通过酚羟基连接的药物活性二聚体的制作方法

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年4月28日提交的美国临时申请序列号61/985,207、2015年1月9日提交的美国临时申请序列号62/101,768以及2015年1月9日提交的美国临时申请序列号62/176,883的优先权，各申请的披露内容通过引用并入本文。关于对在联邦政府资助的研发下作出的发明的权利的声明不适用。关于光盘递交的“序列表”、表格或计算机程序清单附件的引用不适用。
背景技术：
：叔丁啡(式1)是蒂巴因的半合成阿片衍生物。它是混合激动剂-拮抗剂阿片受体调节剂，用于以较高剂量治疗阿片类成瘾，以较低剂量控制非阿片类药物耐受的个体的中度急性疼痛，并且以甚至更小剂量控制中度慢性疼痛。叔丁啡在胃肠道被吸收，全身性作用。纳洛酮(式2)是纯粹的阿片类拮抗剂。纳洛酮是用来逆转阿片样物质诱导的中枢神经系统抑郁、呼吸系统和低血压的药物。纳洛酮可与口服的阿片类药物相结合，以减少它们滥用的风险。纳洛酮在胃肠道中被吸收，并且可以全身性作用，从而导致阿片戒断症状。纳曲酮(式3)是在治疗酒精依赖和阿片依赖中主要使用的阿片类拮抗剂。通常以盐酸盐形式(即盐酸纳曲酮)销售。纳曲酮也在胃肠道中被吸收且全身性起作用。像纳洛酮一样，纳曲酮可能诱发阿片类戒断症状。去甲文拉法辛(式4)也称为O-去甲文拉法辛，是5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂类的抗抑郁药。它已被考虑用于治疗慢性特发性便秘和胃轻瘫，但由于它全身性作用且其中枢神经系统(CNS)的影响可包括性功能障碍，因此在未患抑郁症的人上出于那些目的进行使用是禁忌。对乙酰氨基酚(式5)，化学名称为N-乙酰基-对氨基苯酚，是在美国最广泛使用的药物之一。它是不需处方可以开具的镇痛剂和退热剂，通常以商品名泰诺出售。对乙酰氨基酚分类为温和的镇痛剂。它常用于头痛和其他轻微疼痛的缓解，是在众多感冒和流感医治中的主要成分。与阿片类镇痛药组合，对乙酰氨基酚也可以用于治疗更严重的疼痛，如手术后疼痛和为晚期癌症患者提供姑息治疗。对乙酰氨基酚的醌代谢物是肝毒性的。尽管通常认为对乙酰氨基酚的使用剂量是无害的，但急性和慢性过量可能是致命的。沙丁胺醇(式6)是用于在如哮喘和慢性阻塞性肺病的病症中缓解支气管痉挛的短效β2-肾上腺素能受体激动剂。它放松呼吸道的肌肉并增加空气流动到肺部。沙丁胺醇还用于防止运动诱发的支气管痉挛。它通常是通过吸入给予，从而避开肝脏内的高首过代谢。其高度变化的生物利用度已被归因于它的酚羟基。这些药物的共同特点是单一酚羟基。这类基团赋予光不稳定性并在胃肠道中经受快速的系统前或首过代谢，从而多样性化形成硫酸酯或葡糖苷酯。叔丁啡和去甲文拉法辛还经受酶促降解(CYP3A4和CYP2A6)。为了避开随之而来的生物利用度降低，如叔丁啡和纳洛酮的药物最常见是通过注射或舌下给药。腹泻型肠易激综合征(IBS-D)IBS-D是非常普遍的胃肠疾病，除了腹泻，它常伴有内脏痛觉过敏(来自结肠刺激的增强的疼痛)、不适、腹胀和放气。伊卢多啉森林实验室公司(ForestLaboratories,Inc.))是一种μ阿片受体激动剂和δ阿片受体拮抗剂，在三期测试中已符合大便性状改进和减少腹痛的主要测试指标，尽管对减少导致痛觉过敏的结肠超敏反应没有可展示的效果。此外，几例严重的胰腺炎(一种潜在的威胁生命的疾病)，已在二期试验中报道过。甚至将已知胆道疾病史的患者排除出临床研究登记名单后，仍然有胰腺炎病例的报导。通常，μ激动剂对奥狄氏括约肌(一种调节胆汁和胰液从胆管流入十二指肠的肌肉阀)具有收缩作用。对于具有μ-受体激动剂活性且处方为长期使用的药物，不导致对奥狄氏括约肌的收缩是非常重要的。因此，长期需要一种IBS-D的长期治疗手段，它可降低肠道蠕动从而降低腹泻的发生率的，是镇痛型的，与胰腺炎不相关，并且不仅仅是治疗症状，能够解决与IBS-D相关的潜在的超敏反应和导致的痛觉过敏。技术实现要素：我们已经发现，通过它们酚羟基的O-烷基化，对药物试剂确定基团的二聚化，使得活性剂的残基通过乙烯接头桥接，并相对活性单体而言获得明显优势，同时保留它们的受体药理学。阿片类药物和其他药剂的特点是单个酚羟基，由乙烯接头通过这类基团共价连接两个这类药剂，可获得同型二聚体，它基本上比它们的母体分子更耐受系统前代谢。乙烯连接是高度稳定的，并在特定的情况下还产生其他明显的优点。在阿片样物质叔丁啡、纳洛酮和纳曲酮的情况下，相应二聚体是抗篡改的(例如，通过厨房化学将其转化为滥用药物)；且基本上不在胃肠道吸收，允许它们在外周被利用，而不进入会伴有后续不利影响(如成瘾或阿片戒断)的中枢神经系统。去甲文拉法辛的二聚化，防止活性剂穿过血脑屏障，尽管该二聚体对治疗抑郁症不再有效(需要中枢神经系统的渗透)，但其功能性配体保持有效并在肠道中局部作用，这样避免所有中枢介导的不良事件，包括性功能障碍。因此，二聚化使得药剂安全用于治疗胃轻瘫和慢性特发性便秘。去甲文拉法辛二聚体有望作为外周5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂。与去甲文拉法辛不同，二聚体预期仅在胃肠道外周起作用。5-羟色胺本身对胃肠道具有推进效果，因此，二聚物可以用于治疗肠疾病，如胃轻瘫、慢性特发性便秘和假性肠道梗阻(肠梗阻)。