抗PCSK9抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，本发明提供抗原性多肽，其可以用于产生能够结合PCSK9衍生的分子的抗体。本发明还涉及以高亲和力与PCSK9特异性结合的抗体或其功能性片段。本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其功能性片段的生产方法。本发明还提供了包含本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用本发明的抗体或其功能性片段治疗多种疾病(包括血脂异常及相关心血管疾病)的方法。
背景技术：
：家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia,FH)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病，有家族性的特征，具有多种临床表现；FH是脂质代谢单基因疾病中最严重的一种，又称LDL受体病或高脂蛋白血症IIa型，是儿童时期最常见的遗传性高脂血症，是冠状动脉疾病的一种重要危险因素。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的显著提高是该疾病的重要标志，因此，抑制肝细胞LDLR的降解，增强LDLR对LDL的摄取，可以延缓动脉粥样硬化进展，降低患病的风险。在排除LDLR，apoB基因突变的ADH患者家族中检测到PCSK9存在基因突变(S127R,F216L)，首次阐明了PCSK9对于脂质代谢的影响(Abifadel,Varretetal.2003)。目前，PCSK9是血脂异常的新型治疗靶点，具有良好的应用前景。前蛋白转化酶枯草杆菌酶/kexin9(PCSK9)，又可称为神经凋亡调节转化酶(NARC-1),属于Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第九个成员，由692个氨基酸残基组成，主要存在于肝脏、肾脏及小肠等，由肝实质细胞，间充质细胞，及结肠表皮细胞等表达，并且作为一个分泌性蛋白存在于血液中(Seidah,Benjannetetal.2003)。PCSK9由PCSK9基因编码，其基因位于人常染色体的lp33-p34.3，主要在内质网中合成，其首先形成一个72KDa的非活性前体结构，然后经过自动催化，在第152位与第153位残基处裂解，形成了14KDa的前体结构域，以及包含催化结构域和C端结构域的57KDa成熟片段(Benjannet,Rhaindsetal.2004)。前体结构域以非共价键形式结合于催化结构域上，是成熟片段正确折叠并从内质网中运出所必需的。PCSK9基因突变可以分为功能获得型(D347Y、S127R、F216L、L82X、Y142X等)和功能缺失型(R46L、Y142X、C679)(Abifadel,Varretetal.2003)，其中，功能获得型突变体通过与不同蛋白的协同作用，改变了PCSK9的亲和力或增强蛋白水解酶对PCSK9自身裂解的敏感度，增强PCSK9对LDLR的降解，从而导致血液中的LDL-c水平升高，诱导ADH或早发性动脉粥样硬化性疾病。研究发现，PCSK9不仅对肝实质细胞及神经细胞的分化具有重要影响(Seidah,Benjannetetal.2003)，同时调节低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达，从而参与胆固醇的合成与代谢。研究发现将纯化的PCSK9蛋白加入HepG2细胞培养基中，其细胞表面的LDLR减少，并呈现出剂量依赖效应(Lagace,Curtisetal.2006)，而肝脏细胞过度表达PCSK9的小鼠，其LDLR的水平显著降低，但LDLRmRNA表达水平并未降低(Lambert,Charltonetal.2009)，因此PCSK9是通过转录后机制调节LDLR水平的。LDLR分子由5个主要的结构域组成，首先是一个富含半胱氨酸的配体结合区，其次是一个表皮生长因子(EGF)前体同源结构域，包括三个EGF样重复序列(EGF-A,EGF-B,EGF-C)和一个β螺旋结构，一个糖结构域，一个跨膜结构域，及胞质尾区含有受体内化所必需的序列。2007年，关于PCSK9介导LDLR降解的分子机制学研究取得了突破性进展，研究发现，PCSK9分泌至血浆，能够与LDLR胞外结构域结合并内化，促进了后者在溶酶体中的降解(Zhang,Lagaceetal.2007)。进一步的研究发现，在细胞表面中性pH环境中，PCSK9能够与LDLR胞外段的EGF-A结合，内吞进入细胞，在细胞低pH环境中，PCSK9的C端结构域能够与LDLR的配体结构域结合，从而使LDLR在溶酶体中被降解，无法返回细胞膜(Fisher,Surdoetal.2007)。综上所述，PCSK9目前已成为血脂异常及相关心血管疾病的重要靶点，而针对其的单克隆抗体具有广阔的应用前景。技术实现要素：本发明要解决的问题本发明的一个目的是，提供用于对血脂异常相关靶点的抗体和所述抗体的功能片段，使用所述抗体或抗体功能片段治疗血脂异常的方法等。解决问题的手段为了实现上述目的，本发明的发明人做了深入研究，由此他们发现了特异性地结合PCSK9并抑制了PCSK9与LDLR的结合，从而增加了LDL-c的吸收的抗体，并从而完成了本发明。即JS002，本发明包括以下发明。在一方面本发明提供了能够结合前蛋白转化酶枯草杆菌酶/kexin9(PCSK9)的抗PCSK9抗体及其功能性片段，其包含选自氨基酸序列SEQIDNO:4,5,6,10,11,12,16,17,18,22,23,24,28,29,30或任何所述序列之变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO:1,2,3,7,8,9,13,14,15,19,20,21,25,26,27或任何所述序列之变体的轻链CDR。在另一方面，本发明进一步提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，其中所述重链CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：HCDR1HCDR2HCDR3ASEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6BSEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12CSEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18DSEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24ESEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30和/或所述轻链CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：LCDR1LCDR2LCDR3ASEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3BSEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9CSEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15DSEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21ESEQIDNO:25SEQIDNO:26SEQIDNO:27在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，其重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区为SEQIDNO:32或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:31或其变体，或者所述重链可变区为SEQIDNO:34或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:33或其变体，或者所述重链可变区为SEQIDNO:36或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:35或其变体，或者所述重链可变区为SEQIDNO:38或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:37或其变体，或者所述重链可变区为SEQIDNO:40或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:39或其变体。