本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的融合蛋白、含该融合蛋白的纳米颗粒、含该纳米颗粒的疫苗组合物及其制备与应用。
背景技术：
猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhoea,ped）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,pedv）引起猪腹泻的一种重要急性、接触性、病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，特别地，7日龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率高达50%，最高的死亡率达100%。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到pedv。pedv可在猪群中持续存在，各种年龄段的猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物可抵抗pedv，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。
中国于1980年首次分离到pedv，以后许多地区相继报道有本病发生，并主要在冬春季节散发，造成的危害巨大。自2010年至今，在我国华南、华北部分省份暴发了严重的传染性腹泻疾病，已超过100万只的猪死亡（sunrq,cairj,chenyq,etal.outbreakofporcineepidemicdiarrheainsucklingpiglets,china.emerginginfectiousdiseases,2012,18(1):161-162）。该疾病发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治均无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失，经研究表明：该疾病的罪魁祸首便是猪流行性腹泻病毒变异株（chenjf,liuxz,shid,etal.completegenomesequenceofaporcineepidemicdiarrheavirusvariant.journalofvirology,2012,86:3408）。
目前，对于该疾病的防控主要采取传统工艺以制备灭活疫苗免疫接种，但pedv全病毒难以分离、培养。因此，如何解决防控pedv变异株所带来的疾病的问题是猪流行性腹泻这一领域亟需解决的技术问题。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明人经过反复试验，制备了一种融合蛋白，含该融合蛋白的纳米颗粒，以及含该纳米颗粒的疫苗组合物与应用。该疫苗组合物可有效预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所导致的疾病。
本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包括与猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白；其中，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白包括猪流行性腹泻病毒s蛋白和/或其片段，还可进一步包括s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白为幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白为优化的幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述优化的幽门螺杆菌铁蛋白核苷酸序列编码seqidno.2氨基酸序列。
本发明还涉及一种包含所述融合蛋白的纳米颗粒，其中，所述融合蛋白包含与所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白，使得所述纳米颗粒在其表面上包含24个猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白单体。
本发明还涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述纳米颗粒和/或兽医学上可接受的载体；其中，所述疫苗组合物种所述纳米颗粒的含量为0.5-200µg/ml，优选为5-100µg/ml。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤（1）克隆表达所述融合蛋白，融合蛋白自身装配成纳米颗粒，以及步骤（2）按比例混合所述纳米颗粒和载体；其中，所述制备方法中的所述步骤（1）中克隆表达所述融合蛋白为分别克隆所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、所述单体铁蛋白亚基蛋白，再用基因工程手段将两种蛋白进行融合表达。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
本发明还涉及优化的幽门螺杆菌铁蛋白，其中，所述优化的幽门螺杆菌铁蛋白核苷酸序列编码seqidno.2氨基酸序列。
本发明具有以下突出的优点：
（1）所述纳米颗粒制备的疫苗组合物，避免了用猪流行性腹泻病毒普通株和变异株全病毒制备传统灭活疫苗过程中全病毒难以分离、培养的技术难题，并且优于现有亚单位疫苗的免疫效果。
（2）所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分即所述融合蛋白进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产。
具体实施方式
术语“猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白”是指将具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒蛋白或其片段，包括但不限于猪流行性腹泻病毒s蛋白、s1蛋白、m蛋白、n蛋白，和/或其片段，优选为s蛋白和/或其片段。其中s蛋白是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为纤突蛋白（spike蛋白），位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用，被划分为2个功能区即s1和s2；s1蛋白为猪流行性腹泻病毒s蛋白的功能区之一，一般由789个氨基酸组成；m蛋白为膜蛋白（membrane蛋白），是pedv中含量最多的包膜蛋白，由226个氨基酸编码而成，有三方面的生物学作用：参与病毒粒子的组装和出芽、刺激机体产生α-干扰素、其产生的抗体在不提存在时具有中和病毒的能力；n蛋白为核衣壳蛋白（nucleocapsid蛋白），是pedv在感染细胞中产生最多的病毒蛋白，结构十分保守。优选地，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒变异株。