根据本发明，二聚的对乙酰氨基酚的效果，是为了防止形成母体化合物的醌代谢物，该代谢物在急性和慢性使用中具有肝毒性。此外，阻断单体的酚羟基，二聚化降低活性剂的离子性，潜在地增强了透过血-脑屏障输送以及由此镇痛效果。沙丁胺醇二聚化增强了对胃肠道和肝脏代谢的耐受性，从而在口服用于治疗支气管痉挛时增加了药物的生物利用度，其中支气管痉挛发生于各种不同的肺部疾病，包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病。在至少吗啡喃化合物的情况下，直到目前，当在研究例如前药活性中对活性药剂进行衍生化时，常规想法似乎一直是：酚羟基是要避免的，以免受体结合受到不利影响。令人惊奇的是，尽管涉及对相应单体的酚羟基的衍生化，但据信本发明的化合物保留了它们的特有活性。附图说明图1为叔丁啡二聚体盐酸盐的合成路线图。图2为纳洛酮二聚体盐酸盐的合成路线图。图3为纳曲酮二聚体盐酸盐的合成路线图。图4为去甲文拉法辛二聚体盐酸盐的合成路线图。图5为对乙酰氨基酚二聚体的合成路线图。图6为沙丁胺醇二聚体的合成路线图。在图6中，DHP为二氢吡喃，t-BuNH2为叔丁胺，TBSCI为叔丁基二甲基氯硅烷；LAH为氢化铝锂；(Boc)2O为二叔丁基二碳酸酯；AcOH为乙酸。图7为柱状图，示出在辅助因子存在和不存在下，暴露于CYP酶时，叔丁啡二聚体的稳定性。图8为柱状图，示出叔丁啡二聚体对水性条件，以及酸性和碱性条件的稳定性，各个分别在室温和在140°F下经过一段指定时间。图9为叔丁啡二聚体受体结合实验–μ受体结果图。图10为叔丁啡二聚体受体结合实验–κ受体结果图。图11为叔丁啡二聚体μ激动剂功能试验结果图。图12为叔丁啡二聚体μ拮抗剂功能试验结果图。图13为叔丁啡二聚体的口服和静脉生物利用度结果图。图14为根据实施例7评价的应激诱导的雄性CD-1小鼠的粪便量图。图15示出叔丁啡二聚体以剂量依赖性方式降低粪便量。图16示出根据实施例7，在炎症后模型中叔丁啡二聚体对胃肠蠕动的作用。图17为柱状图，示出当在辅助因子存在或不存在时，暴露于CYP酶时，纳洛酮二聚体盐的稳定性。图18为柱状图，示出纳洛酮二聚体对水性条件以及酸性和碱性的稳定性，各个分别在室温和在140°F下经过一段指定时间。图19显示了纳洛酮二聚体和纳洛酮的人μ阿片受体结合试验的结果。图20为柱状图，示出纳洛酮二聚体盐在小鼠中缓解洛哌丁胺诱发的便秘的效果。具体实施方式二聚体的药物组合物–概述在一些实施方式中，本文提供包含二聚体的药物组合物。药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。说明性的药学上可接受的载体和制剂描述如下。应理解，在本文讨论的任一或全部的治疗方法和组合物中，二聚体的药学上可接受的盐可以用于替代二聚体或作为二聚体的补充。因此，在具体实施方式中，二聚体的药学上可接受的盐(即任何二聚体的任何药学上可接受的盐)可用于本发明的方法。这些盐可以，例如，在最终分离和纯化化合物期间原位制备，或各自通过将其自由碱形式的纯化化合物与合适的有机或无机酸反应并分离由此形成的盐来制备。在一些实施方式中，采用乙酸、海藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖醛、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、硫酸、酒石酸、或对甲苯磺酸，来制备二聚体药学上可接受的盐。对于能够用于本文描述方法中的药学上可接受的盐的进一步描述，参见，如S.M.Berge等人,“药用盐(PharmaceuticalSalts),”1977,J.Pharm.Sci.66:1-19，该文献通过引用全部并入本文。本发明的二聚体，可以是以非溶剂化的，或与药学上可接受的溶剂例如水、乙醇等以溶剂化(物)的形式存在。出于本发明的目的，一般而言，溶剂化形式被认为等同于非溶剂化形式。在一具体的实施方式中，二聚体的溶剂化形式是水合物。通常，盐形成可改善所得治疗剂的保质期。适当的盐的合成可提供结晶的、不易发生氧化且易于处理的产品。可以制备各种盐，得到稳定的结晶化合物。几个例子是盐酸盐、硫酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、和抗坏血酸盐。在一些具体实施方式中，这样的药物组合物可被配制成口服片剂或胶囊、延长释放的口服片剂或胶囊(硬明胶胶囊，软明胶胶囊)、舌下片剂或薄膜、或延长释放的舌下片剂或膜。在下面更详细描述这些说明性的药学上可接受的载体和制剂。药物组合物、剂量和给药途径本文提供的二聚体可以以常规制剂的形式口服给药于对象，如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒、粉末、锭剂、丸剂、栓剂、口服悬浮液、糖浆、口服凝胶剂、喷雾剂、溶液和乳液。