在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在另一方面，本发明提供了编码本发明的能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子，及包含所述核酸分子的表达载体或宿主细胞。在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明所述的能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，编码本发明的能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子及表达载体或宿主细胞，或它们的任意组合，以及可药用的载体。在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，或编码其的核酸分子，或表达载体或宿主细胞在制备用于治疗血脂异常及相关心血管疾病，包括高脂血症或高胆固醇血症等疾病的药物中的用途。在另一方面，本发明提供了能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，或编码其的核酸分子，或表达载体或宿主细胞在制备用于促进细胞对LDL吸收的药物中的用途。(根据
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的描述理解为：PCSK9能够结合LDLR导致LDLR减少，进而导致LDL被细胞的吸收变少，造成血脂升高，而PCSK9抗体可以中和PCSK9，从而逆转此过程，促进细胞对LDL吸收，降低血脂)在另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的本发明所述的能够结合PCSK9的抗体或其功能性片段，优选地所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。附图说明图1人PCSK9的SDS-PAGE电泳图图2Elisa检测人PCSK9与LDLR的结合图3FACS检测人PCSK9与LDLR的结合图4FACS验证人PCSK9与LDLR的结合图5FACS检测候选杂交瘤细胞与人PCSK9的结合图6鼠源抗体与PCSK9D347Y结合实验(抗原包被)图7鼠源抗体与PCSK9D347Y结合实验(抗体包被)图8鼠源抗体于参照抗体竞争结合PCSKD347Y抗原表位实验图9鼠源抗体对HepG2细胞LDL吸收的影响图10嵌合抗体与人PCSK9的结合图11嵌合抗体对HepG2细胞对LDL吸收的影响图12人源化抗体与人PCSK9的结合图13人源化抗体对HepG2细胞对LDL吸收的影响图14人源化抗体能有效降低食蟹猴体内的LDL-c水平具体实施方式除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本发明提供了能够结合前蛋白转化酶枯草杆菌酶/kexin9(PCSK9)的抗PCSK9抗体及其功能性片段。本发明的抗体或其功能性片段具有以下特性的至少一种：能够以高亲和力阻断PCSK9和LDLR的相互作用；能够与PCSK9以高特异性结合。本发明还提供了人源化抗PCSK9抗体及其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到，并且根据其与不同物种的PCSK9蛋白的结合特性，其结合表位也相应被鉴定。本发明所述的人源化抗PCSK9抗体及其功能性片段除具备上述抗PCSK9抗体及其功能性片段的有利特性外，不仅以高亲和力结合人或食蟹猴PCSK9蛋白，还与鼠源PCSK9蛋白相互作用。在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗PCSK9抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有EGFR结合活性。优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重或轻可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于PCSK9，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。本领域技术人员可以将编码本发明所述抗PCSK9抗体的DNA分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了一种重组DNA载体，其含有编码本发明所述抗PCSK9抗体的DNA分子。优选地，所述重组DNA载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述抗体的DNA分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得抗体。本发明的表达载体含有编码抗PCSK9抗体的重链可变区、轻链可变区和/或恒定区的DNA序列。然而，也可有分别构建两种表达载体，一种含有重链可变区和恒定区，另一种含有轻链可变区和恒定区，共同转染哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，所述表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的DNA序列，以及至少一种用于筛选的抗药基因。本发明所述宿主细胞可以为其为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞，可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。在一个相关方面，本发明提供了为抗PCSK9抗体与第二治疗剂的组合的药物组合物。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与抗PCSK9抗体组合的任意试剂。可有利地与抗PCSK9抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制PCSK9活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰PCSK9上游或下游信号转导的试剂。本文使用的术语“通过消除、抑制或降低PCSK9活性来预防或治疗疾病或病症”旨在表示由PCSK9表达所导致或者以PCSK9表达为症状/特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自高脂血症或高胆固醇血症。本文使用的“治疗有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。一方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQIDNO:4,5,6,10,11,12,16,17,18,22,23,24,28,29,30或任何所述序列之变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO:1,2,3,7,8,9,13,14,15,19,20,21,25,26,27或任何所述序列之变体的轻链CDR。