本发明涉及了一种海藻酸盐水凝胶微载体，具体地说是一种内部含有半乳糖基壳聚糖分子的海藻酸盐水凝胶微球载体及其制备与应用。
背景技术：
具有生物活性的物质被包封在选择性透过膜中，形成球状的微胶囊，称之为“生物微胶囊”[Chang TMS.Hemoglobin corpuscles.Research report for honours physiology.Medical Library,McGill University,1957]。90年代以来，以生物微胶囊作为细胞的免疫隔离和运载工具，利用基因重组细胞或原代细胞的代谢产物来调节机体生理功能，治疗相关疾病成为生物医学工作者的研究热点[Basic D,Vacek I,Sun A M.Microencapsulation and transplantation of engineered cells：a new approach to somatic gene therapy.Art Cells Blood Subs ImmobBiotechnol,1996,24(3)：219-255]。海藻酸因其具有优良的物理化学性能和生物医学性能，成为微囊化技术的主要材料。现有的微囊化技术在培养肝细胞时，由于肝细胞贴壁依赖的生长特性，微囊内部三维立体环境不能够使肝细胞迅速适应生长。半乳糖基团是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，能够特异性识别肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体，因此，在微囊材料上引入肝靶向的半乳糖基团，可诱导和提高肝细胞在微胶囊内部的黏附和增殖行为[Jun Yang,Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment,Biomaterials,2002,23:471-479]。目前在微囊内部引入半乳糖基团可通过在海藻酸上的共混或共价修饰。含有半乳糖基团的大分子物质[Seog-Jin Seo,Yun-Jaie Choi,Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment,Biomaterials,2005,26:3607-3615]主要通过与海藻酸共混制备微胶囊来发挥作用，共混的物质易发生泄漏因此导致了这类微胶囊的稳定性降低；而针对于海藻酸的共价修饰主要发生在海藻酸的羧基部位，羧基位点的占据使得海藻酸在凝胶化反应形成微胶囊的时候凝胶化程度降低，为了不过度影响海藻酸的成胶性能，半乳糖基取代度受到限制。[Ivan Donati,AmedeoVetere,Galactose-Substituted Alginate:Preliminary Characterization and Study of Gelling Properties,Biomacromolecules,2003,4:624-631]。由于微胶囊稳定性及半乳糖基取代度的限制，无论是共混或共价修饰海藻酸，目前报道的方法中均无法在微胶囊内部引入较高浓度的半乳糖基团。
壳聚糖是一种生物相容性优良的天然生物材料，实践表明海藻酸盐与壳聚糖因静电相互作用制成的微囊，制备方法温和、简单、成囊速度快，其微囊球 形度好，药物稳定性高[Donati I,Holtan S,Morch YA,et al.New hypothes is on the role of alternating sequences in calcium-alginate gels,Biomacromolecules,2005,6(2):1031-1040]。所以，近年来海藻酸盐/壳聚糖微囊的研究取得了明显的进展。目前的制备海藻酸盐/壳聚糖微囊的方法主要有以下三种：海藻酸盐滴入壳聚糖与二价离子的混合溶液中形成微囊[Thomas Chandy,Daniel L,Evaluation of Modified Alginate-Chitosan-Polyethylene Glycol Microcapsules for Cell Encapsulation,Artificial Organs,1999]；壳聚糖滴入海藻酸盐溶液中形成微囊[Sun-Hee Yu,Sung-Koo Kim,Encapsulation of rat hepatocyte spheroids for the development of artificial liver,Biotechnology Techniques,1999，13:609–614；X.L.GUO,K.S.YANG,et al,Morphology and metabolism of Ba-alginate-encapsulated hepatocytes with galactosylated chitosan and poly(vinyl alcohol)as extracellular matrices,Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition,2014，6：551-565]；海藻酸盐滴入钙液中形成包埋型水凝胶微球载体，再将该包埋型水凝胶微球载体浸入壳聚糖溶液中进一步反应成膜形成微胶囊，即AC微囊[TasimaHaque,In vitro study of alginate–chitosan microcapsules:an alternative to liver cell transplants for the treatment of liver failure，Biotechnology Letters，2005，27：317-322；Wujie Zhang,Shuting Zhao，A novel core–shell microcapsule for encapsulation and 3D culture of embryonic stem cells，Journal of Materials Chemistry B，2013，1：1002-1009]。