术语“猪流行性腹泻病毒变异株”又称高致病性猪流行性腹泻病毒，包括但不限于其s蛋白具有与seqidno.3基本相同的核苷酸序列的pedv；优选地，猪流行性腹泻病毒变异株其s蛋白具有与seqidno.3基本相同的核苷酸序列的pedv。与seqidno.3基本相同是指pedv的核苷酸序列优选包含与seqidno.3有85%-100%相同的序列，优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述pedv的条件下，例如与作为参考病毒分离物的ch/ynkm/2012相比，其s蛋白的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。猪流行性腹泻病毒变异株核苷酸序列优选有超过80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，与seqidno.3相同，同样优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述pedv的条件下，例如与作为参考病毒分离物的ch/ynkm/2012相比，其s蛋白的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
术语“同源性”是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸（或核苷酸）序列与参比氨基酸（或核苷酸）序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核苷酸）数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核苷酸）序列之间相同氨基酸（或核苷酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，blast软件（在美国国立生物技术信息中心ncbi的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，或者见，例如，altschuls.f.etal，j.mol.biol.，215：403-410(1990)；stephenf.etal，nucleicacidsres.，25：3389-3402(1997)），clustalw2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/toolsa/clustalw2/，另见，例如，higginsd.g.etal,methodsinenzymology,266:383-402(1996);larkinm.a.etal,bioinformatics(oxford，england),23(21):2947-8(2007)）；和tcoffee软件等（在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，poiroto.etal，nucleicacidsres.,31(13):3503-6(2003)；notredamec.etal,j.mol.boil.,302(1):205-17(2000)）。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
术语“纳米颗粒”可以形成八面体，所述八面体可以由24个具有432对称的单体铁蛋白亚基蛋白组成。
术语“单体铁蛋白亚基蛋白”为ferritin蛋白（简称ferri蛋白），是铁蛋白蛋白质的全长、单一多肽，或者能够指导单体铁蛋白亚基自身装配成蛋白质的球状形式的其任何部分，来自任何已知铁蛋白蛋白质的单体铁蛋白亚基蛋白的氨基酸序列可以用于生成本发明的融合蛋白，只要单体铁蛋白亚基蛋白能够自身装配成在其表面上展示猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白的纳米颗粒，或单体铁蛋白亚基蛋白可以包含容许融合蛋白自身装配成纳米颗粒的域。本发明中的融合蛋白不需要包含单体铁蛋白亚基蛋白多肽的全长序列，可以利用单体铁蛋白亚基蛋白的部分或区域，只要该部分包含指导单体铁蛋白亚基蛋白自身装配成蛋白质球状形式（如所述八面体）的氨基酸序列。此类区域的一个例子位于幽门螺杆菌铁蛋白第5-167位氨基酸之间，另一个例子记载于zhangy.self-assemblyintheferritinnano-cageproteinsuperfamily.int.j.mol.sci.,2011(12):5406-5421。在一个实施方案中，单体铁蛋白亚基蛋白可选自细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白。在一个实施方案中，单体铁蛋白亚基蛋白来自幽门螺杆菌（helicobacterpylori）铁蛋白。
术语“融合蛋白(fusionprotein)”有两种不同的含义，一种是通过dna重组技术得到的两个基因重组后的表达产物，将两个不同的蛋白质连成一个大分子；另一种可以通过化学方法连接，也可通过基因的融合来实现。并且，融合蛋白能够自身装配成纳米颗粒。
本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包括与猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白包括猪流行性腹泻病毒s蛋白和/或其片段。
作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白还可进一步包括猪流行性腹泻病毒s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段。
作为本发明的一种实施方式，所述单体铁蛋白亚基蛋白包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述单体铁蛋白亚基蛋白为幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白为优化的幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述优化的幽门螺杆菌铁蛋白核苷酸序列编码seqidno.2氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方式，所述单体铁蛋白亚基蛋白包含容许所述融合蛋白自身装配成纳米颗粒的域。
