乳糖酶溶液及使用其的乳的制作方法

本发明涉及乳糖酶溶液以及使用其的乳、乳制品等的制造方法。

背景技术：

乳糖(lactose)不耐症是指：先天性地无法很好地分解乳糖，因此由于乳制品等食品中的乳糖而呈现腹痛、腹泻等诸症状的状态。乳糖是由半乳糖及葡萄糖构成的二糖。为了应对乳糖不耐症，在食品制造行业中进行了如下操作：通过作为酶的乳糖酶，将牛乳等中所含的乳糖预先分解成半乳糖和葡萄糖。

为了将牛乳等中所含的乳糖分解而使用的乳糖酶溶液一直以来通过下述方法制造：培养产乳糖酶微生物，由细胞内提取乳糖酶或获取分泌到细胞外的乳糖酶，除去来自培养物的杂质并纯化后，添加稳定剂并过滤灭菌。

所制造的乳糖酶溶液在冷藏(10℃以下)下进行保存、销售、运输。然后，乳糖酶溶液由使用者添加到牛乳等乳或乳制品中。该乳糖酶的添加方法主要有在乳等的杀菌前添加的方法、以及在杀菌后添加的方法这两种。前者的情况下，过滤除菌工序并不是必需的，与此相对，后者的情况下必须进行乳糖酶的过滤灭菌工序。添加乳糖酶后的乳在灌装后销售。

上述这种在杀菌后的乳等中添加乳糖酶的制造工艺中，在过滤灭菌工序中，乳糖酶溶液容易引起过滤器的堵塞，已知这是导致作业效率显著降低的原因。为了应对该问题，例如专利文献1(日本特公平6－73454号公报)记载了：在成为堵塞原因的蛋白质和多糖类的劣化产物形成之前、例如乳糖酶溶液刚回收后及刚纯化后，对乳糖酶液进行过滤灭菌。该方法可以在乳糖酶溶液制造时进行。但是，一旦形成劣化产物后则无法实施。这是由于，若将通过该方法制造的乳糖酶溶液在保存或运输后进行过滤，则有时会产生堵塞。例如，将通过该方法制造的乳糖酶运输给使用者后，该使用者为了在乳等中添加该乳糖酶而对该乳糖酶进行过滤灭菌工序时，有时会产生过滤器的堵塞。如果产生堵塞，则必须停止制造工序并更换过滤器，存在使作业效率显著降低的问题。特别是在制造乳的各制造工序连续进行的情况下，由于无法仅停止过滤灭菌工序，因此必须停止全部的乳制造工序。其结果是，导致乳的制造效率显著下降，需要对此进行改善。

因此，专利文献1中记载的方法未能解决制品化后的乳糖酶溶液的过滤中的堵塞问题。

另外，专利文献2(日本特表2004－534527号公报)记载了：使乳糖酶溶液中所含的多糖类和寡糖的浓度为一定值以下，特别是通过色谱来除去这些物质。但是，即使使多糖类和寡糖的浓度为一定值以下，有时在如上所述地制品化后的过滤中同样会产生堵塞问题。

因此，上述问题尚未充分解决。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公平6－73454号公报

专利文献2：日本特表2004－534527号公报

技术实现要素：

发明要解决的课题

本发明的目的在于，提供将制剂化后的乳糖酶溶液添加使用在乳中之前的过滤工序中的使过滤装置(过滤器)的堵塞降低的方法、以及不易引起过滤装置堵塞的乳糖酶溶液。

用于解决课题的手段

本发明人等发现，堵塞现象由于搅拌、振荡之类的物理刺激和/或温度负荷而产生、加速。并且发现，通过降低乳糖酶溶液中所含的物质间的相互作用而可防止堵塞现象，并完成了本发明。

因此，根据本发明，提供以下方案。

〔1〕一种乳糖酶溶液，其特征在于，以达到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的浓度在100rpm、10℃下进行16小时的搅拌处理，然后，以达到1,000NLU/g或2,000ALU/g的活性的浓度使其从孔径0.22μm的膜过滤器透过366kg/m²时，透过速度为5kg/min×m²以上；

〔2〕根据上述〔1〕所述的乳糖酶溶液，其特征在于，将透过试验刚开始后(透过20g时)的透过速度设为100％时，透过试验结束时(透过180g时)的透过速度为10％以上；

〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的乳糖酶溶液，其含有凝聚抑制剂；

〔4〕根据上述〔3〕所述的乳糖酶溶液，其中，凝聚抑制剂为选自HLB12～15的表面活性剂、保护剂及金属离子或其盐中的一种以上；

〔5〕根据上述〔3〕或〔4〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述HLB12～15的表面活性剂的浓度为0.001质量％～5质量％；

〔6〕根据上述〔4〕或〔5〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述保护剂为选自聚醚及增粘多糖类中的一种以上；