前两种方法均存在以下几个问题，一是因壳聚糖和海藻酸两种大分子瞬间反应速度限制，形成的微囊粒径在1mm左右甚至更大，过大的微囊容易导致细胞团生长过大，中心细胞因传质传氧限制出现坏死，影响细胞活性，进而影响细胞分泌产物的医疗效果；二是大分子瞬间结合会形成不均匀，球形度较差的微囊，影响了微囊的机械强度，移植体内时微囊易发生破损而引起机体的炎症反应；三是无论海藻酸还是壳聚糖作为凝胶浴，海藻酸与溶于钙液中的壳聚糖不能完全反应或者壳聚糖不能完全结合海藻酸，均导致了原料的浪费。第三种方法，将海藻酸滴入二价盐溶液中可形成可控大小，球形度及机械强度均良好的包埋型水凝胶微球载体，但是再将包埋型水凝胶微球载体浸入壳聚糖溶液中进一步反应成膜形成传统AC微囊的时候，壳聚糖并不会进入微囊内部，这就形成了以海藻酸为核，壳聚糖为壳的核壳微囊结构，壳聚糖不接触微囊内部的细胞，使得有功能的壳聚糖不能发挥应有的作用。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提出一种内部含有半乳糖基壳聚糖分子的海藻酸盐包埋型水凝胶微球载体，其特征在于：海藻酸盐包埋型水凝胶微球载体内部含有半乳糖基壳聚糖分子，其中，半乳糖基壳聚糖分子与海藻酸盐分子间形成静电络合。即通过共价修饰的半乳糖基壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液在二者均不形 成沉淀的pH环境下充分混合均匀后，将混合液在高压静电场下形成射流，滴入pH偏酸的二价盐凝胶浴中，通过壳聚糖与海藻酸盐的静电络合，形成内部含有半乳糖基团的包埋型水凝胶微球载体。
技术方案
本发明中，通过共价修饰的半乳糖基壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液在pH6.0-8.0环境下充分混合均匀后，将混合液在高压静电场下形成射流，滴入pH5.0-6.9的二价盐凝胶浴中，形成内部含有半乳糖基团的包埋型水凝胶微球载体。包埋型水凝胶微球载体可继续与聚阳离子反应，在微球载体表面络合形成膜结构，称之为海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖-聚阳离子微胶囊；其中，聚阳离子包括下述任意一种或两种以上：聚氨基酸类(如聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸等)、聚胺类(如聚乙烯亚胺、聚亚甲基胍、聚N乙烯基己内酰胺、羧基-丙基-丙烯酰胺共聚物、DEAE-dextran、氨基聚乙二醇等)、壳聚糖等。该种海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖-聚阳离子微胶囊可浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部海藻酸盐凝胶；参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA溶液，微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1～1:40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊。
其中，所述半乳糖基壳聚糖是由壳聚糖(Chitosan)和乳糖酸(LA)通过酰胺化反应生成半乳糖基壳聚糖(GC)，其接枝度在(每100个壳聚糖单体接枝乳糖酸分子的百分数)1％-99％，反应式如下：
乳糖酸与壳聚糖经过共价修饰制备半乳糖基壳聚糖材料具体制备过程，参考文献如下：TaekWoong Chung，Preparation of alginate/galactosylated chitosan scaffoldfor hepatocyteattachment，Biomaterials，2002，23：2827-2834。
本方法制备的海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖-聚阳离子微胶囊产品为粒径 100-1000微米的球形微胶囊；微胶囊膜厚度在1-100微米；微胶囊膜中聚阳离子材料包括：壳聚糖，其脱乙酰度为60-98％，分子量为1kDa-800kDa(例如：1kDa-5kDa；10kDa-20kDa；50kDa-100kDa；100kDa-800kDa)；α-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa(例如：2kDa-10kDa；70kDa-150kDa；150kDa-300kDa；300kDa-500kDa)；ε-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa(例如：2kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚精氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚鸟氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚组氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)。