可以通过通常使用的方法制备合适的制剂，采用常规的有机或无机添加剂，如赋形剂(例如，蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙或碳酸钙)，粘合剂(例如，纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖或淀粉)，崩解剂(如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、低取代羟丙基纤维素、碳酸氢钠、磷酸钙或柠檬酸钙)，润滑剂(例如，硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石粉或月桂基硫酸钠)，矫味剂(例如，柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸或橘粉)，防腐剂(例如，苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)，稳定剂(如柠檬酸、柠檬酸钠或乙酸)，悬浮剂(例如，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硬脂酸铝)，分散剂(如羟丙基甲基纤维素)，稀释剂(例如，水)，和底蜡(如可可脂、白凡士林或聚乙二醇)。实施例提供以下实施例用于说明，但不限于要求保护的发明。实施例1叔丁啡二聚体盐酸盐如图1所示合成叔丁啡二聚体。中间体2的合成：将叔丁啡盐酸盐(5.0g,10.68毫摩尔,1当量)和碳酸钾(42.73毫摩尔,4当量)加入三口圆底烧瓶，随后加入无水DMSO(50ml,10体积)。将混合物加热至60摄氏度并缓慢加入1,2-二溴乙烷(3.7mL,42.72毫摩尔,4当量)。在60摄氏度搅拌反应混合物16小时，然后冷却至室温，用水稀释并用二氯甲烷萃取。采用盐水洗涤有机层，干燥(无水Na2SO4)，过滤并减压浓缩，从而获得粘性液体。通过硅胶色谱采用0-5％MeOH/DCM纯化粗产物,从而获得4.2g(69％)中间体2，为米白色泡沫状固体。中间体3的合成：将叔丁啡盐酸盐(1.74g,3.72毫摩尔)和碳酸钾(2.0g,14.87毫摩尔,4当量)加入三口圆底烧瓶，随后加入无水DMSO(10mL)。将混合物加热至60摄氏度并经2小时滴加溶于7mL无水DMSO的中间体2(3g,5.22毫摩尔,1.4当量)。在60摄氏度搅拌反应混合物16小时，然后冷却至室温，用水稀释并用二氯甲烷萃取。采用盐水洗涤有机层，干燥(无水Na2SO4)，过滤并减压浓缩,从而获得粘性液体。通过硅胶色谱采用0-5％MeOH/DCM纯化粗产物,从而获得二聚体3，为泡沫状固体(2.8g,77％)。二聚体盐酸盐的合成:在氮气，于室温，将5.5g(5.7毫摩尔)双共轭物3溶于50mL乙酸乙酯。室温滴加3.43mL(6.9毫摩尔,1.2当量)乙醚中的2NHCl。在室温下再搅拌反应混合物一小时，过滤获得固体。进一步用100mL乙酸乙酯洗涤固体并真空干燥，从而获得白色固体(5.8g,98％)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ9.75(br,2H),6.88(d,J＝9.2Hz,2H),6.67(d,J＝9.2Hz,2H),4.66(s,2H),4.23-4.42(m,4H),3.84-3.92(m,2H),3.40(s,6H),3.21-3.35(m,5H),2.98-3.20(m,7H),2.64-2.85(m,4H),2.12-2.26(m,4H),1.72-1.94(m,4H),1.38-1.52(m,4H),1.26(s,6H),0.99(s,20H),0.48-0.76(m,10H),0.32-0.42(m,4H)；MS:m/z962(M+1)+。实施例2体外试验：叔丁啡二聚体的代谢稳定性采用帝肯(Tecan)液体处理系统或等效系统，于37±1℃在有或无辅助因子，NADPH-生成系统，在包含磷酸钾缓冲液(50mM,pH7.4)、MgCl2(3mM)和EDTA(1mM,pH7.4)的0.2-mL孵育混合物(终体积)中，在96孔板指示的终浓度下进行二聚体(例如，1μM)和人肝微粒体(例如，1毫克蛋白质/毫升)的孵育。NADPH-生成系统由NADP(1mM,pH7.4)、葡萄糖-6-磷酸(5mM,pH7.4)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1单位/mL)组成。叔丁啡二聚体溶于甲醇水溶液(甲醇0.5％v/v或更低)。通常通过加入辅助因子开始反应，并通过等体积的终止试剂(例如，乙腈，0.2mL，含内标)，在四个指定的时间点(例如，至多120分钟)停止反应。零点时间孵育作为100％的值，以确定底物百分比损失。除了零点时间样本(一式四份进行孵育)外，一式三份进行孵育。零-辅因子(无NADPH)孵育，是在零时间和最长的时间点进行。样本经离心(例如，920xg，10min，10℃)并通过LC-MS/MS分析上清部分。采用微粒体和标记的底物(例如，右美沙芬，以监测底物损失)作为阳性对照，进行额外的孵育从而确定测试系统是否能够代谢。上述样品通过LC-MS/MS方法进行分析。在各孵育溶液中对样品进行分析。通过在实验时间过程比较峰比率(通常被报告为“％亲本剩余”)确定结果。采用LIMS(包括伽利略(Galileo),赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientificInc.)