本发明广义涉及使用集成的酶级联体系与金属催化和有机催化法将醇和醛转化为胺和酰胺的生态友好方法。更具体地，本发明涉及以香草羟醛为起始物并组合使用酶级联体系和催化剂来合成辣椒素的方法。
背景
胺和酰胺是用于生产精细化学品和药品的有用和非常有价值的化合物。在此背景下，辣椒碱(7a)是辣椒属中发现的刺激性化合物，且是造成这些植物的红辣椒果实辛辣味(图1)的原因1。在辣椒属中也可以找到若干辣椒碱类似物7(或辣椒素)，但辣椒碱是最常出现的，也是首先被分离并要确定其结构的1-4。辣椒素的应用包括辛辣食物、自卫武器(如胡椒喷雾)和止痛剂如Zostrix和Axsain。辣椒素也已经显示出具有多种其它生理效应，例如对失热和生热二者的激活5、肾上腺儿茶酚胺分泌的增加6，7和体内脂肪堆积的抑制7，8。辣椒素还显示癌症抑制性(参阅此专题文献的9-11)。
辣椒素(7)可以从天然来源(如辣椒属辣椒果实)分离出来，但这主要得到的是辣椒碱(7a)和二氢辣椒碱，因为许多其它辣椒素仅以痕量存在3,4。因此化学合成法可用于获得更罕见的辣椒素如诺香草胺(7b)和用于生产非天然辣椒素12。辣椒素可以从香草醛(2)来制备，首先用过量金属(Zn)与甲酸铵在MeOH中的混合物在回流条件下将香草醛肟还原得到香草胺(4)13。接着，4可与酰氯(6)进一步反应以形成最终产品(7)12,14-16。或者，酰胺键的形成可通过4与不同脂肪酸衍生物之间的酶催化转化反应完成17-20。
衍生自木材的木质素是用于生产香草醇(1)和香草醛(2)的天然来源(图1)21，因而它是一种可能的合成辣椒素(7)的原料。木质素是特别感兴趣的，因为它是可再生的、自然界中大量可得且目前仅用于有限数量的应用21,22。香草醛也可以从愈创木酚通过将其与乙醛酸进行亲电芳香取代进行反应来合成。所得香草基扁桃酸接下来借助4-羟基-3-甲氧基苯乙醛酸通过氧化脱羧反应转换为香草醛(2)23。
但是需要一种环境友好方法来生产辣椒素。更具体地，为了在还原性胺化步骤即将醛转化成其相应胺的步骤如香草醛转化为香草胺过程中消除使用金属的需求，需要一种酶法制备中间体胺如香草胺(4a)。并且，还需要一种香草醛及其衍生物转化为辣椒素的更高效方法，其中所述辣椒素的产率比现有技术所述产率更高。此外，还需要以一釜法而无需提纯反应中间体来生产辣椒素的方法。
发明目的
本发明的目的是使用各种可再生化合物作为起始原料来合成胺和酰胺。
本发明的另一个目的是提供一种从环境和健康观点看是有利的合成胺和酰胺的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产酰胺的更加可持续方法。
本发明的另一个目的是以一釜法实施合成。
本发明的另一个的目的是消除分离中间体的需求。
本发明的另一个目的是减少合成中形成的废物量。
本发明的另一个目的是使用酶法制备中间体香草胺(4a)，以消除还原性胺化步骤中使用的金属的需求。
发明概述
本发明的目的通过使用涉及酶级联体系的多元催化级联继序列得以实现，当所述的酶级联体系集成其它催化体系如非均相金属催化剂和有机催化剂时，分别以序列或一步方式将醇转化为胺和酰胺。方案1中说明了本发明的实施方案，其中(i)R优选自脂族基、芳基、4-羟基-3-甲氧基-C6H3和4-羟基-3-乙氧基-C6H3，(ii)R1优选自H、甲基和乙基，和(iii)R3优选自烷基和芳基。
如方案1所示，实施方案涉及醇转化的方法，包括如下步骤：(a)将所述醇转化成醛或酮，(b)将所述醛或酮转化为胺，其中所述醛或酮转化为胺的反应是通过酶级联体系催化的，和(c)将所述胺转化为所述酰胺。
方案1-醇的转化
更多实施方案涉及如方案2所示的使用多元催化体系的组合通过香草醇及其衍生物的转化来合成辣椒素和类似衍生物。
方案2ⅰ香草醇的转化
更多实施方案涉及如方案2所示的使用酶级联体系和有机催化剂从香草醛及其衍生物开始合成辣椒素和类似衍生物。
更多实施方案涉及辣椒素、诺香草胺和苯基辣椒碱及其衍生物的合成。
更多实施方案涉及醇转化的方法，包括如下步骤：(a)将所述醇转化成醛，(b)将所述醛转化为胺，其中所述醛转化为胺的反应是通过酶级联体系催化的，和(c)将所述胺转化为所述酰胺，其中所述步骤a-c的步骤是通过使用方案3所公开的醇、醛、胺和试剂进行的。
方案3-醇转化为胺和酰胺
更多实施方案涉及在环境友好条件下醇转化为胺和酰胺的方法。
因此，在不同实施方案方面，是通过以下步骤达到目的：
-使用多元催化级联继序列从醇合成胺和酰胺。
-使用多元催化级联继序列从醛合成胺和酰胺。
-使用多元催化级联继序列实施从香草醛及其衍生物开始辣椒素的总合成。
-使用多元催化级联继序列从香草醇及其衍生物开始辣椒素的总合成。
详述
所描述实施方案涉及醇转化的环境友好方法，所述方法包括将醇转化为醛或酮、醛或酮转化为胺和之后胺转化为酰胺的步骤。醛转化为胺的反应是通过酶级联体系催化的。
用于制备醛的醇可选自伯醇。所述伯醇氧化得到包括R基团的醛，其中R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环。通过酶级联体系催化的醛转化为胺的反应得到包括R基团的胺，其中R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环。胺经酰化剂处理后得到带有R基团(R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环)以及酰基(COR3)(R3选自烷基和芳基)的酰胺。
仲醇可用于制备酮。仲醇氧化得到包括R基团(R选自烷基和芳基)以及R1基团(R1选自甲基和乙基)的酮基的酮。通过酶级联体系催化的酮转化胺的反应得到包括R基团(R选自烷基和芳基)以及R1基团(R1选自甲基和乙基)的胺。胺经酰化剂处理后得到带有(i)R基团(R选自烷基和芳基)、(ii)R1基团(R1选自甲基和乙基)以及(iii)酰基(COR3)(R3选自烷基和芳基)的酰胺。