在一些优选的实施方案中，所述抗体或其功能性片段的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：HCDR1HCDR2HCDR3ASEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6BSEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12CSEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18DSEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24ESEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30和/或其轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：LCDR1LCDR2LCDR3ASEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3BSEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9CSEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15DSEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21ESEQIDNO:25SEQIDNO:26SEQIDNO:27在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：在一些实施方案中，本发明抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:32或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:31或其变体。在另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:34或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:33或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:36或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:35或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:38或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:37或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:40或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:39或其变体。本发明的抗体或其功能性片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。本发明的抗体或其功能性片段可以是人源化的。制备人源化抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过将本发明的CDR序列转移至人抗体可变区中来制备本发明的人源化抗PCSK9抗体。所述人源化抗体不会产生抗抗体反应(AAR)和人抗鼠抗体反应(HAMA)，不会因被抗抗体中和而被快速清除，并且具有免疫效应功能。在一些优选的实施方案中，本发明的人源化抗PCSK9抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在本发明人源化抗体或其功能性片段的一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:32或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:31或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:34或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:33或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:36或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:35或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:38或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:37或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:40或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:39或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:47或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:45或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为SEQIDNO:49或其变体并且所述轻链可变区为SEQIDNO:45或其变体。本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的分离的核酸分子。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQIDNO:48、50和/或46所示的核苷酸序列或其组合。本发明还提供了包含所述核酸分子的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。本发明提供了产生抗PCSK9抗体或其功能性片段的方法，其包括：在允许产生所述抗体或其功能性片段的条件下培养本发明的上述宿主细胞，以及回收因此产生的所述抗体或其功能性片段。在另一方面，本发明涉及包含与治疗剂缀合的本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物。所述治疗剂优选地为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。本发明还涉及包含本发明抗体或其功能性片段以及可药用载体的药物组合物。在另一方面，本发明提供了用于通过消除、抑制或降低PCSK9活性来预防或治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明抗体或其功能性片段，核酸，表达载体，宿主细胞，免疫缀合物或药物组合物。本发明还提供了本发明的抗体或其功能性片段、核酸、表达载体、宿主细胞、免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。实施例实施例1.克隆人PCSK9胞外区及LDLR胞外区入真核表达系统以已知序列的人PCSK9基因cDNA(北京义翘神舟)为模板(模板序列如下)，上游引物5'-GTACACTAGTCACCATGGGCACCGTCAGCTC-3',下游引物为5'-GATCCTCGAGCCTGGAGCTCCTGGGAGG-3',PCR扩增人PCSK9胞外片段。扩增产物经speI和XhoI双酶切后，克隆到自主构建的真核表达质粒系统(pSecCAGA2ECD)中。以此质粒通过PEI转染293E细胞，6天后，收集培养基上清液，通过亲和层析纯化人PCSK9胞外区蛋白。