一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法与流程

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本发明涉及银杏叶提取物中一有效成分的提取制备方法，具体涉及一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法，属于化合物制备技术领域。

背景技术：

银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，银杏叶提取物是经现代提取工艺从银杏叶中提取的活性物质的富集产品，可用于阿尔茨海默病、抑郁症、糖尿病、神经疾病、阳痿、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。其主要活性成分为黄酮类和萜类。黄酮类成分包括单黄酮、黄酮醇苷、乙酰化黄酮醇苷、双黄酮、黄烷-3-醇类以及原花色素等。萜类银杏内酯有银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯。

国家食品药品监督管理总局(CFDA)目前批准了数十种银杏叶提取物剂型，包括银杏叶片、胶囊、颗粒、软胶囊、分散片、丸、酊、滴剂、口服液、银杏叶提取物注射液等，上述制剂及银杏叶提取物的质量控制多采用指纹图谱的方法进行，国际上一般公认的银杏叶提取物的质量指标为含黄酮24％以上，内酯6％以上，国内药典委员会颁布的以银杏叶提取物为原料的舒血宁注射液质量标准规定总黄酮醇苷的量不少于24％，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯4种成分的总含量不少于6％。但是银杏叶提取物是一个非常复杂的化合物富集产品，含有从无机物到有机物、从极性到非极性、从小分子到生物大分子的各种成分，据不完全统计银杏叶中含有240多个化学成分，而普通的银杏叶提取物的指纹图谱中却只有十几个峰，从而无法准确的反映产品的物质基础。众所周知的是，银杏叶提取物的提取方法不同，其得到的提取物中有效化合物及其含量不同，则其药效也不相同，由其制备得到的药品的适用症状及功能必不完全相同；严格来讲，即使提取方法相同，由于银杏叶原料批次不同、产物不同，其最终得到的提取物中化学成分的含量也不尽相同，而上述因素终会对药品的药效产生不同程度的影响，因此，仅以现行质量标准对银杏叶提取物及其制剂进行质量控制的效果不甚严格与规范，大量不明物质的存在影响了对其含量的准确测定，更制约了药品质量标准的提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于对银杏叶提取物中的化学成分进行分离和制备，进一步确认和高纯度提取一种化学成分-山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷，以期对银杏叶提取物及其制剂中药用成分的含量测定提供依据。

为此，本申请采取的技术方案为，

一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法，包括，(1)将银杏叶提取物溶于体积浓度为40-80％的乙醇-水溶液中，制备得到银杏叶提取物的浓度为10-1000mg/mL的提取物溶液；(2)对所述步骤(1)得到的提取物溶液进行一维液相色谱分离，得到一维粗产品；(3)将步骤(2)得到的一维粗产品溶解在体积浓度为40-80％的甲醇-水溶液或乙醇-水溶液中，得到所述一维粗产品的浓度为20-200mg/mL的粗产品溶液；(4)对所述步骤(3)得到的粗产品溶液进行二维液相色谱制备，得到山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(2)中一维液相色谱分离的条件为，色谱柱采用以硅胶为基质的亲水型色谱填料；流动相中的有机相为乙醇或甲醇，水相为水；洗脱条件以0-15min有机相95％降至90％梯度进行或等度进行；收集保留时间为15～20min的组分，干燥得到所述一维粗产品。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(2)中一维液相色谱分离，有机相还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1％；水相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1％。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(4)中二维液相色谱条件为，色谱柱采用以硅胶为基质键合C18反相填料；流动相中的有机相为乙醇或甲醇，水相为水；洗脱条件以0-60min有机相15％增至80％梯度进行或等度进行；收集保留时间为50-55min的组分，干燥得到山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(4)二维液相色谱制备，流动相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1％；水相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1％。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(4)中二维液相色谱制备，流动相中的有机相为甲醇，水相为水。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(1)中，将银杏叶提取物溶于体积浓度为50-60％的乙醇-水溶液中，制备得到银杏叶提取物的浓度为250-550mg/mL的提取物溶液。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，所述步骤(3)中，将步骤(2)得到的一维粗产品溶解在体积浓度为50-60％的甲醇-水溶液或乙醇-水溶液，所述粗产品溶液浓度为60-100mg/mL。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，一维液相色谱，流动相流速为60-120mL/min，柱温为室温或25-40℃，进样量为200-3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器；

二维液相色谱，流动相流速为60-120mL/min，柱温为室温或25-40℃，进样量为1000-3000μL/针，紫外检测器检测波长为360nm。

上述的从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的方法中，二维液相色谱，流动相流速为80-100mL/min，柱温为室温或25-40℃，进样量为2000-2500μL/针，紫外检测器检测波长为360nm。