该微胶囊中海藻酸盐凝胶为二价金属钙，钡或锌水凝胶，海藻酸盐(分子量10KDa-10000kDa)溶液为海藻酸的钠盐或钾盐溶液。半乳糖基壳聚糖溶液为使用钠盐或钾盐溶解的易水溶的半乳糖基壳聚糖(分子量1KDa-800KDa)溶液。
产品的具体制备步骤为：
1)乳糖酸与壳聚糖经过酰胺化反应制备半乳糖基修饰壳聚糖材料，其中，壳聚糖接枝半乳糖基团的接枝率为1％-99％；
2)分别配制浓度为1-60g/L的半乳糖基壳聚糖溶液和浓度为10-30g/L的海藻酸盐溶液，调节二者pH环境均为6.0-8.0之间，保证二者充分溶解。其中，半乳糖基壳聚糖分子量为1KDa-800KDa，脱乙酰度80-98％，海藻酸分子量为10KDa-10000kDa；
3)将2)中所述半乳糖基壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液按照体积比例为1：5-5：1的比例混合，室温搅拌0.1-6h；
4)用3)中所述混合溶液通过锐孔挤出法、静电液滴法、乳化法、旋转盘法等形成液滴，滴入pH在5.0-6.9的二价盐凝胶浴中，凝胶固化20-60分钟，即制备成内部含有半乳糖基壳聚糖分子的包埋型水凝胶微球载体，称之为A微球。
5)将步骤4)中的A微球浸入聚阳离子溶液中，A微球与聚阳离子溶液体积比的范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到装载半乳糖基团的包埋型水凝胶微球载体，即海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖-聚阳离子微胶囊。
聚阳离子溶液的配制方法是：
壳聚糖溶于pH为5.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液或3-9g/L NaCl溶液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
或，α-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，ε-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚鸟氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚组氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
该微胶囊可用于活细胞的包埋，半乳糖基壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液充分 混合后，混合液与需要包埋的活细胞混匀制备包埋活细胞的微胶囊。微囊化细胞含量为105-2*107个/mL，细胞活性保持80％以上。所述活细胞为人或动物来源的离体的肝细胞，干细胞，干细胞分化的具有肝细胞功能的细胞，肝细胞系细胞，转分化的具有肝细胞功能的细胞，内皮细胞，肝枯否氏细胞，肝星形细胞，成纤维细胞，骨髓间充质干细胞中一种或二种以上。
本发明的有益效果
1、本方法能够保证形成大小可控、球形度良好的微胶囊，避免了微胶囊粒径过大而导致的细胞团中心坏死现象。
2、该方法制备的海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖-聚阳离子微胶囊，半乳糖基壳聚糖可进入微胶囊内部，解决了传统的AC微囊中半乳糖只能分布在微胶囊表面或即使进入微胶囊内部后也会导致微胶囊粒径变大，球形度变差的问题。
3、无论是将海藻酸滴入半乳糖基壳聚糖溶液或者将半乳糖基壳聚糖滴入海藻酸溶液，形成的海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖水凝胶微球载体中半乳糖含量均较低，该方法预先将海藻酸与半乳糖基壳聚糖在中性条件下混合，因此能将较大浓度的半乳糖引入到微胶囊内部，有利于半乳糖基团在微胶囊内部发挥更大的功能。
4、本方法直接将两种重要的大分子原料海藻酸和半乳糖基壳聚糖预先混合后制备微胶囊可最大限度的节约原料，控制成本。
5、本方法制备的微胶囊在保持优良球形度的同时，保持了良好的机械强度，能保证作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中微胶囊的完整性。
6、本方法制备的微胶囊相比于核壳结构的海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖微胶囊，保持免疫隔离性能的同时，通透性并未受到任何影响，反之更好，有利于细胞在该微胶囊内得到更好的传质与传氧。
具体实施方式
制备海藻酸盐/半乳糖基壳聚糖包埋型水凝胶微球载体的方法为静电液滴法(参考文献：In Vivo Culture of Encapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition,Human Gene Therapy.2007,18:474-481)。
实施例1
1)制备海藻酸钠溶液：将2.0g海藻酸溶于100mL生理盐水中制备成20g/L的海藻酸钠溶液，其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)制备半乳糖基壳聚糖溶液：将半乳糖基壳聚糖溶于生理盐水中，分别配制浓度为0，15g/L，20g/L，30g/L，pH为7.0的半乳糖基壳聚糖溶液。
3)配制凝胶浴溶液：11g无水氯化钙溶于1L去离子水中。
4)取2mL海藻酸钠溶液，分别混合2mL步骤2)中得到的不同浓度半乳糖基壳聚糖溶液，室温搅拌3h，此时海藻酸钠浓度为10g/L，半乳糖基壳聚糖浓度依次为0，7.5g/L，10g/L，15g/L，使用静电液滴法制备海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖包埋型水凝胶微球载体。