通过依据反应分子性质适合的催化剂将醇转化为醛。催化剂选自非均相(负载型)金属催化剂、均相金属催化剂(如均相有机金属配合物)、无金属催化剂(介体)或氧化酶(如氧化酶EC 1:10:3:2)。依据反应分子性质适合的氧化剂选自氧气、空气、过氧化氢和次氯酸钠(NaOCl)。
用于制备醛的醇可选自羟醛。羟醛的降解反应得到包括R基团的醛，其中R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环。通过酶级联体系催化的醛转化为胺的反应得到包括R基团的胺，其中R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环。胺经酰化剂处理后得到带有R基团(R选自烷基、芳基、肉桂基和杂环)以及酰基(COR3)(R3选自烷基和芳基)的酰胺。
醛转换为其相应胺的酶级联体系包括胺转氨酶(ATA)，其可以与有机催化剂如选自丙氨酸、IPA(异丙基胺)和甲基苄胺的胺供体结合使用。优选的胺供体是L-丙氨酸且优选的ATA是EC 2.6.1.18。有意思的是，酶级联体系中将NH3(例如以氯化铵形式)包括在内作为端N-源，L-丙氨酸脱氢酶和NADH提高了酰胺的产率。并且，酶级联体系中另外包括D-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，酰胺的产率可进一步提高。因此，最佳转化方法涉及使用包括ATA、L-丙氨酸、NH3，L-丙氨酸脱氢酶、NADH、D-葡萄糖、葡萄糖脱氢酶的酶级联体系。
胺转化为其相应的酰胺是通过将胺与选自羧酸、烷基烯酮二聚物、酰氯和酸酐的酰化剂(即酰胺化试剂)进行酰化反应来实现的。此外，也可采用涉及例如有机催化剂和脂肪酶的催化方法。
上述生产酰胺的方法可如方案2(如上所示)示出的用于生产辣椒素及其衍生物，方案2示出了多元催化级联继序列(即一个多元催化体系)的应用。如图所示，香草醛(2a)可从香草醇(1a)或是从式3的羟醛制备。在下一步中用酶级联体系将香草醛转化成其相应的胺香草胺(4a)。式7a和7b的辣椒素可通过两条不同路线制备。第一条路线涉及香草胺与式5a或5b化合物的反应，而第二条路线涉及香草胺与式6a或6b化合物的反应。在更优选的实施方案中，1a、2a和/或3a的衍生物可用于生产苯基辣椒碱以及天然和非天然辣椒素。
在优选的实施方案中，酰化剂5a、5b、6a和6d可由7-苯基-6-庚炔酸和下式化合物代替
其中R基选自(i)烷基、(ii)芳基和(iii)杂环基。
本发明的优选实施方案使用可再生化合物如木质素作为香草醇的来源。此外，本发明的优选实施方案中以一釜法操作无需任何提纯中间体步骤。利用可再生化合物、无金属催化的酶级联体系和一步合成法使本发明可持续和环境友好。
在本发明的优选实例中，苄醇、肉桂醇、羟基苄醇、甲氧基苄醇及乙氧基苄醇可用作起始化合物。具体实施方案涉及使用式RCHOHR1的醇，其中R选自脂族基、芳基、4-羟基-3-甲氧基-C6H3和4-羟基-3-乙氧基-C6H3，且其中的R1优选自H、甲基和乙基。并且，优选的实施方案可涉及使用醛和酮作为起始化合物，苯甲醛和芳基甲基酮是一些例子。起始醇、醛和酮已可从石油基或可再生资源获得。
本发明中的烷基是长度介于1-30个碳原子(C1-30)之间的直链或支化的碳链，其中所述碳链可任选是不饱和的，因此包括烯和炔。所述C1-30烷基可任选用1-3个取代基取代，其中所述取代基选自烷氧基(C1-30直链或支链)、卤素，羟基、硝基、氰基和苯基(其中所述苯基任选用1-3个独立选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支化链)、卤素，羟基、氰基和硝基的取代基取代)。
本发明中的芳基是可任选用1-3个取代基取代的芳族基团，其中所述取代基选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支链)、卤素，羟基、硝基、氰基和苯基(其中所述苯基任选用1-3个独立选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支化链)、卤素，羟基、氰基和硝基的取代基取代)。
本发明中的肉桂基是可任选用1-3个取代基取代的肉桂基基团，其中所述取代基选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支链)、卤素，羟基、硝基、氰基和苯基(其中所述苯基任选用1-3个独立选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支化链)、卤素，羟基、氰基和硝基的取代基取代)。
本发明中的杂环是可任选用1-3个取代基取代的杂环基团，其中所述取代基选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支链)、卤素，羟基、硝基、氰基和苯基(其中所述苯基任选用1-3个独立选自烷基、烷氧基(C1-30直链或支化链)、卤素，羟基、氰基和硝基的取代基取代)。
实验部分
化学品和溶剂是从供应商处购买的puriss p.A.纯度或是通过标准技术提纯。购买的商业试剂可不经任何进一步提纯而使用。
紫色色杆菌胺转氨酶(ATA)通过发酵产生。L-丙氨酸脱氢酶(L-ADH，来自蜡状芽孢杆菌，≥350U/mL，产品编号79848)和葡萄糖脱氢酶(GDH，来自假单胞菌属，≥200U/mg，产品编号19359)购自Sigma-Aldrich。