与现有技术相比，本发明具有如下优点，

(1)本申请从银杏叶提取物中制备得到一种明确的药用化合物-山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷，其制备方法简单，分离操作方便，采用二维液相色谱法分离出一特定的化合物，从而在银杏叶提取物质量控制的研究中增加了指标成分，丰富了活性物质的检测对象，利于银杏叶提取物及其药品质量标准的提高，尤其提高现行广泛使用的舒血宁注射液的质量。

(2)申请人通过对一维液相色谱与二维液相色谱的结合应用，分别对流动相、色谱柱及洗脱条件进行选择，避免了银杏叶提取物中多种成分对山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的干扰，制备得到纯度在90％以上的山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1本发明实施例1中制备得到的化合物的质谱；

图2本发明实施例1中制备得到的化合物的H谱；

图3本发明实施例1中制备得到的化合物的C谱。

具体实施方式

本发明实施例中出现的百分数％，如无特殊说明表示的是体积百分数，例如，

“40％的乙醇－水溶液”表示乙醇的水溶液其中乙醇的体积百分数为40％；

“40％的甲醇－水溶液”表示甲醇的水溶液其中甲醇的体积百分数为40％；

“乙醇(含0.1％甲酸)”表示乙醇与甲酸的混合溶液其中甲酸的体积百分数为0.1％；

“水(含0.1％甲酸)”表示水与甲酸的混合溶液其中甲酸的体积百分数为0.1％；

实施例1

称取银杏叶提取物10g，溶于50mL 40％的乙醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为200mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱分离。一维液相色谱采用以硅胶为基质的亲水型色谱填料50×250mm，10μm(华谱新创科技有限公司)，流动相采用含0.1％体积浓度甲酸的甲醇为有机相，含0.1％体积浓度甲酸的水为水相，梯度洗脱方式：0-15min有机相浓度从95％降至90％台阶梯度进行。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为90mL/min，收集15～20分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品。用50％的乙醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为以硅胶为基质的亲水型色谱填料(50×150mm，5μm，华谱新创科技有限公司)流动相选择含0.1％体积浓度甲酸的甲醇为有机相，含0.1％体积浓度甲酸的水为水相，采用0-60min的15-80％有机相梯度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为1000μL/针，流动相流速为90mL/min，收集保留时间在50-55min的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为95.5％，一维制备山奈酚 -3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品中山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量为30％。

分别采用质谱、¹H-NMR和¹³C-NMR(MeOD)对得到的终产物进行分析，其中质谱、¹H-NMR谱图如图1和2所示，

¹³C-NMR(MeOD)解析如下，

山奈酚母环：156.98(C2)，135.42(C3)，178.14(C4)，161.75(C5)，98.40(C6)，164.18(C7)，93.46(C8)，156.88(C9)，104.68(C10)，121.25(C1’)，130.56(C2’，C6’)，115.00(C3’，C5’)，159.67(C4’)。

3-O-鼠李糖：101.12(C1”)，82.26(C2”)，70.38(C3”)，72.10(C4”)，70.55(C5”)，16.33(C6”)。

2”-葡萄糖：105.66(C1”’)，73.99(C2”’)，76.29(C3”’)，70.78(C4”’)，73.73(C5”’)，63.12(C6”’)。

6”-对香豆酰基：167.40(C1””)，113.29(C2””)，145.16(C3””)，125.58(C4””)，129.62(C5””，C9””)，115.23(C6””，C8””)，160.02(C7””)。

综合鉴定为山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷，化合物的分子式为C₃₆H₃₆O₁₇，分子量740.1982，结构式如下

实施例2

称取银杏叶提取物1g，溶于100mL体积浓度80％的乙醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为10mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用以硅胶为基质的亲水型色谱填料(50×250mm，10μm，华谱新创科技有限公司)，流动相采用乙醇为有机相，水为水相，有机相浓度为90％等度，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为40℃，进样量为200μL/针，流动相流速为60mL/min，收集15～20分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品。用40％的乙醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品，浓度为20mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为以硅胶为基质键合C18反相填料(50×150mm，10μm，华谱新创科技有限公司)，流动相选择含0.1％体积浓度甲酸的乙醇为有机相，含0.1％体积浓度甲酸的水为水相，采用等度洗脱方式，有机相浓度为20％共60分钟。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为1000μL/针，流动相流速为100 mL/min，收集保留时间50-55min的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷化合物，经液相色谱分析，二维制备的山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷粗品中山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量为94.0％，