一株通过敲除CAR1过表达DUR1，2低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与流程

技术特征：

1.一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酵母出发菌株中敲除一个拷贝的精氨酸酶基因CAR1，同时过表达脲基酰胺酶基因DUR1，2获得。

2.如权利要求1所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3373。

3.如权利要求1所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述CAR1基因其Gene ID为：855993，核苷酸序列如表中SEQ NO：1所示；所述DUR1，2基因其Gene ID为：852507，核苷酸序列如表中SEQ NO：2所示；所述启动子PGK1其Gene ID为：850370，核苷酸序列如表中SEQ ID NO：3所示。

4.一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组质粒Yep-APD_1，2KB的构建

①以质粒pPGK1为模板，PCR扩增强启动子PGK1基因，用限制性内切酶BamHI和SalI对载体质粒YEP352和PGK1基因片段进行酶切，再用Solution I连接酶将两者连接构建质粒Yep-P；

②以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增DUR1，2基因，用限制性内切酶XhoI对质粒Yep-P进行酶切，再用Infusion连接酶将DUR1，2基因片段和酶切后的质粒Yep-P连接构建质粒Yep-PD_1，2；

①以质粒pUG6为模板，PCR扩增KanMX基因，用限制性内切酶BamHI对质粒Yep-PD_1，2进行酶切，再用Infusion连接酶将KanMX基因片段和酶切后的质粒Yep-PD_1，2连接构建质粒Yep-PD_1，2K；

④以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增DUR1，2基因的上游同源臂CUA，用限制性内切酶SmaI对质粒Yep-PD_1，2K进行酶切，再用Infusion连接酶将DUR1，2基因的上游同源臂CUA基因片段和酶切后的质粒Yep-PD_1，2K连接构建质粒Yep-APD_1，2K；

⑤以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增DUR1，2基因的下游同源臂CUB，用限制性内切酶SphI对质粒Yep-APD_1，2K进行酶切，再用Infusion连接酶将DUR1，2基因的下游同源臂CUB基因片段和酶切后的质粒Yep-APD_1，2K连接构建质粒Yep-APD_1，2KB。

(2)CAR1基因的敲除同时DUR1，2基因的过表达

①以质粒Yep-APD_1，2KB为模板，PCR扩增“CUA-KanMX-PGK1_p-DUR1，2-PGK1_t-CUB”重组片段；

②用醋酸锂转化法将步骤(2)-①得到的PCR重组片段导入出发酵母菌株中，获得敲除一个拷贝的CAR1基因，同时过表达DUR1，2基因的重组菌株1；

③用pGAP质粒去除步骤(2)-②获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，敲除一个拷贝的CAR1基因，同时过表达DUR1，2基因的重组菌株2，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株2。

5.如权利要求4所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3373。

6.如权利要求4所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述含有PGK1强启动子的质粒为Yep352质粒。

7.如权利要求4所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述带有KanMX抗性的载体为Yep352载体。

8.如权利要求4所述的一株低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述基因片段导入酵母菌株的方法为醋酸锂转化法。

9.如权利要求1所述的低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌在葡萄酒生产中的应用。