铝箔硅胶板(Fluka 60F 254)用于薄层色谱(TLC)，和化合物通过用UV光(254nm)辐照或通过用磷钼酸(25g)、Ce(SO4)2ⅰH2O(10g)，浓H2SO4(60ml)和H2O(940ml)的溶液处理后加热的方法来显色。通过使用硅胶(Fluka 60，粒径0.040-0.063毫米)的快速柱色谱进行产物的纯化。
HPLC分析是用1100系列HPLC系统(Agilent)进行的，采用Crownpak CR(+)柱(Daicel)和UV检测器(254nm)。使用pH值1.6(HClO4)和10％v/v甲醇的酸性流动相。通过测定所形成的产物和将其与标准曲线对比来确定转化率，用苯甲酸作为内标。
红外(IR)光谱是在Thermo Fisher Nicolet 6700 FT-IR光谱仪上以λmax(单位cm-1)记录的。谱带表征为宽(br)、强(S)、中等(M)或弱(w)。1H NMR光谱是用Bruker Avance(500MHz或400MHz)光谱仪记录的。化学位移以ppm报告，以带有不完全氘代溶剂共振峰的四甲基硅烷作为内标(CDCl3:δ7.26ppm)。数据以如下方式报告：化学位移，多重性(s＝单峰峰，d＝双重峰，q＝四峰，br＝宽峰，m＝多重峰)，偶合常数(Hz)，积分面积。13C NMR光谱是用Bruker Avance(125.8MHz或100MHz)全氢去耦光谱仪记录的，化学位移以ppm报告，以带有溶剂共振的四甲基硅烷作为内标(CDCl3:δ77.16ppm)。高分辨质谱是在Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(正离子模式)上操作的。
ATA：克隆、表达和纯化
将紫色色杆菌胺转氨酶(ATA)的基因插入质粒pET28a(+)并转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，如Cassimjee等人先前所述24。含转氨酶质粒的细胞在含50mg/L卡那霉素的20ml Luria-Bertoni(LB)培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L的NaCl、5g/L的酵母提取物)中于37℃和220rpm下培养过夜。通过将六个这样的过夜培养液与1080ml LB培养基和50mg/L卡那霉素在挡板烧瓶中于25℃和120rpm下进行混合来进行蛋白质的表达。培养液通过添加0.4mM IPTG进行诱导并培养24小时。然后获得细胞并通过离心法从培养基中分离出来。将细胞重悬于20mM Na2HPO4和500mM氯化钠组成的pH为7.4的IMAC结合缓冲液中并超声破碎。离心法除去细胞碎片，和过滤粗酶溶液(0.45μm)并用HisTrap HP 5mL层析柱(GE Healthcare)的 FPLC系统进行纯化。用结合缓冲液洗涤层析柱，然后用20mM Na2HPO4、500mM咪唑和500mM氯化钠组成的pH为7.4的IMAC洗脱缓冲液将酶洗脱。酶溶液用1mM吡哆醛-5'-磷酸酯(PLP)在温和混合下培养20分钟。然后使用PD10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液改为HEPES 50mM pH值8.2。所述酶在用于反应之前储存过夜。酶在黑暗和4℃条件下储存。
ATA浓度的测定
通过测量395纳米处的吸光度来测定ATA浓度，消光系数8.1mM-1cm-1，按照Cassimjee等人所述24。
从香草醛制备香草胺
所有反应均在eppendorf管(1ml总体积)中于37℃和黑暗条件下进行。转化率通过HPLC分析测定。
方案4.辣椒素和诺香草胺的总合成示意图。
在第一个实验中，将250mM的L-丙氨酸和5mM的香草醛(2a)在pH 8.2的50mM HEPES缓冲液中与0.2mg/ml的ATA一起混合。23小时后，25％的香草醛已转化为香草胺(4a)。加入L-丙氨酸脱氢酶重复相同实验。因为此实验没有使用NADH再生体系，使用过量(2当量)的NADH。反应组合物为250mM L-丙氨酸、5mM的香草醛、100mM氯化铵和10mM NADH在50mM pH 8.2的HEPES缓冲液中，连同0.2mg/ml的ATA和7U/ml的L-丙氨酸脱氢酶。这导致23小时后的转化率为70％。然后加入葡萄糖脱氢酶来再生NADH进行重复实验。再生体系存在下，反应中NADH浓度从过量变为催化量。反应组合物为250mM的L-丙氨酸、5mM香草醛、100mM氯化铵、100mM的D-葡萄糖和1mM NADH在50mM pH 8.2的HEPES缓冲液中，连同0.2mg/ml的ATA、7U/mL的L-丙氨酸脱氢酶和10U/mL的葡萄糖脱氢酶。在23小时，此体系导致转化率>99％。
在保持高转化率的同时反应中香草醛(2a)的起始浓度可成功地增加至50mM。将香草醛首先溶于DMSO，然后与D-葡萄糖、氯化铵和L-丙氨酸在HEPES缓冲液50mM中混合。将pH调节至8.2(1M NaOH)，并在eppendorf管中将该溶液与NADH和酶混合，得到最终浓度250mM的L-丙氨酸、50mM的香草醛、150mM氯化铵、150mM的D-葡萄糖、1mM的NADH和10％DMSO v/v，连同0.9mg/ml的ATA、7U/ml的L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶。这导致17小时后的转化率为95％。
制备其它胺
方案3
使用相同步骤，将两个其它醛：苯甲醛(2b)和肉桂醛(2c)，分别成功地转化为相应的胺4b和4c。反应组合物是250mM的L-丙氨酸、5mM醛(2b或2c)、150mM氯化铵、150mM的D-葡萄糖和1mM NADH v/v于HEPES缓冲液(45mM，37℃下pH 8.2)中，含10％DMSO v/v，连同1mg/ml的ATA，7U/ml的L-ADH和10U/ml的GDH。23小时中，以89％的转化率获得4b，同时以76％的转化率获得4c。