以此类似，分别以上游引物5‘-GTACGCTAGCCACCATGGGGCCCTGGGGCTG-3’SEQIDNO:43,下游引物5'-GATCCTCGAGCCCTCACGCTACTGG-3'SEQIDNO:44,PCR扩增LDLR胞外片段，扩增产物在经NheI和XhoI双酶切后，克隆到自主构建的真核表达质粒系统中。以此质粒，通过PEI转染293E细胞，6天后，收集培养基上清液，纯化LDLR胞外区。如图1所示：人PCSK9胞外区蛋白的SDS-PAGE电泳图。人PCSK9胞外区核苷酸序列：SEQIDNO:41ATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTG61CTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAG121CTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACC181ACAGCCACCTTCCACCGCTGCGCCAAGGATCCGTGGAGGTTGCCTGGCACCTACGTGGTG241GTGCTGAAGGAGGAGACCCACCTCTCGCAGTCAGAGCGCACTGCCCGCCGCCTGCAGGCC301CAGGCTGCCCGCCGGGGATACCTCACCAAGATCCTGCATGTCTTCCATGGCCTTCTTCCT361GGCTTCCTGGTGAAGATGAGTGGCGACCTGCTGGAGCTGGCCTTGAAGTTGCCCCATGTC421GACTACATCGAGGAGGACTCCTCTGTCTTTGCCCAGAGCATCCCGTGGAACCTGGAGCGG481ATTACCCCTCCACGGTACCGGGCGGATGAATACCAGCCCCCCGACGGAGGCAGCCTGGTG541GAGGTGTATCTCCTAGACACCAGCATACAGAGTGACCACCGGGAAATCGAGGGCAGGGTC601ATGGTCACCGACTTCGAGAATGTGCCCGAGGAGGACGGGACCCGCTTCCACAGACAGGCC661AGCAAGTGTGACAGTCATGGCACCCACCTGGCAGGGGTGGTCAGCGGCCGGGATGCCGGC721GTGGCCAAGGGTGCCAGCATGCGCAGCCTGCGCGTGCTCAACTGCCAAGGGAAGGGCACG781GTTAGCGGCACCCTCATAGGCCTGGAGTTTATTCGGAAAAGCCAGCTGGTCCAGCCTGTG841GGGCCACTGGTGGTGCTGCTGCCCCTGGCGGGTGGGTACAGCCGCGTCCTCAACGCCGCC901TGCCAGCGCCTGGCGAGGGCTGGGGTCGTGCTGGTCACCGCTGCCGGCAACTTCCGGGAC961GATGCCTGCCTCTACTCCCCAGCCTCAGCTCCCGAGGTCATCACAGTTGGGGCCACCAAT1021GCCCAGGACCAGCCGGTGACCCTGGGGACTTTGGGGACCAACTTTGGCCGCTGTGTGGAC1081CTCTTTGCCCCAGGGGAGGACATCATTGGTGCCTCCAGCGACTGCAGCACCTGCTTTGTG1141TCACAGAGTGGGACATCACAGGCTGCTGCCCACGTGGCTGGCATTGCAGCCATGATGCTG1201TCTGCCGAGCCGGAGCTCACCCTGGCCGAGTTGAGGCAGAGACTGATCCACTTCTCTGCC1261AAAGATGTCATCAATGAGGCCTGGTTCCCTGAGGACCAGCGGGTACTGACCCCCAACCTG1321GTGGCCGCCCTGCCCCCCAGCACCCATGGGGCAGGTTGGCAGCTGTTTTGCAGGACTGTG1381TGGTCAGCACACTCGGGGCCTACACGGATGGCCACAGCCATCGCCCGCTGCGCCCCAGAT1441GAGGAGCTGCTGAGCTGCTCCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAGCGGCGGGGCGAGCGCATG1501GAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTC1561TACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCA1621CCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACA1681GGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGG1741CCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGC1801TGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAG1861CAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGG1921ACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGAC1981GTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGAGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGG2041AGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTGALDLR胞外区核苷酸序列：SEQIDNO:42ATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGCAGTGGGCGACAGATGCGAAAGAAACGAGTTCCAGTGCCAAGACGGGAAATGCATC121TCCTACAAGTGGGTCTGCGATGGCAGCGCTGAGTGCCAGGATGGCTCTGATGAGTCCCAG181GAGACGTGCTTGTCTGTCACCTGCAAATCCGGGGACTTCAGCTGTGGGGGCCGTGTCAAC241CGCTGCATTCCTCAGTTCTGGAGGTGCGATGGCCAAGTGGACTGCGACAACGGCTCAGAC301GAGCAAGGCTGTCCCCCCAAGACGTGCTCCCAGGACGAGTTTCGCTGCCACGATGGGAAG361TGCATCTCTCGGCAGTTCGTCTGTGACTCAGACCGGGACTGCTTGGACGGCTCAGACGAG421GCCTCCTGCCCGGTGCTCACCTGTGGTCCCGCCAGCTTCCAGTGCAACAGCTCCACCTGC481ATCCCCCAGCTGTGGGCCTGCGACAACGACCCCGACTGCGAAGATGGCTCGGATGAGTGG541CCGCAGCGCTGTAGGGGTCTTTACGTGTTCCAAGGGGACAGTAGCCCCTGCTCGGCCTTC601GAGTTCCACTGCCTAAGTGGCGAGTGCATCCACTCCAGCTGGCGCTGTGATGGTGGCCCC661GACTGCAAGGACAAATCTGACGAGGAAAACTGCGCTGTGGCCACCTGTCGCCCTGACGAA721TTCCAGTGCTCTGATGGAAACTGCATCCATGGCAGCCGGCAGTGTGACCGGGAATATGAC781TGCAAGGACATGAGCGATGAAGTTGGCTGCGTTAATGTGACACTCTGCGAGGGACCCAAC841AAGTTCAAGTGTCACAGCGGCGAATGCATCACCCTGGACAAAGTCTGCAACATGGCTAGA901GACTGCCGGGACTGGTCAGATGAACCCATCAAAGAGTGCGGGACCAACGAATGCTTGGAC961AACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGC1021CCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGATATCGATGAGTGTCAGGAT1081CCCGACACCTGCAGCCAGCTCTGCGTGAACCTGGAGGGTGGCTACAAGTGCCAGTGTGAG1141GAAGGCTTCCAGCTGGACCCCCACACGAAGGCCTGCAAGGCTGTGGGCTCCATCGCCTAC1201CTCTTCTTCACCAACCGGCACGAGGTCAGGAAGATGACGCTGGACCGGAGCGAGTACACC1261AGCCTCATCCCCAACCTGAGGAACGTGGTCGCTCTGGACACGGAGGTGGCCAGCAATAGA1321ATCTACTGGTCTGACCTGTCCCAGAGAATGATCTGCAGCACCCAGCTTGACAGAGCCCAC1381GGCGTCTCTTCCTATGACACCGTCATCAGCAGGGACATCCAGGCCCCCGACGGGCTGGCT1441GTGGACTGGATCCACAGCAACATCTACTGGACCGACTCTGTCCTGGGCACTGTCTCTGTT1501GCGGATACCAAGGGCGTGAAGAGGAAAACGTTATTCAGGGAGAACGGCTCCAAGCCAAGG1561GCCATCGTGGTGGATCCTGTTCATGGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGAACTCCTGCC1621AAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACTGAAAACATT1681CAGTGGCCCAATGGCATCACCCTAGATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCC1741AAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAG1801GATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGGACAAAGTATTTTGG1861ACAGATATCATCAACGAAGCCATTTTCAGTGCCAACCGCCTCACAGGTTCCGATGTCAAC1921TTGTTGGCTGAAAACCTACTGTCCCCAGAGGATATGGTTCTCTTCCACAACCTCACCCAG1981CCAAGAGGAGTGAACTGGTGTGAGAGGACCACCCTGAGCAATGGCGGCTGCCAGTATCTG2041TGCCTCCCTGCCCCGCAGATCAACCCCCACTCGCCCAAGTTTACCTGCGCCTGCCCGGAC2101GGCATGCTGCTGGCCAGGGACATGAGGAGCTGCCTCACAGAGGCTGAGGCTGCAGTGGCC2161ACCCAGGAGACATCCACCGTCAGGCTAAAGGTCAGCTCCACAGCCGTAAGGACACAGCAC2221ACAACCACCCGACCTGTTCCCGACACCTCCCGGCTGCCTGGGGCCACCCCTGGGCTCACC2281ACGGTGGAGATAGTGACAATGTCTCACCAAGCTCTGGGCGACGTTGCTGGCAGAGGAAAT2341GAGAAGAAGCCCAGTAGCGTGAGGG实施例2.ELISA检测人PCSK9重组蛋白与LDLR的结合2.1生物素标记人PCSK9重组蛋白将人PCSK9重组蛋白与溶解于DMSO中的生物素-xx-NHS以1：10比例混合，4摄氏度放置2小时，将反应混合物通过10kD的超滤柱以分离生物素标记的人PCSK9和游离的生物素。2.2ELISA检测生物素标记人PCSK9与LDLR的结合为检验人PCSK9与LDLR的结合能力，在96孔酶标板上，铺板1μg/ml的LDLR在包被缓冲液中，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入100μl不同浓度的生物素标记的人PCSK9，室温孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，用洗涤缓冲液以1比10000倍稀释HRP交联羊抗小鼠抗体，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入50μlTMB底物溶液显色，室温反应8分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。从图2可以看出，人PCSK9重组蛋白能特异性地与LDLR结合，且呈现剂量依赖性。实施例3.细胞水平检测PCSK9与LDLR的结合3.1构建293F-LDLR稳转细胞株将构建的带puromycin筛选体系的LDLR全长序列的真核表达质粒通过PEI转染至293F贴壁细胞中。转染后24h后，通过puromycin(2μg/ml)进行筛选，直至形成293F-LDLR稳转细胞库。同时通过有限稀释法，按每孔0.8个细胞，铺96孔板，15天后，挑选出293F-LDLR单克隆，并进行传代，形成293F-LDLR稳转细胞株。3.2生物素标记的人PCSK9D347Y与293F-LDLR稳转细胞株的结合将不同浓度生物素标记的人PCSK9D347Y重组蛋白和293F-LDLR稳转细胞混合，在4摄氏度孵育15分钟。以FACSbuffer(20mMTris,100mMNaCl,2mMCa2+,1％FBS,pH7.4)洗脱3次后，加入straptavidinallophycocyanin(SA-APC，2μg/ml)在4摄氏度孵育20分钟。以FACSbuffer洗脱3次后上细胞流式仪检测。如图3所示，构建的人PCSK9D347Y重组蛋白能够特异性地与293F-LDLR细胞上的LDLR结合，并且呈现出剂量依赖效应。3.3生物素标记的人PCSK9与HepG2细胞上LDLR的结合为进一步验证hPCSK9与LDLR的结合能力，将不同浓度生物素标记的人PCSK9D347Y重组蛋白和HepG2细胞混合，在4摄氏度孵育15分钟。以PBS洗脱3次后，加入straptavidinallophycocyanin(SA-APC2μg/ml)在4摄氏度孵育20分钟。以FACSbuffer洗脱3次后上细胞流式仪检测。如图4所示，与上述结果一致，人PCSK9重组蛋白能特异性结合HepG2细胞上的LDLR。实施例4.抗PCSK9鼠源抗体的制备4.1免疫动物将人PCSK9重组蛋白作为抗原与等量免疫佐剂(福氏佐剂)混合，取5只6周大雌性FVB小鼠进行免疫。在初次免疫以后，每周进行一次加强免疫，共进行四次免疫。4.2细胞融合在最后一针加强免疫后，取小鼠大腿根处淋巴结，在生理盐水中碾磨后取富含淋巴细胞的悬浮液，按常规电转方法将其与SP20细胞融合。将融合细胞分配于96孔中，在含有HAT的RPMI-1640完全培养基中，置于5％CO2，37摄氏度条件下培养。实施例5.配体和受体封闭实验在20000个不同单克隆杂交瘤细胞中，通过酶标反应，筛选出1220个分泌的抗体可结合人PCSK9蛋白的克隆。在这1220个抗体中，其中有15个具备抑制生物素标记的人PCSK9与HepG2上LDLR的结合的能力。我们集中在抑制能力前五个进行后续实验。将上述五株杂交瘤细胞的上清与生物素标记的人PCSK9(400ng/ml)混合，室温孵育20分钟。然后将混合物与293F-LDLR稳转细胞株在37摄氏度孵育15分钟，以PBS洗脱3次后，加入0.2μg/ml的SA-APC并在4摄氏度孵育15分钟。