在步骤b)中由化合物(L)引入羟烷基淀粉衍生物中的官能团 Wi和W2中的至少一个与至少一种生物活性剂反应。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤b)中获得的所述羟烷基淀粉衍生物在步骤c)中通过生物活性剂的至少一个官能团-NH2与在步骤b)通过化合物(L)引入羟烷基 淀粉衍生物中的官能团Wi和W2中的至少一个反应。
32.根据权利要求23至31中的任一项所述的方法，其中，用于步骤c)中的至少一种生 物活性剂所包含的至少一个官能团_NH2是多肽或蛋白质的N-末端官能团_NH2。
33.根据权利要求23至32中的任一项所述的方法，其中，步骤c)在还原胺化反应条件 下进行。
34.根据权利要求23至33中的任一项所述的方法，其中，步骤c)利用还原剂进行，优 选硼烷，特别是NaCNBH3。
35.根据前述权利要求22至34中的任一项所述的方法，其中基于步骤b)获得的羟烷 基淀粉衍生物的重均分子量(Mw)，在步骤c)中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物与生物活 性剂的摩尔比为大约1 1到大约100 1当量。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述比例为大约1 1至大约20 1。
37.根据权利要求33至36中的任一项所述的方法，其中，用于步骤c)中的步骤b)获 得的羟烷基淀粉衍生物的浓度高于大约10% m/v。
38.根据权利要求22至37中的任一项所述的方法，其中，步骤c)中的温度为大约0°C 至大约25°C。
39.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，未氧化的羟烷基淀 粉在羟烷基淀粉的还原末端通过一个官能团-0-NH2与化合物(D) 反应，且在步骤b)中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生物通过官能团-0-NH2与化合物(L) 的一个官能团-CH = 0反应。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，在步骤c)中，步骤b)获得的羟烷基淀粉衍生 物与IFN- a在还原胺化条件下，特别是在NaCNBH3存在的条件下反应。
41.能够通过权利要求1至40中的任一项所述的方法获得的羟烷基淀粉衍生物。
42.以下结构的HAS衍生物，优选HES衍生物 OR.和/或相应的环结构 OR, 其中，更优选，HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大 约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大 约10至大约200kDa、特别是大约50至大约150kDa的平均分子量，和0. 1至3、优选0. 4至 1. 3 如 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2 或 1. 3 的摩尔取代度，和优选 2 至 20、更优 选2到15和甚至更优选3至12的C2 C6取代比；其中，HAS'是羟烷基淀粉分子的其余部分，且Ri、R2和R3独立地为氢、直链或分支羟烷 基或-[(CRY) ffl0] n [CR3R4]。-OH 基团，其中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢和烷基，优选氢和甲基， m是2至4，其中，在m个CR1! 2基团中残基R1和R2可以相同或不同； n为0至20，优选0至4;o是2至20，优选2至4，其中，o个CR3R4基团中的残基R3和R4可以相同或不同； 其中，R4选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的亚烷 基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代 或未取代的亚烷芳基及取代或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未 取代的亚烷杂芳基；其中，&选自化学键，优选单键、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亚烷基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基及取代或未取 代的亚杂芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基、和取代或未取代的亚 杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未取代的亚烷杂芳基；并且其中％选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的酮基，优选选自醛基、半 缩醛基、_CH(0H)2、缩醛基、酮基和缩酮基，优选选自半缩醛基、-CH(0H)2、缩醛基、缩酮基 和-C(0)-R基团，其中R选自氢、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或 未取代的烷基和取代或未取代的芳基，其中在基团-C (0)-R是酮基的情况下，残基R优选选 自Ci-Q烷基和C6-C14芳基，甚至更优选选自任选取代的，优选非取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