和报告工具,水晶报表(CrystalReports),SAP),电子制表软件计算机程序微软Excel(MicrosoftCorp.)或等价物，计算数据。采用LIMS，“分析员仪器控制和数据处理软件”(ABSCIEX)或等价物，基于分析物/内标物(IS)的峰面积比，评价未改变母体化合物的量(以确定各孵育中底物残留的大概百分数)。结果：结果示于图7，表明在测试期间在微粒体酶存在下，叔丁啡二聚体是相对稳定的。微粒体酶通常负责药物如叔丁啡的代谢。在微粒体存在下，以及有或无辅助因子存在下，二聚体是稳定的。在2小时终止反应，因为在37℃孵育温度超过2小时后，酶通常不稳定。实施例3叔丁啡二聚体的应激稳定性试验本研究帮助理解潜在滥用者使用家用化学品如小苏打、酸或在水中简单加热从而裂解二聚体的难易程度。于室温，在未处理的自来水和在酸(1NHCl)或碱(5％碳酸氢钠水溶液)存在下，评估叔丁啡二聚体的稳定性。在那些条件下，二聚体相对稳定，且在这些条件下没有降解为叔丁啡。参见图8。结果：如图8所示，在室温或在升高的温度，在极端pH，甚至长达30分钟，叔丁啡二聚体保持稳定，没有降解释放叔丁啡。这些研究也助于理解二聚体在IBS-D患者和健康对象两者胃肠道(沿其长度呈现梯度pH)中的稳定性。pH值范围为：从因胃壁细胞盐酸排泄导致的pH1至结肠内pH8。胃肠道的近端部分是酸性最大的，而远端是酸性最小的。实施例4受叔丁啡二聚体的受体结合活性本实施例阐明本发明提供的叔丁啡二聚体与以下受体的结合：μ-阿片受体、κ-阿片受体和δ-阿片受体。人μ阿片受体结合试验采用玻璃组织研磨机、特氟龙研棒和固定搅拌器(飞世尔科技)在测试缓冲液(50mMTris,pH7.5，含5mMMgCl2)中，将表达人μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞的膜(珀金埃尔默#RBHOMM400UA)进行匀浆。在测试板(96孔圆底聚丙烯板)内，将膜浓度调节至300μg/mL。待测试的化合物溶于DMSO(Pierce)，10mM，然后在测试缓冲液中稀释至3.6nM。在第二个96孔圆底聚丙烯板(被称为预混物板)内，将60μL的6X化合物与60μL3.6nM3H-纳洛酮混合。从预混板转移50μL至含有膜的测试板，一式两份。测试板在室温下孵育2小时。采用0.3％聚乙烯亚胺预处理GF/C96孔过滤板(珀金埃尔默#6005174)30分钟。使用帕卡德过滤(PackardFiltermate)收集器，通过过滤板过滤测试板中的内容物，在4℃采用0.9％盐水洗涤3次。干燥过滤板，底面密封，将30μLMicroscint20(Packard#6013621)加入各孔。采用Topcount-NXT微板闪烁记数器(Packard)检测2.9到35KeV的发射能量。将结果与最大结合(没有抑制的孔)进行比较。在50μM未标记纳洛酮的存在下，测定非特异性结合。叔丁啡二聚体的生物学活性示于图9。结果：图9的图示出二聚体对阿片μ受体具有显著的亲合力。在10-8M(～10ng)，叔丁啡二聚体的阿片μ受体亲合力与叔丁啡的类似。人κ阿片受体结合试验采用玻璃组织研磨机、特氟龙研棒和固定搅拌器(飞世尔科技)在测试缓冲液(50mMTris,pH7.5，含5mMMgCl2)中，将表达人κ阿片受体的克隆的HEK-293细胞的膜(英国安玛西亚生物科学有限公司.6110558200U)进行匀浆。在测试板(96孔圆底聚丙烯板)内，将膜浓度调节至300μg/mL。待测试的化合物溶于DMSO(Pierce)，10mM，然后在测试缓冲液中稀释至3.6nM。在第二个96孔圆底聚丙烯板(被称为预混物板)内，将60μL的6X化合物与60μL3.6nM3H-二丙诺啡混合。从预混板转移50μL至含有膜的测试板，一式两份。测试板在室温下孵育18小时。采用0.3％聚乙烯亚胺预处理GF/C96孔过滤板(珀金埃尔默#6005174)30分钟。使用帕卡德过滤(PackardFiltermate)收集器通过过滤板过滤测试板中的内容物，在4℃采用0.9％盐水洗涤3次。干燥过滤板，底面密封，将30μLMicroscint20(Packard#6013621)加入各孔。采用Topcount-NXT微板闪烁记数器(Packard)检测2.9到35KeV的发射能量。将结果与最大结合(没有抑制的孔)进行比较。在50μM未标记纳洛酮的存在下测定非特异性结合。叔丁啡二聚体的生物学活性示于图10。结果：图10描述叔丁啡二聚体的阿片κ受体激动剂图。叔丁啡单体或叔丁啡二聚体都没有损失κ受体亲合力。定性地，同叔丁啡一样，叔丁啡二聚体结合至阿片κ受体是随浓度增加的。据估计在约1μg时，二聚体的阿片κ受体亲合力与叔丁啡类似。人δ阿片受体结合试验设计试验检测化合物干预氚代纳曲吲哚与人δ亚型2阿片受体结合的能力。采用玻璃组织研磨机、特氟龙研棒和固定搅拌器(飞世尔科技)，在测试缓冲液(50mMTris,pH7.5，含5mMMgCl2)中，将表达人δ亚型2阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞的膜(珀金埃尔默#RBHODM400UA)进行匀浆。在测试板(96孔圆底聚丙烯板)内，将膜浓度调节至100μg/mL。待测试的化合物溶于DMSO，10mM，然后在测试缓冲液中稀释至6x所需终浓度。