作为本发明的一种实施方式，所述融合蛋白能够自身装配成纳米颗粒。
作为本发明的一种实施方式，所述融合蛋白中所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白与所述单体铁蛋白亚基蛋白中间连接有柔性蛋白；其中，所述柔性蛋白为氨基酸序列ggsgg、ggsggggsgg、ggsggggsggggsgg、ggsg、ggsgggsg、ggsgggsgggsg、sgg、gsg、gg或ngtggsg编码的蛋白。
本发明还涉及一种包含所述融合蛋白的纳米颗粒，其中，所述融合蛋白包含与所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白连接的至少25个来自单体铁蛋白亚基蛋白的连续氨基酸，使得所述纳米颗粒在其表面上包含24个猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白单体。
术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷（saponin），如quila、qs-21（cambridgebiotechincorporation,cambridgema）、gpi-0100（galenicapharmaceuticalsincorporation，birminghamal）；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl）衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油（europeanpharmacopea类型）；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油（isoprenoidoil），如角鲨烷（squalane）或角鲨烯油（squaleneoil），尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-（辛酸酯/葵酸酯）、甘油三-（辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇（mannide）的酯（如无水甘露醇油酸酯）、脂肪族二元醇（glycol）的酯、聚甘油（polyglycerol）的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic产品，特别是l121。参见hunter等编写的《thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》（ed.bydesstewart-tull,johnwileyandsons,newyork,1995:51-94）和todd等编写的《vaccine》（1997,15:564-570）。例如，可使用powellm和newmanm编写的《vaccinedesign,thesubunitandadiuvantapproach》（plenumpress,1995）第147页描述的spt乳剂及第183页描述的mf59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖（sugar）的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆（carbomer，商品名carbopol）（phameuropa,1996,8(2)）。本领域技术人员还可参见美国专利us2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基（aliphaticradical）取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团（ethylenicallyunsaturatedgroup）。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，（bfgoodrich,ohio,usa）特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇（allylpentaerythritol）交联。这其中可提及卡波普974p、934p和971p，最优选使用卡波普971p。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物ema（monsanto），这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理ph，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，ribi佐剂系统（ribiincorporation）、blockco-polymer（cytrx,atlantaga）、saf-m（chiron,emeryvilleca）、单磷酰脂质a（monophosphoryllipida）、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素（重组或其它）、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、gel佐剂等。
本发明还涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述纳米颗粒和/或兽医学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，其中，所述疫苗组合物种所述纳米颗粒的含量为0.5-200µg/ml，优选为5-100µg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述载体包括佐剂；其中，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl）衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐剂中的一种或几种；其中，所述佐剂为铝胶佐剂。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物中所述佐剂的体积比为5%-30%，优选为20%。
作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤（1）克隆表达所述融合蛋白，融合蛋白自身装配成纳米颗粒，以及步骤（2）按比例混合所述纳米颗粒和载体。