从香草胺合成辣椒素和诺香草胺的通用步骤。
步骤1：酸5a或5b(19.0mmol，1.0当量)和亚硫酰氯(9.04g，76.0mmol，4.0当量)的溶液回流4小时。通过旋转蒸发器除去过量的亚硫酰氯，高真空除去残留物，得到淡黄色的酰氯6a或6b25。物料无需进一步纯化而用于下一步骤。
步骤2：向含香草醛(4)(81.1mg，0.53mmol，1.00当量)和NaHCO3(145.6mg，1.73mmol，3.27当量)的小瓶(8ml)中加入H2O(1.5ml)并在室温下搅拌30分钟，然后加入CHCl3(2ml)并在室温搅拌下反应15分钟。接着，将6a或6b(0.61mmol，1.16当量)在CHCl3(0.5ml)中的溶液逐滴加入并在室温搅拌下继续反应30分钟。之后将反应混合物加热至40℃并搅拌30分钟(用TLC监测)。分离有机层，并用CHCl3(3x15mL)洗涤水层。将合并的有机层用HCl水溶液(2％)和盐水洗涤，随后用Na2SO4干燥。将粗物料通过色谱法纯化，得到7α(分离收率91％)和7b(分离收率94％)，为浅黄色油状物26。
7a:IR(纯)λ3296(br),2922(s),2853(m),1730(m),1647(m),1515(m),1459(m),1376(m),1272(m),1214(m),1154(m),1123(w),1034(m),970(w),816(w),756(s),667(m),557(w)cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.86(d,J＝8.1Hz,1H),6.81(s,1H),6.79-6.73(m,1H),5.62(br s,2H),5.41-5.27(m,1H),4.36(d,J＝5.7Hz,2H),3.88(s,3H),2.36-2.13(m,4H),1.98(q,J＝8.3Hz,1H),1.83-1.72(m,1H),1.72-1.57(m,4H),1.53-1.43(m,1H),1.42-1.34(m,1H),0.95(d,J＝7.0Hz,2H),0.93(d,J＝6.8Hz,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ172.9,172.5,146.8,145.30,145.27,138.3,130.6,130.5,126.6,121.03,120.97,114.52,114.49,110.86,110.81,72.1,63.3,56.12,56.09,43.76,43.69,36.9,36.7,35.1,32.4,31.1,30.5,29.4,25.4,25.2,22.8,21.1,15.1,14.4；HRMS(ESI+)[M+Na]+计算值C18H27NO3Na+:306.2064,测量值:306.2059；
7b:IR(纯)λ3293(br),2926(m),2855(m),1641(m),1514(m),1462(m),1432(m),1376(w),1272(m),1214(m),1154(m),1123(w),1036(m),909(m),853(w),749(s),666(m),556(w),464(w)cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.85(d,J＝8.0Hz,1H),6.80(s,1H),6.75(d,J＝8.2Hz,1H),5.73(br s,2H),4.34(d,J＝5.7Hz,2H),3.86(s,3H),2.19(t,J＝7.7Hz,2H),1.68-1.59(m,2H),1.38-1.18(m,10H),0.87(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ173.1,146.9,145.30,130.5,120.9,114.5,110.8,56.1,43.7,37.0,31.9,29.5,29.3,25.9,22.8,14.2；HRMS(ESI+)[M+Na]+计算值C17H27NO3Na+:316.1883,测量值:316.1879；
诺香草胺的一釜法总合成
步骤1：使用50mM香草醛(2a)，刻度为13.06ml，若转化率为100％将得到100mg香草胺(4a)。将香草醛首先溶于DMSO，然后与D-葡萄糖，氯化铵和L-丙氨酸在HEPES缓冲液50mM中混合。将pH调节至8.2(1M NaOH)，并在50ml猎鹰管(falcon tube)中将该溶液与NADH和酶混合，得到最终浓度250mM L-丙氨酸、50mM香草醛、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH和10％DMSO v/v，连同1.6mg/ml的ATA、7U/ml的L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶。在37℃和黑暗且无搅拌条件下进行反应。19小时后，通过HPLC分析测定，转化率达到>99％。将溶液(除去用于HPLC的样品之后总体积为13.01ml)在-80℃下储存直至进行第二步。
步骤2a：向装有前面酶级联反应步骤的粗反应混合物(体积13.01ml，含香草胺(99.6mg，0.65mmol，1.00当量))的烧瓶中加入的NaHCO3(178.9mg，2.13mmol，3.27当量)并在室温下搅拌30分钟，然后加入CHCl3(20ml)，将在室温搅拌下维持反应15分钟。接着，将6b(132.1mg，0.75mmol，1.16当量)在CHCl3(5.0ml)中的溶液逐滴加入并在室温搅拌下继续反应30分钟。之后将反应混合物加热至40℃并搅拌30分钟(用TLC监测)。分离有机层，并用CHCl3(3x50mL)洗涤水层。将合并的有机层用HCl水溶液(2％)和盐水洗涤，随后用Na2SO4干燥。将粗物料通过色谱法纯化，得到诺香草胺(7b)(分离收率92％)，为浅黄色油状物。