〔7〕根据上述〔6〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述聚醚是亚烷基的碳数为2～8的聚亚烷基二醇；

〔8〕根据上述〔7〕所述的乳糖酶溶液，其中，上述聚亚烷基二醇的浓度为0.05质量％～15质量％；

〔9〕根据上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的乳糖酶溶液，其中，乳糖酶的活性为10～100,000NLU/g或10～100,000ALU/g；

〔10〕根据上述〔1〕～〔9〕中任一项所述的乳糖酶溶液，其含有稳定剂；

〔11〕一种乳，其是通过添加上述〔1〕～〔10〕中任一项所述的乳糖酶溶液而得到的；

〔12〕一种乳制品，其是至少将上述〔1〕～〔10〕中任一项所述的乳糖酶溶液或上述〔11〕所述的乳作为一种原料而得到的；

〔13〕一种乳糖酶溶液，其含有凝聚抑制剂。

发明效果

根据本发明，将乳糖酶溶液添加使用在乳中之前的过滤工序中的过滤器堵塞的问题可得到改善。由此，可以降低由堵塞所带来的过滤器更换及与此相伴随的生产线的灭菌等频度，大幅提高作业效率。另外，本发明与基于除去堵塞物质等的现有方法相比，简便，在乳糖酶溶液的保存中不会再次形成堵塞物质的方面也优良。

附图说明

图1：图1为示出对引起堵塞现象的原因进行研究而得的结果的图。框图(パネル)A、框图B、框图C分别示出在10℃、20℃、30℃振荡或静置后测定过滤器透过性的结果。框图D示出在各温度下振荡或静置时的乳糖酶活性的测定结果。

图2：图2为示出通过在10℃搅拌16小时来再现堵塞现象的结果的图。

图3：图3示出添加各种表面活性剂对防止堵塞现象的有效性的研究结果。图3中，◆示出无添加的样品的情况，●示出加入吐温80作为添加剂的情况，×示出加入TritonX(Tx)－100作为添加剂的情况，－示出加入RYOTO聚甘油酯作为添加剂的情况。

图4：图4示出添加各种聚乙二醇(PEG200、PEG400、PEG4000、PEG6000、PEG20000)对防止堵塞现象的有效性的研究结果。图4中，◆示出无添加的样品，●、○、▲及△分别示出加入各种聚乙二醇作为添加剂的情况。

图5：图5示出改变TritonX－100(框图A)及吐温80(框图B)的添加浓度对防止堵塞现象的有效性的研究结果。

图6：图6示出改变PEG6000(框图A)及PEG20000(框图B)的添加浓度对防止堵塞现象的有效性的研究结果。

图7：图7示出改变Mg盐添加浓度对防止堵塞现象的有效性的研究结果。

具体实施方式

本发明的乳糖酶溶液必须含有乳糖酶及防止该乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质凝聚的凝聚抑制剂，任选还含有稳定剂等添加剂。以下按照(1)乳糖酶溶液的构成成分、(2)乳糖酶溶液的组成(特别是凝聚抑制剂的浓度)、(3)乳糖酶溶液的性质、(4)乳糖酶溶液的制造方法、(5)乳糖酶溶液的使用方法·用途的顺序进行说明。

《乳糖酶溶液的构成成分》

＜乳糖酶＞

(原料生物的种类)

从包括微生物在内的非常广范的生物中，分离出乳糖酶。乳糖酶多数情况下为克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、杆菌属(Bacillus)之类的微生物的细胞内或细胞外成分。克鲁维酵母属、特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)及乳酸克鲁维酵母(K.lactis)以及念珠菌属(Candida)、酵母属(Torula)及球拟酵母菌属(Torulopsis)的酵母等是作为酵母酶的乳糖酶的通常来源，另一方面，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)或环状芽孢杆菌(B.circulans)是细菌乳糖酶的公知来源。来自这些生物的乳糖酶制备物可以由几种商业渠道获得。这些乳糖酶的最适pH均为pH＝6～pH＝8，因此是所谓的中性乳糖酶。另外，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多色青霉(Penicillium multicolor)产生细胞外乳糖酶，美国专利第5,736,374号的说明书中记载了由米曲霉产生的、这种乳糖酶的例子。最适pH、最适温度等乳糖酶的酶学特性根据物种而变化。通常，细胞外乳糖酶的最适pH为pH＝3.5～pH＝5.0，较低，为所谓的酸性乳糖酶。

本发明中，优选使用中性乳糖酶以及酸性乳糖酶，特别优选使用来自克鲁维酵母属的中性乳糖酶以及来自曲霉属(Aspergillus)的酸性乳糖酶。

(乳糖酶的制法)