配体(3H-纳曲吲哚)(珀金埃尔默#NET-1065)也在测试缓冲液中稀释至6nM。将等份的3H-纳曲吲哚(50μL)转移至含有膜的测试板，一式两份。测试板在室温下孵育30分钟。采用0.3％聚乙烯亚胺预处理GF/C96孔过滤板(珀金埃尔默#6005174)30分钟。使用帕卡德过滤(PackardFiltermate)收集器，通过过滤板过滤测试板中的内容物，在4℃采用0.9％盐水洗涤3次。干燥过滤板，底面密封，将30μLMictoS＝scint20(Packard#6013621)加入各孔。采用Topcount-NXT微板闪烁记数器(Packard)检测2.9到35KeV的发射能量。将结果与最大结合(没有抑制的孔)进行比较。在1μM未标记纳曲吲哚的存在下测定非特异性结合。叔丁啡二聚体的生物学活性为7.6nM(IC50)和2.87(Ki)。相对于μ和κ阿片受体，二聚体具有弱δ受体亲合力。实施例5-受体刺激活性μ阿片受体激动剂和拮抗剂功能试验：表达人μ受体中国仓鼠卵巢(CHO-hMOR)细胞膜的[35S]GTPγS结合试验本实施例说明本发明提供的叔丁啡二聚体刺激μ-阿片受体-介导的信号转导的能力。简而言之，从受体生物公司(BaltimoreMd)购买CHO-hMOR细胞膜。将约10mg/ml膜蛋白悬浮于10mMTRIS-HCl(pH7.2,2mMEDTA,10％蔗糖)，悬浮液保持在冰上。1毫升膜加入15mL冷结合分析缓冲液，其包含50mMHEPES,pH7.6,5mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT和1mMEDTA。膜悬浮液采用匀浆器进行均质，并在3000rpm离心10分钟。然后在18000rpm离心上清20分钟。采用匀浆器将沉淀重悬于10毫升分析缓冲液。于25℃，在分析缓冲液中，膜与小麦胚芽凝集素包被的SPA珠(阿莫仙Amersham)一起预孵育45分钟。然后在分析缓冲液中，将偶联有膜(10μg/ml)的SPA珠(5mg/ml)和0.5nM[35S]GTPγS进行孵育。基线结合是在没有加入测试化合物的情况下发生的结合，这个未调节的结合被认为是100％，激动剂刺激结合升高至明显高于该值的水平。一系列浓度范围的受体激动剂SNC80被用来刺激[35S]GTPγS结合。在不存在激动剂下，测试基线和非特异性结合两者，非特异性结合检测包括10μM未标记的GTPγS。通过采用D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)作为标准品，评价其抑制激动剂刺激的GTPγS结合的潜力，从而测试叔丁啡二聚体作为拮抗剂的功能。采用帕卡德计数器量化放射性。计算以下参数：％刺激＝[(测试化合物cpm-非特异性cpm)/(基线cpm–非特异性cpm)]×100％抑制＝(％由1μMSNC80刺激-％在测试化合物存在下由1μMSNC80刺激)×100/(％由1μMSNC80刺激-100)。采用GraphPadPrism计算EC50。测试化合物的图示于图11和12。结果：图11示出的数据表明，叔丁啡二聚体是有效的μ激动剂。结果也表明，在10-6M(～1μg)时，二聚体的阿片μ受体活性与叔丁啡类似。图12的数据表明，叔丁啡二聚体不能作为μ-拮抗剂。实施例6体内药代动力学研究在这些动物药代动力学研究使用的动物为CD-1小鼠(约35克，n＝3，每个时间点)。测试的药物是叔丁啡和叔丁啡二聚体。剂量10毫克/千克静脉内和口服给予。在时间0时，30分钟和1、2、6和24小时收集血液。获得血浆后，如下通过LC/MS/MS分析药物血液样本。采用掺入任一试验药物(10-25000nM)的小鼠血浆，制备标准曲线。采用包含作为内标的氯沙坦或叔丁啡-d4的300μL乙腈萃取血浆样本(50μL)。于4℃在16000xg离心提取物5分钟。将上清转移至新管并在45℃在氮气下干燥1小时。采用100μL的30％乙腈重构样本，涡旋并离心。将上清(90μL)转移至LC小瓶，将10μL注入LC/MS。结果：图13描述了10mg口服和静脉内给药后二聚体的血浆浓度曲线。曲线图表明，口服和静脉内给药后如浓度曲线下面积比所测定的，二聚体的绝对生物利用度为1％或更小，而单体为约30％。实施例7体内试验：应激诱导的粪便量研究中采用的动物是雄性CD-1小鼠，平均体重约30至35克，每剂量组平均5只小鼠。小鼠通常装在群笼中，其中在聚碳酸酯笼中每笼3只，随意饮食和饮水。在实验的当天，运送小鼠到操作室，在试验化合物灌胃后，它们被单独放在配备有金属丝网的20厘米宽×20厘米深×15厘米高的笼子里。在测试过程中，动物随意饮食和饮水。以金属丝网为底的高笼，产生诱导小鼠应激的新环境。以小时为单位检测排泄颗粒的数量。结果示于图14。结果：图14显示，二聚体口服给药相对于空白剂(载体)显著地降低小鼠粪便量。研究的剂量为每千克小鼠25毫克和50毫克。即使从分析中去除表明极端敏感性零粪便量的动物，结果也不发生变化。图15显示小鼠粪便量随剂量发生降低，这标志真正的药理作用。体内试验：对炎症后改变的GI通过时间的影响设计本试验以检测测试物质对胃肠过敏伴随炎症的影响。通过注射新打开的芥末油(95％纯异硫氰酸烯丙酯，0.5％在乙醇中)，诱导雄性CD-1小鼠炎症后改变的GI运送。给药后，检测炎症后改变的GI段应激效果3-4周。