作为本发明的一种实施方式，所述制备方法中的所述步骤（1）中克隆表达所述融合蛋白为分别克隆所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、所述单体铁蛋白亚基蛋白，再用基因工程手段将两种蛋白进行融合表达。
作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白是猪流行性腹泻病毒s蛋白和/或其片段，还可进一步包括s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段；其中，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白包括猪流行性腹泻病毒s蛋白和/或其片段。
作为本发明的一种实施方式，所述单体铁蛋白亚基蛋白包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白和哺乳动物铁蛋白；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白为幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述单体铁蛋白亚基蛋白为优化的幽门螺杆菌铁蛋白；其中，所述优化的幽门螺杆菌铁蛋白核苷酸序列编码seqidno.2氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方式，所述融合蛋白中所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白与所述单体铁蛋白亚基蛋白中间连接有柔性蛋白；其中，所述柔性蛋白为氨基酸序列ggsgg、ggsggggsgg、ggsggggsggggsgg、ggsg、ggsgggsg、ggsgggsgggsg、sgg、gsg、gg或ngtggsg编码的蛋白。
术语“预防和/或治疗”在涉及猪流行性腹泻病毒变异株感染时是指抑制猪流行性腹泻病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒普通株和变异株在其宿主体内定居，以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科（suidae）成员的动物，如猪。
本发明还涉及优化的幽门螺杆菌铁蛋白，其中，所述优化的幽门螺杆菌铁蛋白核苷酸序列编码seqidno.2氨基酸序列。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所采用猪流行性腹泻攻毒毒株为沪毒株或hn1301株（porcineepidemicdiarrheavirus,strainhn1301），其中，沪毒株已在中国专利cn101117627a中公开，农业部公告270号文件中将该毒株作为猪流行性腹泻普通株cv777株的效检用强毒株；hn1301株的保藏号为cctccno.v201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日，参见中国专利cn104513827a，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为ph7.4pbs溶液，其配方为：1000ml蒸馏水中加入nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例以体积比为20%的铝胶佐剂制备猪流行性腹泻疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本实施例中猪流行性腹泻发病的判定标准为：厌食、通常黄色或浅黄色水样腹泻，部分仔猪伴有呕吐、寒颤、脱水等症状，在临床观察的5-6日之内可能有部分仔猪脱水后死亡。发病程度可能轻重不同，但判定发病最基本的、也是不可少的条件是腹泻。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1融合蛋白及含融合蛋白的纳米颗粒的制备
1.1ferritin蛋白的制备
由苏州金唯智生物科技有限公司直接按照seqidno.1直接合成ferritin蛋白。
1.2pcdna-ferri质粒的构建
合成ferritin蛋白的上游引物ferrifp：5'acgaattcggtggttc
tggtggtgagtctcaggtc3'、下游引物ferrirp：5'gctctagat
cagctcttcctgctcttggc3'。
用合成ferritin蛋白的上、下游引物将实施例1.1制备的ferritin蛋白做为模板进行pcr扩增。pcr反应条件为预变性94℃2min-（变性94℃30s-退火56℃30s-延伸72℃1min）30个循环--延伸72℃7min。获得的pcr产物包含了ferritin蛋白基因并融合了一段ggsgg（基因序列为ggtggttctggtggt）柔性蛋白linker。
与pcdna4.0质粒（购自invitrogen公司）通过柔性蛋白ggsgg构建成pcdna-ferri质粒。将含有柔性蛋白linker的pcr产物与pcdna4.0质粒连接，具体步骤如下：用dna胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）将pcr产物回收，使用ecori和xbali酶切；pcdna4.0同时使用ecori和xbali酶切；用dna胶回收试剂盒回收酶切后片段；在10μl连接体系中加入载体2μl、pcr回收片段7μl和t4连接酶（thermo）1μl和t410×buffer1μl，室温连接30min；将连接产物加入到1支dh5α感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热激90s，然后冰上孵育5min，加入500μl的lb培养基37℃200rpm1h，离心去掉300μl培养基，剩余的涂lb平板；培养过夜挑取菌落于氨苄抗性lb培养。用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取质粒，即可获得pcdna-ferri质粒。
提取出的质粒使用ecori和xbali酶切，酶切产物做琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果：显示为两条条带，被酶切下的目的dna片段条带大小约为2500bp，与预期理论值相符，表明pcdna-ferri质粒构建正确。
1.3pedvs-ferri融合蛋白及含融合蛋白纳米颗粒的制备及鉴定
表1pedv融合蛋白及对应纳米颗粒所用pedvs蛋白序列及引物序列
1.3.1融合蛋白sa-ferri及对应纳米颗粒的制备及鉴定
（1）融合蛋白sa-ferri表达质粒的构建
