一种牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR检测方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR检测方法。

背景技术：

牛羊布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)引起的危害严重的人畜共患传染病，患病动物是主要传染源，该病广泛分布于世界各地，在许多国家均有不同程度的流行。

临床上该病主要引起家畜的生殖系统炎症、流产，人则表现为波浪热、寒颤、头痛、全身疼痛、疲劳、关节炎等非特异性症状，该病的传染源主要是发病及带菌的牛、羊等，感染动物首先在同种动物间传播，造成带菌或发病，随后波及人类。布鲁氏菌可经呼吸、消化、生殖系统粘膜及损伤甚至未损伤的皮肤等多种途径，通过接触或食入感染动物的分泌物、体液等发生侵入感染。

布鲁氏菌病的诊断是布鲁氏菌病的研究重点和难点，目前，确诊布鲁氏菌病的金标准是对病原菌的分离鉴定，但其对病原的分离率偏低，并且需要一定的生物安全防护措施且监测时间长。虎红平板凝集试验(RBPT)是我国法定的检测方法，但也不适于牧场的快速检测。因此，需要研究一种快速、特异、灵敏的PCR检测方法，以应用到布鲁氏菌病的诊断中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、特异的牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)待检测样品DNA的提取；

2)引物对的设计：应用Primer 5.0软件分别设计布鲁氏菌属特异性引物和牛、羊种布鲁氏菌特异性引物，具体的引物序列如下：

布鲁氏菌属特异性引物：

上游引物：F1：5’-CGC TTG CCT TTC AGG TCTG-3’，如SEQ ID NO：1所示；

下游引物：R1：5’-TGG CTC GGT TGC CAA TATCA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

牛、羊种布鲁氏菌特异性引物：

牛上游引物：F2：5’-ATC AGG ACA AGG ACG AACG-3’，如SEQ ID NO：3所示；

羊上游引物：F3：5’-GAT AAT CAT CCA CCA CCT TG-3’，如SEQ ID NO：4所示；

公用下游引物：R2：5’-GCT GCG AAT AAA GCC AAC-3’，如SEQ ID NO：5所示；

3)配置多重PCR反应体系，进行多重PCR反应，反应结束后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶中，琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；

4)检测结果分析：被检样品扩增出大小为222bp、615bp的目的条带，表明该样品中牛种布鲁氏菌阳性；被检样品扩增出大小为222bp、932bp的目的条带，表明该样品中羊种布鲁氏菌阳性；被检样品同时扩增出大小为222bp、615bp、932bp的目的条带，表明该样品中牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌均阳性。

作为本发明进一步的方案：所述的多重PCR反应体系包括：引物F1、引物R1各1.5μL，引物F2为1.5μL，引物F3为2μL，引物R2为4μL，待检测样品DNA 1μL，Taq酶1μL，GC Enhancer 5μL，dNTP 4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O补满50μL。

作为本发明进一步的方案：所述的引物的浓度配比为10pmol/μL。

作为本发明进一步的方案：所述的dNTP的浓度为2.5mmol/L。

作为本发明进一步的方案：所述的多重PCR反应的条件为：94℃预变性10min，94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸90sec，共35个循环；72℃延伸10min。

作为本发明进一步的方案：在反应结束后，4℃保存反应产物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了一种快速的能同时检测牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR诊断方法，其所设计的引物对具有较高的特异性和交叉特异性，可以被广泛应用到牛、羊布鲁氏菌病的诊断中。

附图说明

图1是引物特异性的PCR扩增产物电泳图；其中M为DNA分子量标准；a泳道依次为牛、羊种布鲁氏菌通用布鲁氏菌属引物对牛种布鲁氏菌的PCR；b泳道依次为牛、羊种布鲁氏菌通用布鲁氏菌属引物对羊种布鲁氏菌的PCR；c泳道为牛种布鲁氏菌牛种特异性引物对牛种布鲁氏菌的PCR；d泳道为羊种布鲁氏菌羊种特异性引物对羊种布鲁氏菌的PCR；e泳道为空白对照；

图2是引物交叉特异性的PCR扩增产物电泳图；其中M为DNA分子量标准；a泳道为牛种布鲁氏菌牛种特异性引物对牛种布鲁氏菌的PCR；b泳道为牛种布鲁氏菌牛种特异性引物对羊种布鲁氏菌的PCR；c泳道为羊种布鲁氏菌牛种特异性引物对牛种布鲁氏菌的PCR；d泳道为羊种布鲁氏菌牛种特异性引物对羊种布鲁氏菌的PCR；e泳道为空白对照；

图3是本发明多重PCR扩增的电泳图；其中M为DNA分子量标准；a泳道为牛种布鲁氏菌的多重PCR；b泳道为羊种布鲁氏菌的多重PCR；c泳道为牛、羊种布鲁氏菌混合物的多重PCR；d泳道为空白对照；