步骤2b：将前一步骤的干燥粗反应混合物(含香草醛94mg，0.62mmol，1.00当量)溶解于2-甲基-2-丁醇(31ml，20mmol)中。向此反应物中加入Ms(2g)、化合物5b(98.7mg，0.62mmol，1.00当量)和脂肪酶(1.9g，20mg/ml)。将反应物在45℃下搅拌48小时。之后，将反应物冷却到室温并过滤。减压除去溶剂和用色谱法纯化粗物质，得到诺香草胺(7b)(分离收率52％)，为浅黄色油状物。
从香草醇合成香草胺的步骤
步骤1：在烘箱干燥的微波小瓶中装入香草醇(1a)(46.3mg，0.3mmol，1.0当量)和Pd(0)-纳米催化剂((Pd(0)-AmP-MFC，20.1mg，0.015mmol，8wt％)27或(Pd(0)-CPG,90.0mg，0.015mmol，166μmol/g，2wt％)，随后加入甲苯(0.6ml)。接着，将混合物密封并将一个充O2气球被连接到所述小瓶并将反应物在70℃下搅拌。3小时后(当使用Pd(0)-AmP-MFC时)或2小时(当使用Pd(0)-CPG,时)向香草醛(2a)的转化率达到>99％。
香草醛：IR(纯)λ3335(br),3016(w),2838(w),1668(m),1583(m),1509(m),1461(w),1432(w),1400(w),1265(s),1207(w),1150(s),1118(m),1027(m),957(w),866(w),820(w),779(w),750(m),728(s),666(w),628(w),588(w),551(w)cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.82(s,1H),7.43-7.40(m,2H),7.03(d,J＝8.6Hz,1H),6.35(br s,1H),3.95(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ191.1,151.9,147.3,130.0,127.7,114.5,108.9,56.2；HRMS(ESI+)[M+H]+计算值C8H9O3:153.0546,测量值:153.0544.
步骤2：将几滴上一步骤的仍含有Pd纳米颗粒的粗混合物转移到eppendorf管，并与200μL蒸馏水混合。为确定取样溶液中香草醛的浓度，将样品中的Pd纳米颗粒通过离心法(4000rpm 15分钟)除去并进行HPLC分析。将D-葡萄糖、氯化铵和L-丙氨酸溶解于HEPES缓冲液50mM中，pH值调节至8.2(1M NaOH)，将溶液与NADH和酶混合并直接加入到装有粗香草醛溶液(100μL)的管中。最终的反应体积为1ml，浓度为250mM L-丙氨酸、1.5064mM来自粗溶液的香草醛、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM的NADH，连同1mg/ml ATA,7U/ml L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶。反应在37℃且黑暗无搅拌下进行。在HPLC分析前，将样品中的任何Pd纳米颗粒通过离心法(4000rpm下15分钟)除去。44小时后反应完成，获得香草胺(4a)，通过HPLC分析确定转化率为87％。给出的香草醇(1a)向香草胺(4a)的总转化率为87％。
香草醛和丙酮之间羟醛缩合反应的步骤
在N2条件下向装有香草醛(2a)(114.1mg，0.75mmol，1.00当量)和丙酮(7.5ml)的小瓶(8ml)中加入脯氨酸(DL-脯氨酸或L-脯氨酸)(26.0mg，0.23mmol，30mol％)。将反应物在室温下搅拌24小时，然后加入饱和NH4Cl水溶液(3.0ml)淬冷。用乙酸乙酯(3x20mL)萃取反应混合物，用盐水(10ml)洗涤合并的有机相并用Na2SO4干燥。粗物料通过色谱法纯化，得到3(分离收率74％)，为黄色油状物28。
2:IR(纯)λ3392(br),2924(m),1703(m),1604(w),1515(m),1455(w),1431(w),1363(w),1269(m),1213(m),1153(m),1123(m),1032(m),858(w),819(w),749(s),666(w),638(w),540(w)cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.93(d,J＝1.9Hz,1H),6.87(d,J＝8.1Hz,1H),6.80(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),5.60(br s,1H),5.09(dt,J＝9.2,3.0,Hz,1H),3.90(s,3H),3.23(d,J＝3.0Hz,1H),2.88(dd,J＝17.6,9.3Hz,1H),2.80(dd,J＝17.6,3.3Hz,1H),2.20(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ209.4,146.8,145.3,135.0,118.7,114.4,108.4,69.9,56.1,52.2,30.9；HRMS(ESI+)[M+Na]+计算值C11H14O4Na+:233.0784,测量值:233.0784.