在该点，GI段处于高度敏感的状态，即，对刺激具有显著更大的响应(痛觉过敏)。口服给药(灌胃)并通过将动物放入配有金属丝网底的笼(20厘米宽×20厘米深×15厘米高)内，使动物经受环境应激后，检测测试物质的效果。在测试过程中，动物随意饮食和饮水。以金属丝网为底的高笼，产生诱导小鼠应激的新环境。每小时到每两小时检测排泄颗粒的数量。见图16。结果：如图16所示，在25毫克/千克情况下，根据粪便量测定，叔丁啡二聚体显著地降低了该模型胃肠蠕动。该图还示出，没有用芥子油处理的小鼠粪便颗粒量是短暂的，持续时间不超过1小时。芥子油处理动物的颗粒排泄的增加，持续了甚至2小时。甚至在2小时，二聚体继续抑制胃肠蠕动，具有统计学的显著结果。实施例8纳洛酮和纳曲酮二聚体盐酸盐如图2所示，合成纳洛酮二聚体盐酸盐。中间体的合成3：将纳洛酮(5.0g,15.27毫摩尔,1当量)和碳酸钾(6.32g,45.8毫摩尔,3当量)加入500-mL三口圆底烧瓶，随后加入无水DMF(50ml,10体积)。将混合物加热至60摄氏度并通过注射器加入1,2-二溴乙烷(6.57mL,76.35毫摩尔,5当量)至反应混合物。在110摄氏度搅拌反应混合物16小时。TLC分析显示大部分中间体3。反应完成后，用水(150mL,30体积)稀释混合物，用乙酸乙酯(100mL,20体积)萃取。用乙酸乙酯(100毫升)萃取水层。用盐水(100毫升)洗涤合并的有机部分，用硫酸镁干燥并减压浓缩。通过硅胶色谱采用0-5％MeOH/DCM纯化粗产物，从而获得中间体3，为粘性油(1.25g)。中间体的合成4：将中间体3(1.25g,2.87毫摩尔)和碳酸钾(1.59g,11.52毫摩尔,4当量)加入含化合物1(0.57g，在15mLDMF中)的三口圆底烧瓶。将混合物在60℃加热，并通过TLC监测反应进程。将混合物冷却至室温，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取(50毫升×2)。将合并的有机相部分经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，从而获得黄色浆状物。通过硅胶色谱用0-4％MeOH/DCM纯化粗产物，从而获得纳洛酮二聚体4，为浅白色固体(0.55g)。纳洛酮二聚体盐酸盐5的合成:在氮气下，于室温，将5.5g(0.8毫摩尔)双共轭物4溶于10mL乙酸乙酯。室温滴加0.8ml(3.2毫摩尔,4.0当量)二氧六环中的4MHCl。在室温下再搅拌反应混合物一小时，过滤获得固体。进一步用20mLMTBE洗涤固体并真空干燥，从而获得白色固体(0.5g)。在235Nm，HPLC分析表明纯度98.2％(AUC)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):1.41-1.63(m,4H,CH2),1.98(d,2H,CH2),2.14(d,2H,CH2),2.63(dt,2H,CH2),2.88-3.19(m,6H,CH2),3.26-3.44(m,6H,CH2),3.62(d,2H,CH),3.72-3.84(m,2H,CH2),3.85-3.98(m,2H,CH),4.41(dd,4H,CH2),5.09(s,2H,OH),5.58(dd,4H,CH2),5.82-6.02(m,2H,CH),6.78(d,2H,Ar),6.90(d,2H,Ar),9.42(s,2H,NHCl).用摩尔当量的纳曲酮代替纳洛酮，类似地合成纳曲酮二聚体盐酸盐，如图3所示。实施例9纳洛酮二聚体的代谢稳定性采用与实施例3所述的叔丁啡二聚体实验类似的方案，考察纳洛酮二聚体的代谢稳定性。约1μM二聚体与人肝微粒体(1mg蛋白/ml)孵育至多1小时。通过LC/MS/MS测试孵育介质，以分析纳洛酮随时间的形成情况。如图17所示，随时间进展，没有形成纳洛酮的证据。实施例10纳洛酮二聚体的应激稳定性于室温，在未处理的自来水和在酸(1NHCl)或碱(5％碳酸氢钠水溶液)存在下，评估纳洛酮二聚体稳定性。方案与实施例3描述的叔丁啡二聚体的应激稳定性实验类似。在那些条件下，二聚体是相对稳定的，并且在这些条件下没有可检出的降解形成纳洛酮，如图18所示。实施例11纳洛酮二聚体盐酸盐的μ受体结合试验设计试验从而检测通过纳洛酮(10-10,10-9,19-8,10-7,10-6及10-5mol/L)和纳洛酮二聚体(10-10,10-9,10-8,10-7,10-6及10-5mol/L)，对示踪物DAMGO([酪氨酰-3,5-3H(N)]-[D-Ala2,N-Me-Phe,Gly5-ol]-脑啡肽乙酸酯)对大鼠阿片μ受体的抑制作用。在25℃下，温育试验材料60分钟。采用先前结合到[3H]N-DAMGO人μ阿片受体进行实验。DAMGO是对人μ阿片受体具有高亲和性的肽。随着纳洛酮或纳洛酮二聚体的浓度增加，它逐渐取代与受体结合的DAMGO，从而导致曲线的斜率下降，如图19所示。纳洛酮、纳洛酮二聚体和其他类似拮抗剂的结合亲合力在表1中提供。表1实施例12纳洛酮二聚体盐酸盐的便秘试验纳洛酮二聚体逆转阿片μ激动剂洛哌丁胺的便秘效果，如图20所示。在该研究中，一组小鼠进行温和的应激，这通常导致腹泻和肠胃蠕动，其中通过每小时排泄粪粒的数量测定。采用洛哌丁胺处理的组排泄粪粒的数量明显少于对照(载体)动物每小时排泄的粪粒。