本发明中使用的乳糖酶可以是通过现有的常规方法从微生物中回收、纯化后的乳糖酶。本发明中使用的乳糖酶可以是细胞内乳糖酶或细胞外乳糖酶中的任一种。为前者的情况下，乳糖酶通常来自微生物的细胞质。作为细胞内乳糖酶溶液的具体制造方法，可以列举例如首先进行微生物的培养，然后分离乳糖酶的方法。该方法中，为了使酶从细胞质中释放出来而需要破坏细胞壁。为了溶解细胞，使用利用辛醇等有机溶剂进行的细胞壁透过化、超声波分解或弗氏压碎等技术。可以从溶解后的细胞中通过公知方法分离·回收乳糖酶。在为后者的情况下，不需要进行上述细胞壁的破坏，例如，可以在培养后通过离心分离或过滤来取得培养液中的细胞。在发酵停止后或细胞取出后，从培养液中回收乳糖酶。任意情况下均可以通过现有手段进一步对乳糖酶进行纯化及分离。

＜凝聚抑制剂I＞

本发明的乳糖酶溶液含有防止该乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质凝聚的凝聚抑制剂。本发明中使用的适宜的凝聚抑制剂为(类型1)HLB12～15的表面活性剂、(类型2)脂肪亲和性表面活性剂、(类型3)非离子性脂肪亲和性表面活性剂、(类型4)非离子性表面活性剂、(类型5)天然产物系表面活性剂。更适宜的是HLB12～15的非离子性表面活性剂。可理解为：通过使这种凝聚抑制剂存在于体系中，从而降低或防止了蛋白质的疏水性相互作用，其结果，即使在长时间搅拌、振荡等时也可以防止由于凝聚而导致的堵塞物质的形成。从水系溶液中的乳化稳定性及疏水性物质的分散效果高的观点出发，优选HLB12～15的表面活性剂。以下对这些表面活性剂进行详细说明。需要说明的是，这些类型是根据物性、来源等进行分类的，存在属于某一类型的成分还属于另一类型的情况。另外，还可以将同一种表面活性剂中的多种组合使用，或者将不同种类的表面活性剂中的多种组合使用。

(类型1)

首先，HLB12～15的表面活性剂中的“HLB”是通过Griffin法算出的值。另外，更适宜的HLB为13～15。作为类型1的表面活性剂，除了阴离子性表面活性剂及两性离子表面活性剂以外还可以使用后述的非离子性表面活性剂。

(类型2)

然后，作为脂肪亲和性表面活性剂，可以列举例如：醇、聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸、胆汁酸、甘油脂肪酸酯、乙酰化甘油脂肪酸酯、低级醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、聚丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油酯、单/二甘油酯的乳酸衍生物、丙二醇二甘油酯、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、反式酯化植物油、甾醇、甾醇衍生物、糖酯、糖醚、蔗糖甘油酯(sucroglyceride)、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯氢化植物油、多元醇与选自脂肪酸、甘油酯、植物油、氢化植物油及甾醇中的至少一种要素的反应混合物、以及它们的混合物。

(类型3)

另外，作为非离子性脂肪亲和性表面活性剂，可以列举例如：烷基葡糖苷、烷基麦芽糖苷、烷基硫代葡糖苷、月桂基聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油酯、聚氧乙烯甾醇、它们的衍生物及类似物、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯氢化植物油、多元醇与选自脂肪酸、甘油酯、植物油、氢化植物油及甾醇中的至少一种要素的反应混合物、生育酚聚乙二醇丁二酸酯、糖酯、糖醚、蔗糖甘油酯以及它们的混合物。

(类型4)

进而，作为非离子性表面活性剂，可以列举：Brij35、聚氧乙烯(20)鲸蜡醚之类的正构烷基PEO单醚、Lubrol PX、Lubrol WX、nonidet P－40、聚(乙二醇)n10辛基苯基醚及聚(乙二醇)n7辛基苯基醚之类的正构烷基苯基PEO、四甲基丁基苯基PEO、正辛基葡糖苷、辛基－硫代吡喃葡糖苷、吐温－85、吐温－80、吐温－65、吐温－60、吐温－40及吐温－20、以及烷基芳基聚醚醇(TritonX－100)、聚乙二醇叔辛基苯基醚(TritonX－114)。

(类型5)

另外，作为来自天然产物的表面活性剂，可以列举：蔗糖脂肪酸酯、聚乙烯脂肪酸酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、皂树皂甙。

这些之中，最适宜的凝聚抑制剂I为选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如polysorbate80)、烷基芳基聚醚醇(例如TritonX－100)及甘油脂肪酸酯中的至少1种。

＜凝聚抑制剂II＞

作为防止本发明的乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质凝聚的凝聚抑制剂，可以使用具有覆盖乳糖酶等蛋白质的表面的作用的保护剂。作为保护剂，可以使用聚醚及增粘多糖类。