丙氨酸催化的逆羟醛反应
通过丙氨酸催化的逆羟醛反应由木质素模型3制备香草醛(2a)。由于此体系可与酶级联体系用于一釜法合成香草胺(4a)，逆羟醛反应过程最初实验所用条件与先前合成香草胺所用条件相同。采用高效液相色谱法进行分析。
将化合物3溶解在DMSO中并在HEPES缓冲液pH 8.2中与L-丙氨酸混合，得到的最终体积为1ml，和浓度为2.5mM化合物3、250mM L-丙氨酸、45mM的HEPES和10％DMSO v/v。反应在37℃下进行70小时后所有3已被耗尽。此时，起始物料的38％已转化成香草醛，其余为副产物如3的脱水产物(转化率未测定)。采用无丙氨酸但其它组分相同的对照反应以5.3％转化率得到香草醛而70小时后3仍在反应。这表明，有一些自发的逆羟醛反应活性，但它比丙氨酸催化的反应慢得多。采用包括丙氨酸在内相同组分但pH 7的第三个反应，70小时后以19％的转化率得到香草醛，具有一些3仍在反应。这些结果汇总于表1。
L-丙氨酸是手性催化剂且所用化合物3是外消旋的。做实验对使用DL-丙氨酸作为外消旋3的催化剂和使用L-丙氨酸作为(S)-3的催化剂进行了研究。为进行比较，还进行了采用L-丙氨酸作为外消旋3的催化剂的对照反应。所有反应都如前述在含45mM HEPES pH 8.2、DMSO 10％v/v和2.5mM化合物3的1mL体积中进行操作。250mM L-丙氨酸或500mM DL-丙氨酸用作催化剂。室温下116小时后，对照反应以24％的转化率、采用外消旋催化剂以30％的转化率和采用(S)-3为底物以19％的转化率获得香草醛。这些结果汇总于表1。
表1：丙氨酸催化的逆羟醛反应汇总
通过逆向羟醛反应和随后转氨反应以一釜法合成香草胺的步骤
将D-葡萄糖、氯化铵和L-丙氨酸溶解于HEPES缓冲液50mM中并将pH调节至8.2(1M NaOH)。将木质素模型3溶解在DMSO中，然后将NADH和酶一起加入到该溶液中，得到最终体积1ml和浓度为250mM L-丙氨酸、2.5mM化合物3、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH和10％DMSO v/v，连同1mg/ml ATA、7U/ml L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶。将反应在37℃和黑暗条件下无搅拌进行。92小时后通过HPLC分析测定，结果是向香草胺(4a)的转化率为25％。
重复相同的反应，但用100mM HEPES代替50mM(最终体积1ml和浓度为250mM L-丙氨酸、2.5mM化合物3、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH和10％DMSO v/v，连同0.9mg/ml ATA、7U/ml L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶)。将反应在37℃和黑暗条件下无搅拌进行。90小时后通过HPLC分析测定，结果是向香草胺(4a)的转化率为40％。
更高缓冲液浓度对前述从香草醛(2a)合成香草胺(4a)体系的影响进行了研究。按前面相同的方式，将香草醛溶于DMSO，然后与D-葡萄糖、氯化铵和L-丙氨酸在HEPES缓冲液100mM中混合。将pH调节至8.2(1M NaOH)并将溶液与NADH和酶在eppendorf管中混合，得到最终体积1ml和浓度为250mM的L-丙氨酸、50mM的香草醛，150mM氯化铵，150mM D-葡萄糖，1mM的NADH和10％DMSO v/v，连同0.9mg/ml ATA、7U/ml L-丙氨酸脱氢酶和10U/ml葡萄糖脱氢酶。将反应在37℃和黑暗条件下无搅拌进行。结果是18小时后结束反应，香草醛向香草胺的转化率仅为77％。由于采用较低浓度缓冲液的相同体系获得了95％(小规模)和>99％(放大规模)的转化率，因此决定不再就采用100mM缓冲液浓度做进一步工作。
7-苯基-6-庚炔酸合成29
向烘箱干燥的烧瓶中加入Pd(PPh3)4(173.3mg，0.15mM，3mol％)和CuI(19.0mg，0.1mmol，2mol％)，并将烧瓶在N2条件下冲洗5分钟，随后加入6-庚炔酸(630.8mg，5mmol，1.0当量)、1-碘苯(1.22g，6mmol，1.2当量)和三乙胺(20ml)。将反应物加热至50℃并搅拌16小时。之后将粗物料浓缩，加入乙酸乙酯(100ml)和HCl水溶液(1M，20ml)并萃取。水相再次用乙酸乙酯(100ml)萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥并浓缩。将粗物料通过色谱法纯化，得到7-苯基-6-庚炔酸(分离收率82％)，为棕色固体。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ10.75(br s,1H),7.43-7.36(m,2H),7.32-7.22(m,3H),2.45(t,J＝7.1Hz,4H),1.88-1.78(m,2H),1.72-1.63(m,2H).