43.以下结构的HAS衍生物，优选HES衍生物 和/或相应的环结构 其中，更优选，HES具有大约1至大约lOOOkDa、更优选大约1至大约800kDa、更优选大 约1至大约500kDa、更优选大约2至大约400kDa、更优选大约5至大约300kDa、更优选大约 10至大约200kDa、特别是大约50至大约150kDa的平均分子量，0. 1至3、优选0. 4至1. 3 如0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2或1. 3的摩尔取代度，和优选2至20、更优选2 到15和甚至更优选3至12的C2 C6取代比；其中，HAS'是羟烷基淀粉分子的其余部分，且Ri、R2和R3独立地为氢、直链或分支羟烷 基或-[(CRf) ffl0] n [CR3R4]。-OH 基团，其中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢和烷基，优选氢和甲基， m是2至4，其中，m个CR1! 2基团中的残基R1和R2可以相同或不同； n为0至20，优选0至4;o是2至20，优选2至4，其中，o个CR3R4基团中的残基R3和R4可以相同或不同； 其中，R4选自饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取代或未取代的亚烷 基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代 或未取代的亚烷芳基及取代或未取代的亚杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未 取代的亚烷杂芳基；其中，&选自化学键，优选单键、饱和或不饱和的、环状或线性的、分支或不分支的、取 代或未取代的亚烷基，亚烷基链中可能含有杂原子、取代或未取代的亚芳基及取代或未取 代的亚杂芳基、取代或未取代的亚芳烷基、取代或未取代的亚烷芳基及取代或未取代的亚 杂芳基、取代或未取代的亚杂芳烷基和取代或未取代的亚烷杂芳基；并且其中，BA是生物活性剂，BA包含至少一个官能团_NH2，BA表示为H2N-BA'，其中， BA'是BA的其余部分，BA优选选自促红细胞生成素(EP0)如重组人EP0(rhEPO)、集落刺激 因子(CSF)如重组人G-CSF (rhG-CSF)、a -干扰素(IFN- a )、旦-干扰素(IFN- 3 )、Y -干 扰素(IFN-y)如重组人 IFN-a 或 IFN-3 (rhIFN-a 或 rhIFN-3 )、A1AT 和因子 IX， 尤其优选为
44.包含治疗有效量的能够通过权利要求22至40中的任一项所述的方法获得的羟烷 基淀粉衍生物或权利要求43所述的羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中，所述羟烷基淀粉衍生物能够通过权利 要求27所述的方法获得。
46.能够通过权利要求22至40中的任一项所述的方法获得的羟烷基淀粉衍生物或权 利要求43所述的羟烷基淀粉衍生物作为治疗剂或预防剂。
47.能够通过权利要求27所述的方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备治疗选自癌 症如毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤和/或AIDS相关卡波济氏肉瘤、尖锐湿 疣、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，优选慢性乙型肝炎和丙型肝炎的疾病的药物的用途。
48.能够通过权利要求28所述的方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备治疗选自癌 症患者如接受骨髓抑制性化疗的癌症患者、接受诱导或巩固化疗的急性髓性白血病患者和 /或接受骨髓骨移植的癌症患者、经受外周血祖细胞收集和治疗的患者和患有严重慢性中 性粒细胞减少症的患者的患者中的疾病的药物的用途。
49.能够通过权利要求29所述的方法获得的羟烷基淀粉衍生物用于制备用于治疗贫 血如慢性肾衰竭患者、齐多夫定治疗的HIV感染患者、化疗的癌症患者的贫血、或用于减少 手术患者中的异体输血的药物的用途。
50.通过施用治疗有效量的能够根据权利要求27至29中的任一项所述的方法获得的 羟烷基淀粉治疗选自癌症患者如接受骨髓抑制性化疗的癌症患者、接受诱导或巩固化疗的 急性髓性白血病患者和/或接受骨髓骨移植的癌症患者、经受外周血祖细胞收集和治疗的 患者和患有严重慢性中性粒细胞减少症的患者的患者中的疾病，用于治疗贫血，如慢性肾 衰竭患者、齐多夫定治疗的HIV感染患者、化疗的癌症患者的贫血或用于减少手术患者中 的异体输血的方法。
全文摘要
一种制备羟烷基淀粉(HAS)衍生物的方法，包括a)将任选氧化的羟烷基淀粉与包含至少两个官能团-O-NH2的化合物(D)或其盐反应，和b)将步骤a)获得的羟烷基淀粉衍生物与包含至少两个独立地选自醛基、适当保护的醛基、酮基和适当保护的酮基的官能团W1和W2的化合物(L)反应。
文档编号C08B31/12GK101918454SQ200880124245
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月15日 优先权日2007年12月14日
发明者A·米奇, F·哈克特, F·豪席尔德, H·克内勒, M·席梅尔, N·灿德尔, W·艾希纳 申请人:弗雷泽纽斯卡比德国有限公司