该结果证实了洛哌丁胺的便秘影响。在通过纳洛酮二聚体逆转洛哌丁胺效果的组中，经3小时或更久，每小时排出粪粒的数量多于洛哌丁胺处理的动物排出的粪粒，并与对照动物的排泄颗粒相当。结果表明，纳洛酮二聚体有效逆转了人μ阿片激动剂洛哌丁胺的便秘影响。纳洛酮二聚体提供了优于纳洛酮、纳曲酮、聚乙二醇化纳洛酮和甲基纳曲酮的显著益处，因为预期对胃肠道受体起作用而不会被吸收，从而可通常治疗阿片肠紊乱和特别治疗阿片诱导的便秘。纳洛酮二聚体还可以找到其他的治疗用途，如治疗腹胀，降低胃蠕动，腹部绞痛和GERD(胃食管反流病)。实施例13去甲文拉法辛二聚体盐酸盐如图4所示合成化合物。化合物2的合成.在60℃，在无水碳酸钾(3当量)存在下，DMF中的化合物1(1当量)与1,2-二溴乙烷(2当量)反应15小时。TLC分析表明原料化合物完全消耗。采用MTBE稀释混合物并用水洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物2。产率：61％。化合物3的合成.在5℃，将化合物2(1当量)加至甲醇(5当量)中的甲醇钠，并在0-5℃搅拌2小时。加入环己酮(2.5当量)并在0-5℃搅拌混合物4小时。采用饱和氯化铵溶液淬灭反应混合物，并浓缩。得到的残留物溶于乙酸乙酯和水。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物3。产率：74％。化合物4的合成.将雷尼镍(30wt％)加入化合物3(1当量)在乙酸(6体积)中的混合物。用氢气(30psi)吹扫混合物，然后在55℃在140-150psi下搅拌3小时，然后冷却至室温。通过硅藻土垫过滤混合物，浓缩滤液。将残余物溶于水中，并用MTBE洗涤，以除去任何未反应的物质。产物用碳酸氢盐溶液中和后，用乙酸乙酯萃取产物。乙酸乙酯层用硫酸镁干燥，过滤和浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物4。产率：85％。化合物5的合成.将37-40％甲醛(12当量)和甲酸(6当量)加入搅拌的4(1当量)的水溶液，将反应混合物在100℃下加热22小时，然后冷却至室温。用MTBE洗涤混合物然后用20％的NaOH溶液碱化至pH8-9。将有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物5。将产物溶于乙酸乙酯中，并加入2N盐酸的乙酸乙酯溶液。搅拌浆液30分钟，过滤并干燥，得到产物5。产率：79％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):0.96-1.58(m,20H,CH2),2.62(s,12H,CH3),2.94(dd,2H,CH),3.45(dd,2H,CH),3.63(dd,2H,CH),4.22(s,2H,OH),4.36(t,4H,CH2),6.76(d,4H,Ar),7.06(d,4H,Ar)。实施例14对乙酰氨基酚二聚体如图5所示合成化合物。中间体3的合成：在三口圆底烧瓶内，将对乙酰氨基酚(1当量)和碳酸钾(4当量)溶于无水DMF(10体积)中。将混合物加热至60摄氏度并加入1,2-二溴乙烷(4当量)。在60℃搅拌反应混合物16小时，TLC分析表明对乙酰氨基酚被消耗。采用MTBE稀释混合物，冷却至10℃并用水洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物3。产率：65％。化合物4的合成:将化合物3(1当量)、对乙酰氨基酚(1.2当量)和碳酸钾(3当量)溶于无水DMF(10体积)中，并在60℃加热混合物并搅拌14小时。TLC分析显示中间体3被消耗。采用MTBE稀释混合物并在15-20℃用水洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物，获得纯产物4。产率：78％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):2.14(s,6H,CH3),4.38(t,4H,CH2),6.80(d,4H,Ar),7.44(d,4H,Ar),9.15(s,2H,NH)。实施例15沙丁胺醇二聚体如图6所示合成化合物。化合物2的合成.在室温下，在DCM中10摩尔％PPTS存在下，化合物1(1当量)与1.2当量二氢吡喃反应。通过TLC分析监测反应。用碳酸氢盐溶液洗涤反应混合物，有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗产物2不经进一步纯化用于下一步骤。产率：95％。化合物3的合成.在室温下，采用1.2当量氯化铝处理DCM中的化合物2(1当量)，随后滴加氯乙酰氯(1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，TLC分析表明原料完全消耗。用碳酸氢盐溶液淬灭反应混合物。将有机相分离并用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物3，得到纯产物3。产率：72％。化合物4的合成.在室温下，化合物3(1当量)与THF中的2当量丁胺反应。15小时后TLC分析表明原料完全消耗。