作为聚醚，可以列举：亚烷基的碳数为2～8的聚亚烷基二醇(例如，聚氧丙烯衍生物、聚乙二醇)等。从水合性高、具有极其柔软的结构骨架而有效地保护蛋白质的理由出发，聚亚烷基二醇中，聚乙二醇是适宜的。作为聚乙二醇的数均分子量，适宜为200～4000000，更适宜为400～20000。

可理解为：聚醚也具有亲水性部位和疏水性部位，因此可以防止乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质的疏水性相互作用，其结果，具有降低堵塞物质的形成的效果。另外，可以将同一种聚醚中的多种组合使用，也可以将不同种的聚醚中的多种组合使用。

作为增粘多糖类，可以使用结冷胶、角叉菜胶、黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔胶、果胶、琼脂、明胶、阿拉伯胶、葡甘露聚糖、塔拉胶、普鲁兰多糖、罗望子种子多糖类、黄蓍胶、刺梧桐树胶、藻酸、藻酸钠、拟茎点霉胶(Macrophomopsis gum)、玉米淀粉和木薯淀粉等淀粉、糊精及环糊精。

＜凝聚抑制剂III＞

进而，作为防止乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质凝聚的凝聚抑制剂，可以列举具有盐溶效果的金属离子或其盐。从乳糖酶溶液中容易得到适当的离子强度的理由出发，金属离子中，胍离子、钙离子或Mg离子或者它们的盐是适宜的。

通过添加金属离子或其盐，溶液的离子强度变得适当，乳糖酶溶液中所含的乳糖酶等蛋白质的蛋白质间的疏水性相互作用减弱。其结果可理解为：蛋白质变得不易凝聚，对堵塞物质的形成具有降低效果。另外，可以将同一种金属离子或其盐中的多种组合使用，也可以将不同种金属离子或其盐中的多种组合使用。

这些凝聚抑制剂I～III可以单独使用，也可以将不同种类的凝聚抑制剂组合使用。例如，可以将凝聚抑制剂I与II、凝聚抑制剂II与III、凝聚抑制剂I与III以及凝聚抑制剂I、II与III一起使用。另外，由于凝聚抑制剂III单独时效果微弱，因此优选将凝聚抑制剂I与III、以及凝聚抑制剂II与III一起使用。

＜任选成分＞

本发明的乳糖酶溶液可以根据需要含有各种成分。作为具体例子，可以列举：有助于乳糖酶的稳定化的金属盐类、各种糖类、抗坏血酸、甘油等，用于提高可用性的作为赋形剂的淀粉、糊精，具有缓冲作用的无机盐类等。

《乳糖酶溶液的组成(特别是凝聚抑制剂的量)》

＜凝聚抑制剂I＞

乳糖酶溶液中，以乳糖酶溶液的总质量为基准，适宜以0.001质量％～5质量％的范围、更适宜0.01质量％～1质量％、进一步适宜0.1质量％～0.5质量％的范围来添加凝聚抑制剂I。

＜凝聚抑制剂II＞

乳糖酶溶液中，以乳糖酶溶液的总质量为基准，适宜以0.05质量％～15质量％的范围、更适宜0.3质量％～10质量％的范围、进一步适宜0.5质量％～5质量％的范围来添加凝聚抑制剂II。

＜凝聚抑制剂III＞

对于凝聚抑制剂III来说，在乳糖酶溶液中，作为金属成分，优选为0.1mM以上且20mM以下的浓度，更优选为0.25mM以上且15mM以下的浓度，进一步优选为0.5mM以上且10mM以下的浓度，最优选为1mM以上且5mM以下的浓度。盐溶效果高的顺序为胍离子、钙离子、镁离子。镁离子需要更高的浓度，胍离子及钙离子可以为比镁离子低的浓度。

《乳糖酶溶液的性质》

＜乳糖酶活性＞

本发明的乳糖酶溶液期望具有10～100,000NLU/g的中性乳糖酶活性，更期望具有100～90,000NLU/g的活性，进一步期望具有1,000～80,000NLU/g的活性。“NLU”为中性乳糖酶单位。活性的测定方法例如如下所述。通过将底物邻硝基苯基－β－吡喃半乳糖苷(ONPG)水解为邻硝基苯基及半乳糖来测定。通过添加碳酸钠而使反应结束。所形成的邻硝基苯基在碱性介质中变为黄色，吸光度的变化被用于测定酶活性(以NLU/g来表示)。其步骤公布在美国食品化学物质标准集(FCC；Food Chemicals Codex)第4版、1996年7月1日、第801～802页/乳糖酶(中性)(β－半乳糖苷酶)活性中。