苯基辣椒碱的合成
向烘箱干燥的含Ms(100mg)的小瓶中加入2-甲基-2-丁醇(5ml)。
将7-苯基6-庚炔酸(20.2mg，0.1mmol，1.0当量)、4a(15.2mg，0.1mmol，1.0当量)和Novozyme(100mg)。反应在45℃下搅拌48小时。之后，将反应物冷却到室温并过滤。减压下除去溶剂并通过色谱法纯化粗物料，得到苯基辣椒碱(分离收率95％)，为浅黄色油状物。
IR(纯)λ3053(w),2937(w),1645(m),1600(w),1513(m),1461(w),1431(m),1373(m),1264(m),1236(w),1154(m),1123(m),1034(m),854(w),818(w),732(s),693(m),542(w),465(w)cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.39-7.33(m,2H),7.29-7.24(m,3H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),6.80(s,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),5.67(br s,1H),5.60(s,1H),4.36(d,J＝5.7Hz,2H),3.86(s,3H),2.44(t,J＝7.0Hz,2H),2.27(t,J＝7.1Hz,2H),1.88-1.80(m,2H),1.69-1.61(m,2H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ172.5,146.8,145.3,131.7,130.5,128.4,127.8,123.9,121.0,114.5,110.8,89.8,81.2,56.1,43.7,36.4,28.4,25.2,19.4；HRMS(ESI+)[M+Na]+计算值C21H23NO3Na+:360.1572,测量值:360.1570；
不同的氧化-胺化级联反应
方法1(DABCO-CuCl-TEMPO法)
将装有CuCl(0.495mg，0.05mM，5mol％)和DABCO(0.56mg，0.05mmol，5mol％)于甲苯(0.25ml)中溶液的微波瓶在室温下搅拌10分钟。之后，将TEMPO(0.78mg，0.015mmol，5mol％)加入到反应混合物中并搅拌5分钟。然后，加入醇(0.1mmol)并将含氧气球连接至小瓶。将混合物加热至100℃并在该温度下搅拌2小时。
方法2(CuCl-联吡啶-TEMPO法)
将装有CuCl(0.495mg，0.05mM，5mol％)和联吡啶(0.8mg，0.05mM，5mol％)于甲苯(0.25ml)中溶液的微波瓶在室温下搅拌10分钟。之后，将TEMPO(0.78mg，0.015mmol，5mol％)加入到反应混合物中并搅拌5分钟。然后，加入醇(0.1mmol)并将含氧气球连接至小瓶。将混合物加热至100℃并在该温度下搅拌16小时。
方法3(钯纳米催化剂法)
将醇(0.1mM)加入到一个装有Pd(0)-纳米催化剂(Pd(0)-AmP-MFC,6.7mg,0.05mmol,8wt％,5mol％)于甲苯(0.35ml)中的微波瓶中)并将含氧气球连接至小瓶。将混合物加热至70℃并在该温度下搅拌16小时。
方法4(无金属氧化法)
将溴化钾(1.2mg，0.01mmol，10mol％)于水(1ml)中的溶液加入到一个装有醇(0.1mmol，1.0当量)和TEMPO(1.6mg，0.01mmol，10mol％)于CH2CL2(4ml)中溶液的微波瓶中，并在0℃下搅拌。然后，将pH 9的NaOCl(5.3g，10mmol，100当量)溶液逐滴加入反应混合物中。之后，加入NaOH(2M，3mL)并将含氧气球连接至小瓶。将混合物在0℃下搅拌3小时。
实施方法1-4后，将DMSO加入到小瓶中。将L-丙氨酸、氯化铵和D-葡萄糖溶解在50mM HEPES缓冲液中，37℃下将pH调节为8.2，将该溶液加入到反应瓶中。接着，将NADH、GDH、L-ADH和ATA溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH 8.2，37℃下)并加入到反应瓶中，得到最终浓度为250mM L-丙氨酸、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH、7U/ml L-ADH、10U/ml GDH和2mg/ml ATA。醛原料浓度、DMSO和甲苯在反应中的量和总体积对所实施的每一反应各不相同，并汇总于表X中。反应维持在37℃和黑暗无搅拌条件下。24小时后，通过HPLC法测定转化率(表2)。
表2
[a]ATA，L-ADH，GDH，L-丙氨酸，氯化铵，D-葡萄糖，NADH，HEPES，DMSO，H2O。
[b]这些化合物留在前面氧化步骤的小瓶中。
甲苯的影响
研究甲苯对ATA/L-ADH/GDH级联体系性能的影响。通过级联体系将苯甲醛转化为苯甲胺的反应采用不同量甲苯进行实验。首先将苯甲醛溶解于甲苯和DMSO的混合物中(表Y)并加入到1.5ml eppendorf管中。将L-丙氨酸、氯化铵和D-葡萄糖溶解于50mM HEPES缓冲液中，37℃下将pH调节为8.2，将该溶液加入到反应管中。接着，将NADH、GDH、L-ADH和ATA溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH 8.2，37℃下)并加入到反应管中，得到最终浓度为20mM苯甲醛、250mM L-丙氨酸、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH、7U/ml L-ADH、10U/ml GDH和1mg/ml ATA。每个反应的总体积为1ml，其中10％v/v是DMSO/甲苯混合物。反应维持在37℃和黑暗无搅拌条件下。通过HPLC法测定1、2、4、6和24小时后的转化率。所有的反应都在4小时后完成，并且结果汇总于表3。
表3
[a]％体积/总反应体积
[b]4小时后通过HPLC测定。
Pd(0)-MCF的影响
研究Pd(0)-MCF对ATA/L-ADH/GDH级联体系性能的影响。通过级联体系将苯甲醛转化为苄胺的反应用不同量的Pd(0)-MCF进行实验。首先将钯纳米颗粒加入1.5ml eppendorf管中(表Z)。将苯甲醛溶解于DMSO中并加入管中。将L-丙氨酸、氯化铵和D-葡萄糖溶解于50mM HEPES缓冲液中，37℃下将pH调节为8.2，将该溶液加入到反应管中。接着，将NADH、GDH、L-ADH和ATA溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH 8.2，37℃下)并加入到反应管中，得到最终浓度为5mM苯甲醛、250mM L-丙氨酸、150mM氯化铵、150mM D-葡萄糖、1mM NADH、7U/ml L-ADH、10U/ml GDH和1mg/ml ATA。每个反应的总体积为1ml，含10％v/v DMSO。反应维持在37℃和黑暗无搅拌条件下。通过HPLC法测定1、2、4、6和24小时后的转化率。所有的反应都在4小时后完成，并且结果汇总于表4。
表4
[α]4小时后通过HPLC法测定
参考文献
1.E.K.Nelson,J.Am.Chem.Soc.,1919,41,1115-1121.