浓缩反应混合物，残余物通过硅胶色谱纯化，得到纯产物4。产率：96％。化合物5的合成.化合物4(1当量)溶解于THF并冷却至0℃。逐滴加入THF中的氢化铝锂(LAH)(1当量)，并在室温下搅拌混合物3小时。TLC分析显示原料被消耗。加入饱和硫酸钠水溶液，直至形成白色沉淀物。过滤固体并在减压下浓缩滤液，得到产物5。产率(78％)。化合物6的合成.在室温下，DCM中的化合物5(1当量)先采用1.2当量Boc-酸酐处理，接着用饱和碳酸氢钠溶液(2当量)处理。将反应混合物搅拌15小时，TLC分析显示原料完全消耗。分离有机相并浓缩，得到产物6。产率(94％)。化合物7的合成.采用咪唑(1.5当量)随后用TBDMSCl(1.2当量)处理DCM中的化合物6(1当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时，TLC分析显示原料完全消耗。将水加至反应混合物并分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物从而获得纯产物7。产率：85％。化合物8的合成.在60℃将7:3乙酸/水中的化合物7(1当量)加热10小时。TLC分析显示原料完全消耗。浓缩混合物，溶于MTBE，并用碳酸氢盐溶液洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物从而获得纯产物8。产率：68％。化合物9的合成.在60℃，在无水碳酸钾(3当量)存在下，DMSO中的化合物8(1当量)与1,2-二溴乙烷(5当量)反应15小时。TLC分析显示原料完全消耗。采用MTBE稀释混合物并用水洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物从而获得纯产物9。产率：62％。化合物10的合成.在50℃，在无水碳酸钾(2当量)存在下，DMSO中的化合物9(1当量)与化合物8(1.2当量)反应15小时。TLC分析显示原料化合物9完全消耗。采用MTBE稀释混合物并用水洗涤。分离有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物从而获得纯产物10。产率：74％。化合物11的合成.在室温下，MTBE中的化合物10(1当量)与乙酸乙酯中2NHCl(10当量)反应12小时。TLC分析显示原料化合物完全消耗伴随固体沉淀。过滤沉淀并用乙酸乙酯研磨，从而获得产物11。产率：88％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):1.04(s,18H,CH3),2.57(d,4H,CH2),4.42(t,2H,CH),4.45(t,4H,CH2),4.49(s,4H,CH2),4.63(s,6H,OH和NH),6.71(d,2H,Ar),7.01(d,2H,Ar),7.29(s,2H,Ar)。实施例16说明性的药物组合物表2中的药物组合物可以用于本发明二聚体的口服片剂。表2成分％w/w二聚体2乳糖83.6胶体二氧化硅0.67微晶纤维素10交联羧甲基纤维素纳3.4硬脂酸镁0.33实施例17说明性剂量可施用于患者的本发明所提供的二聚体的剂量，是相当广泛可变的，并且可经保健医生确定。剂量可能根据受治者的年龄、体重和身体状况以及给药的类型适当改变。在一实施方式中，一个剂量是每天给予。在任何给定的情况下，施用本发明提供二聚体的量将取决于多种因素，例如活性成分的溶解度、所使用的制剂和给药途径。所谓“治疗有效剂量”是指在统计学显著数目患者中产生可观和有益效果的剂量。在一些实施方式中，患者是哺乳动物。在更具体的实施方式中，患者是人。在某些具体的实施方式中，患者可以是驯养的哺乳动物如狗，猫，或马。例如，对于IBS-D患者，优选的剂量是在用于口服的单位剂量中，约0.15mg/kgIBS-D患者体重至约7.2mg/kg患者体重，更优选约0.7mg/kgIBS-D患者体重至约3.0mg/kg患者体重，还更优选约1.5mg/kg患者体重。或者，约10-约500mg，优选约50-约200mg，更优选约100mg，被给药于IBS-D患者。在表3中，我们提供本发明二聚体对优选适应症的推定剂量，并与用于其适应症的单体剂量相比较。二聚化在扩展这些活性剂范围的变革效果，在表中可明显看出。表3单体适应症剂量二聚体适应症二聚体剂量叔丁啡阿片上瘾2-32mg/SLIBS-D50-200mgPO纳洛酮阿片滥用0.5-2mgIV/SC阿片诱导的便秘100-200mgPO纳曲酮阿片滥用50mgPO阿片诱导的便秘100-200mgPO去甲文拉法辛抗抑郁剂50mgPO胃轻瘫、便秘、肠梗阻50-200mgPO沙丁胺醇支气管痉挛50mgIN支气管痉挛5-10mgPO对乙酰氨基酚镇痛500mgsPO肝脏安全镇痛500-1000mgPO可以理解的是本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，各种明显修改或改变将被建议给本领域的技术人员并且被包括在本申请的精神和范围以及所附的权利要求的范围之内。如果在先申请和本申请间存在冲突到一定程度，那么以本申请优先来消除任何不一致之处。本文引用的所有出版物和专利通过引用以其整体为所有目的并入本文。当前第1页1 2 3