本发明的乳糖酶溶液期望具有10～100,000ALU/g的酸性乳糖酶活性，更期望具有100～90,000ALU/g的活性，进一步期望具有1,000～80,000ALU/g的活性。“ALU”为酸性乳糖酶单位。活性的测定方法例如如下所述。通过将底物邻硝基苯基－β－吡喃半乳糖苷(ONPG)水解为邻硝基苯基及半乳糖来测定。通过添加碳酸钠来结束反应。所形成的邻硝基苯基在碱性介质中变为黄色，吸光度的变化被用于测定酶活性(以ALU/g来表示)。其步骤公布在美国食品化学物质标准集(FCC；Food Chemicals Codex)第4版、1996年7月1日、第802～803页/乳糖酶(酸性)(β－半乳糖苷酶)活性中。

本发明的乳糖酶溶液可以是中性乳糖酶溶液，也可以是酸性乳糖酶溶液，还可以是两者混合成的在中性～酸性范围内起作用的乳糖酶溶液。

＜搅拌后的透过速度(相对值)＞

就本发明的乳糖酶溶液而言，可以以达到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的浓度在100rpm、10℃下进行16小时的搅拌处理，然后将在下述条件下测定的透过试验刚开始后(透过20g时)的透过速度(Flux)设为100％，算出试验结束时(透过180g时)的透过速度减少了多少，从而来进行判断。透过试验结束时的透过速度越高越优选，优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为30％以上。上限值为例如75％。

乳糖酶溶液的活性可以通过用离子交换水稀释或进行超滤浓缩来调节。

＜搅拌后的透过速度(绝对值)＞

本发明的乳糖酶溶液，其特征在于，以达到5,000NLU/g或10,000ALU/g的活性的浓度在100rpm、10℃下搅拌处理16小时，然后在下述条件下测定的过滤器透过速度为5kg/min×m²以上。该过滤器透过速度优选为8kg/min×m²以上，进一步优选为10kg/min×m²以上，最优选为20kg/min×m²以上。

＜堵塞现象的再现条件＞

乳糖酶的过滤器堵塞现象可以通过对乳糖酶溶液进行往复振荡或搅拌操作而再现。进行往复振荡或搅拌操作的时间虽然也取决于加温温度及乳糖酶溶液中所含的活性值，但可以在30分钟～7天之间来设定，优选为1小时～6天，更优选为2小时～5天。进行往复振荡或搅拌操作时，对乳糖酶溶液进行加温可以促进堵塞现象。

乳糖酶溶液的往复振荡优选为10spm(往复/分钟)～300spm(往复/分钟)，更优选为20spm(往复/分钟)～250spm(往复/分钟)，进一步优选为30spm(往复/分钟)～200spm(往复/分钟)。

乳糖酶溶液的搅拌操作优选为10rpm(转/分钟)～300rpm(转/分钟)，更优选为20rpm(转/分钟)～250rpm(转/分钟)，进一步优选为30rpm(转/分钟)～200rpm(转/分钟)。

乳糖酶溶液的加温温度优选为5℃～70℃左右，更优选为6℃～65℃，进一步优选为7℃～60℃。随着温度的升高而容易产生堵塞现象。

乳糖酶溶液的乳糖酶活性在10～100,000NLU/g或10～100,000ALU/g的范围即可。活性值越高，则越容易产生堵塞现象。

＜过滤器透过性试验1＞

可以在低温环境下，对具有规定膜面积的规定过滤器加压，使调整了乳糖酶含量从而达到一定的乳糖酶活性的被检体透过，通过测定其速度来评价过滤器透过性。具体而言，例如，可以如下实施。

(过滤器透过性测定步骤)

在低温～室温(例如1～30℃、优选为4～15℃、更优选为8～12℃)环境下实施以下的操作。

1.测定装置等的温度

将测定装置、乳糖酶溶液样品及离子交换水冷却到低温～室温(例如1～30℃、优选为4～15℃、更优选为8～12℃)。

2.乳糖酶液的制备

将乳糖酶溶液样品用离子交换水稀释或进行超滤浓缩，从而将乳糖酶活性调整到一定值，充分混合。需要说明的是，乳糖酶活性可以根据乳糖酶溶液的粘度调整到10～2,000NLU/g或10～4,000ALU/g左右中的任意活性。

3.试验装置的构成

可以将可进行加压的带槽的过滤器架作为测定样品导入部并进一步与另一过滤器架连接，从而作为试验装置来使用。带槽的过滤器架虽然也可以单独使用，但为了得到堵塞过滤器的条件，前者是适宜的，就其直径而言，优选该大于所连接的过滤器架的直径。

通常，过滤器架内的样品透过部分为如下构成：从测定样品的入口侧起，具备O型环、滤膜、支承网，但并非仅限于此。对滤膜没有特别限定，其孔径优选为0.05～0.50μm，进一步优选为0.1～0.45μm。另外，可以为亲水性滤膜，也可以为疏水性滤膜。更优选亲水性滤膜。只要为能够调整有效膜面积的大小即可，没有特别限定。有效膜面积可以通过液体非透过性的标签密封件(ラベルシール)等来调节，为例如0.5～1.8cm²，优选1.0～1.5cm²。