图4是本发明检测乳样的电泳图；其中M为DNA分子量标准；a泳道为阳性对照PCR；b～t泳道分别为乳样1～19的PCR；u泳道为空白对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，一种牛、羊的布鲁氏菌的多重PCR检测方法，首先根据GenBank登录的BCPS31基因序列和IS711在牛、羊种布鲁氏菌基因组中插入位置的不同，应用Primer 5.0软件分别设计布鲁氏菌属特异性引物和牛、羊种布鲁氏菌特异性引物。

布鲁氏菌属特异性引物(222bp)：

上游引物：F1：5’-CGC TTG CCT TIC AGG TCTG-3’，如SEQ ID NO：1所示；

下游引物：R1：5’-TGG CTC GGT TGC CAA TATCA-3’，如SEQ ID NO：2所示。

牛、羊种布鲁氏菌特异性引物(615bp、932bp)：

牛上游引物：F2：5’-ATC AGG ACA AGG ACG AACG-3’，如SEQ ID NO：3所示；

羊上游引物：F3：5’-GAT AAT CAT CCA CCA CCT TG-3’，如SEQ ID NO：4所示；

公用下游引物：R2：5’-GCT GCG AAT AAA GCC AAC-3’，如SEQ ID NO：5所示。

请参阅图1～4，本发明从以下具体实施步骤进行试验：

1、引物特异性验证

用布鲁氏菌属引物扩增牛、羊种布鲁氏菌的基因组DNA模板，用牛种布鲁氏菌的引物扩增牛种布鲁氏菌的基因组DNA模板，用羊种布鲁氏菌的引物扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA模板。

PCR反应体系(50μL)：上下游引物各2μL(10pmol/μL)，模板DNA 2μL，Taq酶1μL，dNTPs(2.5m Mg)4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O补满至50μL。

反应条件：95℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸90sec，共35个循环。72℃延伸10min。4℃保存。取5μL PCR产物，进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

2、引物交叉特异性分析

用牛种布鲁氏菌的引物分别扩增牛、羊种布鲁氏菌的基因组DNA模板，观察牛种布鲁氏菌的引物是否特异性扩增牛种布鲁氏菌；同时，用羊种布鲁氏菌的引物分别扩增牛、羊种布鲁氏菌的基因组DNA模板，观察羊种布鲁氏菌的引物是否特异性扩增羊种布鲁氏菌。

反应条件同上。

3、多重PCR条件优化

分别对Taq酶、PCR Buffer和dNTP的用量，引物浓度配比，PCR反应的退火温度(50～60℃)，及循环数(25～40个)进行优化，确定最佳反应条件。

4、结果

(1)引物特异性的扩增产物的电泳结果如图1所示，由图可知：本发明所设计的三 对引物均具有较高的特异性。

(2)引物交叉特异性的扩增产物的电泳结果如图2所示，由图可知：本发明所设计的三对引物均具有较高的交叉特异性。

(3)多重PCR条件优化结果如下：

最终确定多重PCR最佳反应体系为：引物(10pmol/μL)F1、R1各1.5μL、F2为1.5μL、F3为2μL、R2为4μL，牛、羊种布鲁菌基因组DNA模板各1μL(检测临床样品时根据所提核算浓度灵活掌握)，Taq酶1μL，GC Enhancer 5μL，dNTP(2.5mmol)4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O补满50μL。

最终确定最佳反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸90sec，共35个循环。72℃延伸10min。4℃保存。

在上述多重PCR最佳反应体系以及最佳反应条件下，分别将牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌与羊种布鲁氏菌混合物作为模板，在每个扩增体系中均同时加入引物对，进行PCR扩增。扩增产物的电泳结果如图3所示。由图可知，在以牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌为模板的扩增产物中，均可以得到两条特异性条带；在以牛种布鲁氏菌与羊种布鲁氏菌混合物为模板的扩增产物中，可以得到三条特异性条带；说明利用本发明的引物组进行多重PCR可以用于对牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌进行同步检测，并且，检测结果精确可信。

(4)验证：

用建立的多重PCR方法对19份乳样(布鲁氏菌病血清抗体虎红平板凝集、试管凝集检测均为阳性的牛乳样)的核酸提取物按照上述方法进行扩增，扩增产物的电泳结果如图4所示。由图可知，19份均为布鲁氏菌属PCR阳性，其中15份(1、2、4、5、6、7、10～18)为牛种布鲁氏菌，4份(3、8、9、19)为其他种布鲁菌。

5、分析

用所建立的多重PCR方法对19份乳样(布鲁氏菌病血清抗体虎红平板凝集、试管凝集均为阳性)的核酸提取物进行扩增，所有样品均检出布鲁氏菌属阳性，部分样品检出牛 种布鲁氏菌阳性，未检出羊种布鲁氏菌阳性样品，因此该检测方法有一定的使用价值。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。