以PBS洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证杂交瘤细胞分泌的抗体是否可以抑制人PCSK9与293F-LDLR细胞表面的LDLR结合。以此类似，以参照抗体-抗PCSK9单克隆抗体(merck)为对照，按4μg/ml的浓度进行上述实验。如图5，流式结果显示，与参照抗体一致，候选五株单克隆候选抗体3G12,1A5及1B5，1B11及2B12均能够有效结合人PCSK9，从而抑制其对LDLR的降解。实施例6.与不同种属PCSK9间的交叉反应通过ELISA检测单克隆鼠源候选抗体3G12,1A5及1B5，1B11及2B12与人源PCSK9、鼠源PCSK9及食蟹猴源PCSK9之间的交叉反应。实验结果显示，与其他公司报导的抗PCSK9抗体不同，我们制备的抗PCSK9鼠源抗体能够与不同种属的PCSK9产生交叉反应，这将有利于动物实验的进行，节约时间成本。实验结果如表1所示：表1样品3G121A51B51B112B12种属交叉结合h/m/cyh/m/cyh/m/cyh/cyh/m/cyh:人源；m:鼠源；cy:食蟹猴源实施例7.与人PCSK9重组蛋白的结合常数测定如表2所示，通过ForteBio仪器测定不同的鼠源抗体与hPCSK9之间的结合常数。说明制备的鼠源抗体能够特异性结合人PCSK9。表2样品3G121A51B51B112B12KD(nM)0.280.910.904.70.49实施例8.鼠源候选抗体与人PCSK9的结合96孔酶标板铺板，4μg/ml的streptavidin包被，37摄氏度恒温孵育90分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素标记的人PCSK9，37摄氏度孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入不同稀释倍数的嵌合抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：5000倍稀释HPR标记的mouseanti-humanIgG(H+L)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μlTMB底物溶液显色，室温反应10分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。从图6可以看出，鼠源抗体能特异性地与人PCSK9结合，且与参照抗体相比，2B12，3G12具有更好的结合力。为进一步验证抗体与人PCSK9的特异性结合，与上述实验类似，将抗体(1μg/ml)铺板在96孔中，37摄氏度孵育60分钟，然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入100μl不同浓度的生物素标记的PCSK9，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1比5000倍稀释的HRP-strep，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μlTMB底物溶液显色，室温反应10分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。结果如图7所示，鼠源抗体与人PCSK9的结合情况与上一实验一致。在此基础上，我们进一步设计实验比较了不同鼠源抗体结合人PCSK9抗原表位的异同：4μg/ml的streptavidin包被，37摄氏度恒温孵育90分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素标记的人PCSK9，37摄氏度孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入以200ng/ml参照单克隆抗体进行稀释的不同稀释倍数的嵌合抗体，37摄氏度孵育90min，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：5000倍稀释HPR标记的goatanti-humanIgG-Fc，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μlTMB底物溶液显色，室温反应10分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。如图8所示，1B11、2B12不能显著竞争参照抗体结合人PCSK9的抗原表位，而1A5、1B5、3G12能显著竞争结合人PCSK上参照单克隆抗体结合的抗原表位，说明1A5、1B5、3G12竞争结合力(IC50值)显著强于对照抗体。实施例9.对HepG2细胞的LDL吸收的影响将不同稀释倍数的抗体与生物素标记的人PCSK9-D347Y(2.5μg/ml)在室温孵育1小时，然后与FL-LDL(5μg/ml)混合后加入到HepG2细胞中，37摄氏度孵育3小时，PBS洗三次，然后用TecanSafire2进行荧光检测(Ex514nm/Em570nm)。由图9和表3结果可见，不同的鼠源单克隆抗体能与人PSCK9结合，从而抑制其对LDL吸收的影响。其IC50值在1μg/mL左右。表3sample3G12参照抗体IC50(nM)5.59.9实施例10.候选抗体可变区序列的获得培养候选杂交瘤细胞，1000rpm离心收集细胞，并以Trizol提取总RNA。以此为模板，合成第一链cDNA后，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的可变区DNA序列(JonesandBendig1991)。在50μl反应体系中,分别加入cDNA1μl,10×PCR缓冲液5μl,上游及下游引物各1μl(25pmol),dNTP1μl,25mmolPLMgCl21μl,H2O39μl,95℃预变性10min,加Taq酶1μl,进入温度循环,进行PCR扩增。反应条件为94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸15s,共32个循环,然后72℃保温10min。将扩增产物测序后，得到候选杂交瘤重链和轻链可变区序列为：1A5LCSEQIDNO:31DIQMTQSPSSLSASLGDKVTITCKASQDINKYIDWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCVQYDDLWTFGGGTKLEIKSEQIDNO:1LCDR1：KASQDINKYIDSEQIDNO:2LCDR2：YTSTLQPSEQIDNO:3LCDR3：VQYDDLWT1A5HCSEQIDNO:32QVQLKQSGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCANHRDWGQGTLVTVSASEQIDNO:4HCDR1：SYGVHSEQIDNO:5HCDR2：VIWRGGSTDYNAAFMSSEQIDNO:6HCDR3：HRD3G12LCSEQIDNO:33DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIDWYQHKPGKSPRLLIHYASTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDDLWTFGGGTKLEIKSEQIDNO:7LCDR1：KASQDINKYIDSEQIDNO:8LCDR2：YASTLQPSEQIDNO:9LCDR3：LQYDDLWT3G12HCSEQIDNO:34QVQLKQSGPSLLQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGITDYNAPFMSRLNITKDNSKNQVFFKMNSLQVDDTAIYYCANHRDWGQGTLVTVSASEQIDNO:10HCDR1：SYGIHSEQIDNO:11HCDR2：VIWRGGITDYNAPFMSSEQIDNO:12HCDR3：HRD1B5LCSEQIDNO:35DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTTSNQGSGVRARLSGSGCGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKSEQIDNO:13LCDR1：RASESVDNYGISFMNSEQIDNO:14LCDR2：TTSNQGSSEQIDNO:15LCDR3：QQSKEVPYT1B5HCSEQIDNO:36DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKVEWMGYISYSGSSSYNPSLKGRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARFYYRFDAYFDSWGQGTTLTVSSSEQIDNO:16HCDR1：SDYAWNSEQIDNO:17HCDR2：YISYSGSSSYNPSLKGSEQIDNO:18HCDR3：FYYRFDAYFDS2B12LCSEQIDNO:37DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSLMHWYQHKPGQTPKLLIYSGSNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSREVPSTFGGGTKLEIKSEQIDNO:19LCDR1：RASESVEYYGTSLMHSEQIDNO:20LCDR2：SGSNVESSEQIDNO:21LCDR3：QQSREVPST2B12HCSEQIDNO:38DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVITEDTATYYCARREGHYSWFPYWGQGTLVTVSASEQIDNO:22HCDR1：SDYAWNSEQIDNO:23HCDR2：YISYSGTTNYNPSLKSSEQIDNO:24HCDR3：REGHYSWFPY1B11LCSEQIDNO:39DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQENSPQLLVYNAYTLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKIISLQPEDFGNYYCQHHYRTPPTFGGGTKLEIKSEQIDNO:25LCDR1：RASENIYSYLASEQIDNO:26LCDR2：NAYTLADSEQIDNO:27LCDR3：QHHYRTPPT1B11HCSEQIDNO:40QVQLQQSGAVLVRPGTSIKVSCKASGYAFTNYLIEWIKKRPGQGLEWIGMINPGSGDTNFNEKFKAKATLTADKSSTTAYMQLNSLTFDDSAVYFCARSSQLGLPYWGQGTLVTVSASEQIDNO:28HCDR1：NYLIESEQIDNO:29HCDR2：MINPGSGDTNFNEKFKASEQIDNO:30HCDR3：SSQLGLPY实施例11.构建嵌合抗体表达载体从人血细胞(北京血液研究所)中克隆重链恒定区Fc片段和轻链k/￡恒定区，联入pCDNA3.1质粒以加以改造。上述重链和轻链序列片段由Genscript公司合成，重链经BspqI酶切，轻链片段经BspqI酶切后，联入相对应改造的pCDNA3.1质粒中，并经测序确定正确克隆。后续的实验材料均由此系列质粒转染细胞后，提存获得。与上述实验类似，将重链和轻链克隆到含老鼠的重链恒定区Fc片段和轻链k/￡恒定区的改造的pCDNA3.1质粒中。实施例12.嵌合抗体与人PCSK9的结合96孔酶标板上铺板，4μg/ml的streptavidin包被，37摄氏度恒温孵育90分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素标记的PCSK9，37摄氏度孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入不同稀释倍数的嵌合抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：5000倍稀释HPR标记的mouseanti-humanIgG(H+L)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μlTMB底物溶液显色，室温反应10分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。如图10所示，3G12嵌合抗体和鼠源抗体均能特异性结合人PCSK9。实施例13.嵌合抗体对HepG2细胞LDL吸收的影响将构建的嵌合抗体(10μg/ml)与生物素标记的人PCSK9(400ng/ml)混合室温孵育60分钟。然后将混合物加入到HepG2细胞中，随后加入FL-LDL(5μg/ml)，在37摄氏度孵育3小时，以PBS洗脱3次后，将样品上流式细胞仪检测。如图11所示，构建的3G12嵌合抗体能够抑制人PCSK9对LDL吸收的影响。实施例14抗体的人源化改造根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列，进行人源化改造。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：A、把各杂交瘤细胞分泌的抗体的基因序列与人胚胎系抗体基因序列进行比对，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；C、利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体基因序列中可与PD-1作用以及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人胚胎系基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成随机引物，自制噬菌体文库，筛选人源化抗体文库(Pini,A.等,etal.(1998).DesignandUseofaPhageDisplayLibrary:HUMANANTIBODIESWITH10SUBNANOMOLARAFFINITYAGAINSTAMARKEROFANGIOGENESISELUTEDFROMATWO-DIMENSIONALGEL.,JournalofBiologicalChemistry,273(34):21769-21776)。在此基础上我们得到了以下多个人源化抗体。其中包括以下克隆，32和77。其中32和77的轻链是相同的。32/77-LC(SEQIDNO:45，轻链氨基酸序列)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYIDWYQHKPGKAPKLLIHYASTLQPGVPSRFSGSGSGRDYTFTISSLQPEDIATYYCLQYDDLWTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:46，轻链核苷酸序列)GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTACATCGACTGGTACCAGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCCACTACGCCAGCACCCTGCAGCCCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGAGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACGACCTGTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG32-HC(SEQIDNO:47，重链氨基酸序列)QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSISSYGIHWIRQSPGKGLEWIGVIWRGGITDYNAPFMSRVTISKDNSKNQVSFKLSSVTAADTAVYYCANHRDWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:48，重链核苷酸序列)CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCATTAGCAGCTATGGCATTCATTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCGTGATTTGGCGCGGCGGCATTACCGATTATAACGCGCCGTTTATGAGCCGCGTGACCATTAGCAAAGATAACAGCAAAAACCAGGTGAGCTTTAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAACCATCGCGATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC77-HC(SEQIDNO:49，重链氨基酸序列)QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSISSYGVHWIRQSPGKGLEWIGVIWRGGSTDYNAAFMSRVTISKDNSKNQVSFKLSSVTAADTAVYYCANHRDWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:50，重链核苷酸序列)CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCATTAGCAGCTATGGCGTGCATTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCGTGATTTGGCGCGGCGGCAGCACCGATTATAACGCGGCGTTTATGAGCCGCGTGACCATTAGCAAAGATAACAGCAAAAACCAGGTGAGCTTTAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAACCATCGCGATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC实施例15人源化抗体与人PCSK9的结合96孔酶标板上铺板，0.1μg/ml的streptavidin包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％BSA的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入0.2ug/ml生物素标记的人PCSK9，37摄氏度孵育30分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入不同稀释倍数的人源化抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：10000倍稀释HPR标记的mouseanti-humanIgG(H+L)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μlTMB底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。如图12所示，人源化之后，并未改变其与人源PCSK9的结合能力，其结合的EC50值在5ng/ml左右。实施例16人源化抗体能有效促进HepG2细胞对LDL的吸收将不同浓度梯度稀释的人源化抗体及参照抗体(起始浓度为10ug/ml,2倍浓度梯度稀释)与HuPCSK9-D347Y(2.5μg/ml)室温孵育30min，加入到HepG2细胞中，37℃，7％C02孵育1h。随后加入Dil-LDL(5μg/ml)，37℃，7％C02，孵育5小时，PBS洗四次，TecanM1000Pro进行荧光检测(Ex554nm/Em571nm)。如图13所示，人源化抗体能够有效抑制PCSK9与LDLR的结合，从而促进HepG2细胞对LDL的吸收，其IC50值在1ug/ml左右。实施例17人源化抗体能有效降低食蟹猴体内的LDL-c以食蟹猴为模型，通过皮下注射，单次给药，在不同给药时间点，观察不同给药剂量条件下(3，10，30mg/kg),其血清中LDL-c的变化，及其抗体浓度的变化。如图14所示，通过检测，可以看出不同的给药剂量，其血清中的LDL-c的含量明显降低，在给药后D7，其LDL-c的水平降低了70％。同时与嵌合抗体相比，人源化抗体的半衰期明显增加。参考文献Abifadel,M.,etal.(2003)."MutationsinPCSK9causeautosomaldominanthypercholesterolemia."NatGenet34(2):154‐156.Abifadel,M.,etal.(2003)."MutationsinPCSK9causeautosomaldominanthypercholesterolemia."NatGenet34(2):154‐156.Benjannet,S.,etal.(2004)."NARC‐1/PCSK9anditsnaturalmutantszymogencleavageandeffectsonthelowdensitylipoprotein(LDL)receptorandLDLcholesterol."JournalofBiologicalChemistry279(47):48865‐48875.Fisher,T.S.,etal.(2007)."EffectsofpHandLowDensityLipoprotein(LDL)onPCSK9‐dependentLDLReceptorRegulation."JournalofBiologicalChemistry282(28):20502‐20512.Jones,S.T.andM.M.Bendig(1991)."RapidPCR‐cloningoffull‐lengthmouseimmunoglobulinvariableregions."Bio/Technology9(1):88‐89.Lagace,T.A.,etal.(2006)."SecretedPCSK9decreasesthenumberofLDLreceptorsinhepatocytesandinliversofparabioticmice."JournalofClinicalInvestigation116(11):2995‐3005.Lambert,G.,etal.(2009)."MolecularbasisofPCSK9function."Atherosclerosis203(1):1‐7.Seidah,N.G.,etal.(2003)."Thesecretoryproproteinconvertaseneuralapoptosis‐regulatedconvertase1(NARC‐1):liverregenerationandneuronaldifferentiation."ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences100(3):928‐933.Zhang,D.‐W.,etal.(2007)."BindingofProproteinConvertaseSubtilisin/KexinType9toEpidermalGrowthFactor‐likeRepeatAofLowDensityLipoproteinReceptorDecreasesReceptorRecyclingandIncreasesDegradation."JournalofBiologicalChemistry282(25):18602‐18612。当前第1页1 2 3