将4.2.中稀释后的乳糖酶溶液样品(以后简记为样品)加入测定样品导入部。

5.使用氮气(也可以用空气、氧气、氩气等)对带槽过滤器架施加0.1～1MPa、优选为0.2MPa的压力，记载每次透过规定量(例如10～30g)、优选为20g的样品的经过时间。

(堵塞抑制效果的判定)

按照上述过滤器透过性测定步骤且使用现有的乳糖酶溶液(不含凝聚抑制剂)作为乳糖酶溶液时，透过试验结束时，透过速度大幅下降。在透过速度比该现有的乳糖酶溶液大时，可以判断出作为凝聚抑制剂而添加的物质具有堵塞抑制效果。

《乳糖酶溶液的制造方法》

本发明的乳糖酶的具体制造方法的细节如上所述，这里省略记载，例如含有：(1)进行酵母的培养后的、与细胞壁的破坏相伴随的乳糖酶提取工序，和(2)用于从该提取的乳糖酶中除去来自培养物的杂质等的纯化工序。本发明的乳糖酶溶液的制造方法含有：(3)在上述乳糖酶(既可以是新鲜制备的，也可以是市售品)中添加凝聚抑制剂(+根据需要的其它添加剂)的工序，和(4)为了灭菌而进行过滤的工序。

《乳糖酶溶液的使用方法·用途》

(乳糖酶溶液的使用方法)

作为乳糖酶溶液的具体利用方式，可以列举例如在发酵乳的制造中使用。进行了乳糖分解的发酵乳的制造方法包括：1.在杀菌前的乳中添加乳糖酶而进行乳糖的分解后，在对乳进行加热杀菌的同时使乳糖酶失活，然后将乳发酵的方法(日本特开平5－501197号公报)，2.在杀菌乳中添加乳糖酶而进行乳糖的分解后，通过加热处理使乳糖酶失活，然后将乳发酵的方法，3.通过经固定化的乳糖酶将乳中的乳糖分解，然后将乳发酵的方法(日本特开昭46－105593号公报、日本特开昭59－162833号公报)，4.将预先进行了乳糖分解或乳糖除去的原材料用为杀菌乳并将其发酵的方法等。

进而，作为本发明的乳糖酶溶液的具体利用方式，可在长储存期牛奶的制造中使用。长储存期牛奶是保质期长的牛奶，制造工序包括灭菌工序和连续式无菌包装工序，通常通过135～150℃下数秒的超高温短时间灭菌法来处理，并通过能够进行无菌包装的工序灌装到预先进行了过氧化氢灭菌的纸容器中。

添加到长储存期牛奶中的乳糖酶溶液，通常在过滤灭菌后在对超高温短时间灭菌后的牛乳进行灌装时添加。

(乳糖酶溶液的用途)

本发明的乳糖酶溶液特别适合于乳制品制造用途。这里，乳制品是指冰激凌、长储存期牛奶等牛奶类、酸奶、奶油、酸奶油、乳酪等。本发明的乳糖酶溶液特别适合于长储存期牛奶的制造用途。

(乳糖酶的用途和其pH曲线)

另外，在考虑乳糖酶的用途的情况下，根据是中性乳糖酶还是酸性乳糖酶可以大致分为2类。这取决于用途中的pH曲线。可以说中性pH的用途中通常优选中性乳糖酶，酸性乳糖酶更适合于酸性范围的用途。

这里，上述的过滤器透过性试验1不仅可以应用于乳糖酶溶液，而且还可以应用于蛋白质、肽。如后所述，其原因在于，可认为通过分子中的疏水性部分彼此接触、附着而形成凝聚物。

以下，对这种过滤器透过性的试验进行详细说明。

本试验方法为一种对堵塞进行评价的试验方法，其特征在于，使用具有：

具有第一直径的第一圆筒状流路、

具有小于上述第一直径的第二直径、并且按照能够与上述第一圆筒状流路导通流体的方式连接且配置在上述第一圆筒状流路的下游的第二圆筒状流路、和

配置在上述第二圆筒状流路的、与上述第一圆筒状流路相反侧的开口部的膜过滤器的单元，

测定液体的每单位面积的透过量(permeate(kg/m²))和/或透过速度(flux(kg/min×m²))的变化，从而对堵塞进行评价，

上述测定方法具有：对测定对象的液体进行加压，使该液体介由上述第一圆筒状流路及上述第二圆筒状流路从上述膜过滤器排出到该单元外部的工序，并且，

上述单元具有：

设置在上述膜过滤器的下游侧且靠近上述膜过滤器的位置的支承网、和

一个或多个液体非透过性密封件，其贴合在上述支承网上的、上述膜过滤器侧，且上述一或多个密封件的总面积小于上述膜过滤器的面积，

上述膜过滤器和上述液体非透过性密封件处于接触状态。

根据本试验方法，可以再现膜过滤器的堵塞现象，可以简单地实施堵塞现象的对策等的检验试验。

实施例

1.堵塞现象的再现条件的研究

使用YNL(合同酒精株式会社制，商品名：GODO－YNL)作为乳糖酶溶液，调查产生堵塞的条件。需要说明的是，使用的GODO－YNL是来自克鲁维酵母属的中性乳糖酶，活性为5,000NLU/g。