5)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
6)制备海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊：将步骤4)制得的包埋型水凝胶微球载体浸入步骤5)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊。
7)将步骤6)制得的海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊，按微胶囊：BSA＝1：20体积比放入FITC标记的BSA(牛血清蛋白)溶液中，激光共聚焦显微镜下实时观察，各组微胶囊均在2h内达到扩散平衡，表明海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊具有良好的通透性能。
8)将步骤6)制得的海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊与玛瑙球、生理盐水共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，各组微胶囊的完整率均在90％以上，表明海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊具有良好的机械强度。
实施例2
1)制备海藻酸钠溶液：将3.0g海藻酸溶于100mL生理盐水中制备成30g/L的海藻酸钠溶液，其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)制备FITC标记的半乳糖基壳聚糖溶液：将FITC标记的半乳糖基壳聚糖溶于生理盐水中，配制浓度为10g/L，pH为7.0的半乳糖基壳聚糖溶液。
3)配制凝胶浴溶液：11g无水氯化钙溶于1L去离子水中。
4)取2mL海藻酸钠溶液，分别混合2mL步骤2)中得到的半乳糖基壳聚糖溶液，室温搅拌3h，此时海藻酸钠浓度为15g/L，半乳糖基壳聚糖浓度5g/L，使用静电液滴法制备海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖包埋型水凝胶微球载体。
实施例3
1)制备海藻酸钠溶液：将2.0g海藻酸溶于100mL生理盐水中制备成20g/L的海藻酸钠溶液，其中，海藻酸分子量为350kDa，过滤除菌。
2)制备半乳糖基壳聚糖溶液：将0.4g半乳糖基壳聚糖溶于10mL生理盐水中制备成40g/L的壳聚糖溶液，调节pH值7.2，过滤除菌。
3)配制凝胶浴溶液：11g无水氯化钙溶于1L去离子水中，过滤除菌。
4)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，过滤除菌。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
5)取3mL海藻酸钠溶液，混合1mL半乳糖基壳聚糖溶液，室温搅拌1h。取2mL该混合溶液，加入4*106个大鼠原代肝细胞，混合均匀后，使用静电液滴法制备海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖混合大鼠原代肝细胞包埋型水凝胶微球载体。其中，形成包埋型水凝胶微球载体的粒径大小350μm左右。
6)将包埋有原代大鼠肝细胞的海藻酸钙/半乳糖基壳聚糖包埋型水凝胶微球载体浸入步骤4)制备的聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球载体与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/半乳糖基 壳聚糖-α-聚赖氨酸微胶囊。
7)对该微胶囊内的原代大鼠肝细胞进行培养和肝细胞功能表征，一周后，微胶囊保持完整形态，球形度良好；微胶囊内细胞活性保持初始活性的69％，肝细胞白蛋白分泌量为1.29±0.33μg/10^6个细胞，尿素合成量为349±7μg/10^6个细胞。
比较例
1)制备海藻酸钠溶液：将2.0g海藻酸溶于100mL生理盐水中制备成20g/L的海藻酸钠溶液，其中，海藻酸分子量为350kDa，过滤除菌。
2)配制凝胶浴溶液：11g无水氯化钙溶于1L去离子水中，过滤除菌。
3)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，过滤除菌。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
4)取3mL海藻酸钠溶液，混合1mL生理盐水溶液，室温搅拌1h。取2mL该混合溶液，加入4*106个大鼠原代肝细胞，混合均匀后，使用静电液滴法制备海藻酸钙混合大鼠原代肝细胞包埋型水凝胶微球载体。其中，形成包埋型水凝胶微球载体的粒径大小350μm左右。
5)将包埋有原代大鼠肝细胞的海藻酸钙包埋型水凝胶微球载体浸入步骤3)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球载体与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙-α-聚赖氨酸微胶囊。
6)对该微胶囊内的原代大鼠肝细胞进行培养和肝细胞功能表征，一周后，微胶囊保持完整形态，球形度良好；微胶囊内细胞活性保持初始活性的44％，肝细胞白蛋白分泌量为0.46±0.05μg/10^6个细胞，尿素合成量为231±29μg/10^6个细胞。