2.D.J.Bennett and G.W.Kirby,J.Chem.Soc.C,1968,442-446.
3.K.Iwai,T.Suzuki and H.Fujiwake,Agric.Biol.Chem.,1979,43,2493-2498.
4.T.Kawada,T.Watanabe,K.Katsura,H.Takami and K.Iwai,J.Chromatogr.,1985,329,99-105.
5.A.Kobayashi,T.Osaka,Y.Namba,S.Inoue,T.H.Lee and S.Kimura,Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.,1998,275,R92-R98
6.T.Watanabe,T.Kawada,T.Kato,T.Harada and K.Iwai,Life Sciences,1994,54,369-374.
7.K.Kim,T.Kawada,K.Ishihara,K.Inoue and T.Fushiki,Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61,1718-1723.
8.T.Kawada,K.Hagihara and K.Iwai,J.Nutr.,1986,116,1272-1278
9.K.Bley,G.Boorman,B.Mohammad,D.McKenzie and S.Babbar,Toxicol.Pathol.,2012,40,847-873.
10.Y.Surh,J.Natl.Cancer Inst.,2002,94,1263-1265.
11.A.Oyagbemi,A.Saba,O.Azeez,Indian J.Cancer,2010,47,53-58
12.E.K.Nelson,J.Am.Chem.Soc.,1919,41,2121-2130.
13.K.Abiraj and D.C.Gowda,J.Chem.Res.(S),2003,6,332-334
14.P.M.Gannett,D.L.Nagel,P.J.Reilly,T.Lawson,J.Sharpe and B.Toth,J.Org.Chem.,1988,53,1064-1071.
15.H.Kaga,M.Miura and K.Orito,J.Org.Chem.,1989,54,3477-3478.
16.B.Wang,F.Yang,Y.Shan,W.Qiu and J.Tang,Tetrahedron,2009,65,5409-5412.
17.K.Kobata,K.Yoshikawa,M.Kohashi and T.Watanabe,Tetrahedron lett.,1996,37,2789-2790.
18.K.Kobata,M.Toyoshima,M.Kawamura and T.Watanabe,Biotechnol.Lett.,1998,20,781-783.
19.M.Koreishi,D.Zhang,H.Imanaka,K.Imamura,S.Adachi,R.Matsuno and K.Nakanishi,J.Agric.Food.Chem.,2006,54,72-78.
20.E.Castillo,A.Torres-Gavilán,P.Severiano,N.Arturo and A.López-Munguía,Food Chem.,2007,100,1202-1208.
21.Vannillin is produced from wood in 1,500 tonnes every year by Borregaard.Life-Cycle Assessment proves that wood derived vanillin has a 90％smaller CO2-footprint as compared to mineral oil-based vanillin.(http://sustainableifra.wordpress.com/2012/06/11/vanillin-extracted-from-wood-at-borregaard/)
22.S.R.Collinson and W.Thielemans,Coord.Chem.Rev.,2010,254,1854-1870.
23.Esposito,Lawrence J.；K.Formanek,G.Kientz,F.Mauger,V.Maureaux,G.Robert,and F.Truchet(1997)."Vanillin".Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,4th edition 24.New York:John Wiley&Sons.pp.812ⅰ825.
24.K.E.Cassimjee,M.S.Humble,V.Miceli,C.G.Colomina and P.Berglund,ACS Catal.,2011,1,1051 1055.
25.J.Zhao,T.D.Gover,S.Muralidharan,D.A.Auston,D.Weinreich and J.P.Y.Kao,Biochemistry.2006,45,4915-4926
26.B.Wang,F.Yang,Y.Shan,W.Qiu,J.Tang,Tetrahedron,2009,65,5409-5412
27.27a)E.W.Ping,R.Wallace,J.Pierson,T.F.Fuller and C.W.Jones,Micropor.Mesopor.Mater.,2010,132,174-18027b)M.Shakeri,C.Tai,E.S.Oscarsson and J.Chem.Eur.J.,2011,17,13269-13273.27c)E.V.Johnston,O.Verho,M.D.M.Shakeri,C.Tai,P.Palmgren,K.Eriksson,S.Oscarsson and J.Chem.Eur.J.,2012,18,12202-12206 27d)L.Deiana,S.Afewerki,C.Palo-Nieto,O.Verho,E.V.Johnston and A.Córdova,Sci.Rep.,2012,2,851.；DOI:10.1038/srep00851
28.M.Edin,J.and A.Córdova,Tetrahedron Lett.,2004,45,7697-7701
29.T.Patil,N.；Huo,Z.；B.Bajracharya,G.；Yamamoto,Y.,J.Org.Chem.2006,71,3612.