(往复振荡处理)

将200g的YNL加入到500ml PP制塑料瓶(アイボーイ)(广口(AS ONE Corporation制、型号7－2102－03))中，在10、20或30℃下用振荡装置(大洋科学工业株式会社制、制品名TAIYO INCUBATOR PERSONAL、振幅3cm)往复振荡(100spm(往复/分钟)))或静置0、2、4或7天。分别量取各YNL 40g，用离子交换水稀释5倍而将活性调整为1,000NLU/g，将其作为样品来测定过滤器透过性。

(过滤器透过性试验)

以下详细记载本实施例中的上述过滤器透过性试验1的详细条件。

(过滤器透过性测定步骤)

在10℃的环境下实施以下操作。

1.将测定装置、乳糖酶溶液样品及离子交换水冷却到10℃。

2.将乳糖酶溶液样品用离子交换水稀释或进行超滤浓缩而将乳糖酶活性调整为1,000NLU/g，充分混合。

3.试验中，在47mm带槽不锈钢支架(ADVANTEC东洋公司制、制品名“KST－47”)上连接25mm不锈钢制过滤器架(PALL公司制、制品型号1209(有效膜面积3.7cm²))，将其作为装置来使用。上述过滤器架内的样品透过部分为从测定样品的入口侧起具备O型环、滤膜、支承网的构成(本发明的试验中，带槽不锈钢支架的过滤器及过滤器保持部分的组件(支承网和其支承体)未进行安装)。使用Merck Millipore公司制、制品名DURAPORE(孔径0.22mm,亲水性PVDF制)作为滤膜，使用上述过滤器架附带的Type 316不锈钢作为支承网。另外，为了调节透过速度，在支承网的上部(测定样品的入口侧)左右对称地贴上4片直径0.9cm的圆形的标签密封件(AONE株式会社制、制品名A－one彩色标签07010)(有效膜面积1.26cm²)，设置膜过滤器(孔径0.22μm)。滤膜在用50％甘油水溶液淋洗后安装到不锈钢制过滤器架上。

将4.2.中稀释后的乳糖酶溶液样品(样品)加入带槽不锈钢支架。

5.使用氮气对带槽不锈钢支架施加0.2MPa的压力，记录每次透过20g的经过时间。由其结果通过以下方法求出以1m²膜换算的透过量(permeate(kg/m²))和透过速度(flux(kg/min×m²))。

计算式(概念式)

Permeate(kg/m²)＝n点的透过量(g)/(膜半径(mm)×膜半径(mm)×圆周率)(m²)×1000

Flux(kg/min×m²)＝(n点的permeate－(n－1)点的permeate)/(n点的透过时间(min)－(n－1)点的透过时间(min))

※n表示测定点。由于记录每次透过20g的经过时间，因此，例如，n点为透过20g时的透过量或permeate时，(n－1)点为透过0g时的透过量或permeate。

将结果示于图1。框图A示出10℃时、框图B示出20℃时、框图C示出30℃时分别静置或往复振荡的结果。各温度下，静置的样品不论静置天数如何，透过速度的降低都小，与此相对地，往复振荡的样品的透过量在振荡天数越多时透过速度越急剧降低，在20℃或30℃振荡7天的样品由于堵塞而无法测定。因此，可认为，主要是由于往复振荡处理而形成凝聚物而引起堵塞的。另一方面，20℃往复振荡样品、30℃往复振荡样品中，在第2天以后可见有些浑浊，而静置样品则未见浑浊。但是，往复振荡样品及静置样品这两者都可见温度越高则透过量越降低的倾向。发现了：温度上升使振荡所引起的凝聚物的形成加速。

如框图D所示，各温度下振荡或静置时，乳糖酶活性都几乎没有变化。因此可知，引起堵塞的凝聚物的形成对乳糖酶活性几乎没有影响。

进而，调查了搅拌而非往复振荡下是否会观察到同样的现象。将50g的YNL加入到100ml烧杯中，在10℃下用搅拌装置(AS ONE Corporation制、商品名HS－400)以各速度(搅拌速度最小：100rpm、速度2：170rpm、速度3：240rpm、速度4：310rpm)搅拌16小时。然后，与上述相同地制备样品，与上述过滤器透过性试验同样地测定过滤器透过性。

将结果示于图2。可以确认出，与不进行处理的情况相比，搅拌操作导致透过性显著恶化。

由以上结果可明确：振荡或搅拌之类的物理刺激是会引发堵塞的凝聚物形成的主要原因。因此可认为，通过乳糖酶溶液制造后的运输中产生的振动等，也会形成凝聚物。

需要说明的是，虽然图中未示出，但已经确认：使用乳糖酶溶液中所含的多糖类及寡糖类的含量低于10g/kg的样品、及超过10g/kg的样品进行上述搅拌处理，其结果，任一乳糖酶溶液中均以同等程度地形成凝聚物。这表明：凝聚物的产生几乎不受乳糖酶溶液中所含的多糖类及寡糖类的影响。

以下的研究中，将会产生堵塞现象的凝聚物形成的再现条件设为100rpm、10℃、16小时的搅拌条件，在该条件下进行实验。

2.抑制凝聚物的形成的物质的探索

由于振荡、温度而产生堵塞物质(凝聚物)的机制尚不明确，暂且可认为机制如下。由于振荡等物理刺激，蛋白质分子和蛋白质分子发生碰撞。此时，分子中的疏水性部分彼此接触、附着，从而形成凝聚物。因此，本发明人等认为，通过添加可以降低疏水性相互作用的成分，有可能可以防止会产生堵塞的凝聚物的形成，并且，对各种成分的添加效果进行了调查。

2－1.表面活性剂

将作为表面活性剂的吐温80(HLB15.0)、TritonX－100(Tx100、HLB13.5)及RYOTO聚甘油酯(HLB12.0)作为添加剂，分别以0.1质量％的浓度添加到YNL(100ml烧杯中，50g)中，通过搅拌处理使其形成会产生堵塞现象的凝聚物。然后，与上述同样地制备样品，通过上述过滤器透过性试验测定过滤器透过性。将不添加添加剂而进行了搅拌处理的情况作为对照，同样测定过滤器透过性。将结果示于图3。所添加的物质中，TritonX－100及吐温80作为凝聚抑制剂特别有效。

这里，就具体的堵塞的判定而言，由试验刚开始后(透过20g时)的Flux算出试验结束时(透过180g时)降低了百分之几(透过180g时的相对透过速度(％))来进行判断。在判定添加剂的堵塞抑制效果时，上述计算结果大于对照(5.8％)时，可以说有效果。不进行搅拌的样品的计算值为约75％，因此将该数值设为最大值，将35％以上者评价为◎、将10～35＜者评价为○、0～10＜者评价为×、将不能透过200g者评价为××。将结果示于表1。

[表1]

【表1】

2－2.聚亚烷基二醇

将作为聚亚烷基二醇的聚乙二醇(PEG200(和光纯药工业株式会社制)、PEG400(关东化学株式会社制)、PEG4000(关东化学株式会社制)、PEG6000(关东化学株式会社制)、PEG200000(和光纯药工业株式会社制))作为添加剂，添加0.5质量％，除此以外，与表面活性剂时同样地测定了过滤器透过性。将结果示于图4及表2。

[表2]

【表2】

2－3.金属离子或其盐

将作为金属离子或其盐的MgSO₄作为金属成分，按照规定浓度进行添加，除此以外，与表面活性剂时同样地测定过滤器透过性。将结果和后述添加浓度的研究一起示于图7及表6。

3‐1.添加浓度的研究(表面活性剂)

对于上述实验中特别有效的TritonX－100及吐温80，改变添加浓度，进行与上述相同的实验，来研究有效添加浓度。将结果示于图5及表3。

[表3]

【表3】

该实验条件下，TritonX－100(框图A)在0.01～0.5％的范围可确认到效果，吐温80(框图B)在0.05～0.5％的范围可确认到效果。

3－2.添加浓度的研究(聚亚烷基二醇)

使用作为聚亚烷基二醇的各种聚乙二醇，改变添加浓度而进行与表面活性剂同样的实验，研究有效添加浓度。将结果示于图6及表4～表5。

[表4]

【表4】

[表5]

【表5】

3－3.添加浓度的研究(金属盐)

使用作为金属盐的MgSO₄，改变添加浓度(0.5mM、1mM、5mM)，进行与表面活性剂同样的实验，研究有效添加浓度。将结果示于图7及表6。

[表6]

【表6】

需要说明的是，虽然图中未示出，但在乳糖酶溶液中所含的多糖类及寡糖类的含量小于10g/kg的样品、及超过10g/kg的样品中分别含有TritionX－1000.01％、0.05％及0.5％及吐温800.05％、0.1％及0.5％的情况下，对其进行上述搅拌处理，其结果，显示出与表1及表2所示倾向同样的倾向。并且，在加入各种聚乙二醇、Mg盐时，在过滤器透过性的提高方面也显示出同样的倾向。即表明，乳糖酶溶液中所含的多糖类及寡糖类对Flux及相对透过速度几乎没有影响。