按照表1设计的上游引物saf、下游引物sar，以及猪流行性腹泻病毒s蛋白基因序列（详情seqidno.3）第1-1914位基因序列用pcr方法扩增s蛋白片段（命名为sa蛋白）。其中，pcr的反应条件为预变性94℃2min-（变性94℃30s-退火56℃30s-延伸72℃1min）30个循环-延伸72℃7min。
将pcr产物回收，使用kpni与ecori酶切。同时用kpni与ecori酶切实施例1.2制备的质粒pcdna-ferri，之后回收线性化载体。在10μl连接体系中加入线性化载体2μl、pcr回收片段7μl和t4连接酶（thermo）1μl和10×buffer1μl，室温连接30min。按照实施例1.2中的方法进行质粒转化dh5α感受态细胞，并提取质粒pcdna-sa-ferri。
使用kpni与ecori酶切鉴定，显示为两条条带，被酶切下的目的dna片段条带大小约为2500bp，与预期理论值相符，表明质粒已正确插入片段。
按照实施例1.2的方法将质粒pcdna-sa-ferri转化dh5α感受态细胞。过夜长出菌落后，挑取单个菌落，接种至200mllb培养。使用大提质粒试剂盒（天根生化科技有限公司）提取，获得质粒pcdna-sa-ferri。
（2）重组纳米颗粒sa-nano的制备
用含10%v/v胎牛血清的dmem培养基将293t细胞以8×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60mm组织培养皿上，在5%co2的37℃温箱中孵育24小时,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入预热的无血清培养基。
转染质粒与融合蛋白自组装：准备两支1.5ml离心管，一管加入240μlhbs溶液（将8.76gnacl溶解于900ml超纯水，加入20ml1m的hepes，调ph值到7.4，定容至1l，用0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用）和6μgpcdna-sa-ferri混匀；另一管中则将18μl100μm的pei加入162μl的hbs溶液中，终浓度10μm。将两管1.5ml离心管内液体混合，室温孵育20min形成转染复合物。之后将转染复合物加入到细胞培养基中，在5%co2的37℃培养箱培养72小时，融合蛋白在表达的过程中自身组装成为重组纳米颗粒sa-nano。
（3）纳米颗粒sa-nano的纯化与鉴定
收集293t细胞培养基上清，8000×g离心1小时后用0.45μm孔径滤膜过滤。上清用超滤浓缩换液，换成凝集素层析的buffera。用cona凝集素亲和层析柱（ge）纯化293t细胞培养上清，然后使用阴离子交换层析进行纯化（ge），并继续使用分子筛hiloadsuperdex20016/600gl纯化，获得纯度>80%的纳米颗粒sa-nano。
纳米颗粒sa-nano用碳酸盐缓冲液稀释后终浓度1µg/ml，在elisa板每孔加入100μl，4℃包被过夜后弃掉包被液，用pbst洗3次；接着按100μl/孔加入含10%m/v脱脂奶的pbst溶液进行封闭，37℃封闭1小时；封闭后用pbst洗3次，3min/次；按100μl/孔加入用pbs稀释并使其终浓度含1:5000v/v的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体8a3a10（参见中国专利cn104694480a），室温孵育1小时。pbst洗3次以去非特异结合，3min/次；用羊抗鼠二抗体积比1:5000稀释，每孔加入100μl，室温孵育40min；pbst洗5次以去非特异结合，3min/次；用elisa显色液显色；加入50μl的2mh2so4以终止反应。用酶标仪测定elisa鉴定的结果，详情见表2。结果：包被的纳米颗粒能够与特异性单克隆抗体反应，表明纯化获得的重组纳米颗粒sa-nano含有pedv抗原成分。
表2不同纳米颗粒包被后的elisa检测结果
透射电镜负染对0.01mg纳米颗粒sa-nano，将纳米颗粒sa-nano样品在铜网孵育1min，用1%醋酸铀染色45s，用透射电子显微镜进行样品观测。结果显示：电镜观察到为大量的直径45nm左右的颗粒，表明融合蛋白sa-ferri自组装成纳米颗粒sa-nano。
（4）纳米颗粒sa-nano含量的测定
用bca蛋白定量试剂盒（购自pierce公司）按照说明书对纯化浓缩后纳米颗粒sa-nano进行定量分析，测定结果表明：纳米颗粒sa-ferri的含量为2.3mg/ml。
1.4融合蛋白sb-ferri及对应纳米颗粒的制备及鉴定
按照表1所示的上游引物sbf、下游引物sbr及猪流行性腹泻病毒s蛋白基因序列（详情seqidno.3）第1-2370位基因序列，以及实施例1.3所示的方法制备融合蛋白sb-ferri，以及含融合蛋白sb-ferri的纳米颗粒sb-nano，并对其进行鉴定，结果与预期相符；然后对其进行纯化，并对纯化后的纳米颗粒sb-nano进行elisa鉴定，鉴定结果表明：纯化获得的重组纳米颗粒sb-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量试剂盒（购自pierce公司）按照说明书对纯化后纳米颗粒sb-nano进行定量分析，测定结果表明：纳米颗粒sb-nano的含量为3.1mg/ml。
1.5融合蛋白sc-ferri及对应纳米颗粒的制备及鉴定
先使用用实施例1.2所构建的质粒pcdna-ferri，进行改造构建质粒pcdna-sp-ferri。构建带有pedv信号肽的融合蛋白ferri表达质粒。合成一段带有kpni与bamhi酶切位点的pedv信号肽序列：5'aaggtaccatgaagtctttaacctacttctggttgttcttaccagtactttcaacacttagcctaccacaagatgtcaccaggggatccaa3'。用kpni与bamhi进行酶切，并用dna胶回收试剂盒回收酶切后的信号肽片段。同时酶切实施例1.2所构建的质粒pcdna-ferri，然后用dna胶回收试剂盒回收线性化载体。按照实施例1.3所述的方法进行连接、转化和提取质粒。并使用kpni与bamh酶切鉴定。
按照表1所示的上游引物scf、下游引物scr及猪流行性腹泻病毒s蛋白基因序列（详情seqidno.3）第1381-1914位基因序列，以及实施例1.3所示的方法（所用的质粒为pcdna-sp-ferri）制备融合蛋白sc-ferri，以及含融合蛋白sc-ferri的纳米颗粒sc-nano，并对其进行鉴定，结果与预期相符；然后对其进行纯化，并对纯化后的纳米颗粒sc-nano进行elisa鉴定，鉴定结果（见表2）表明：纯化获得的重组纳米颗粒sc-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量试剂盒（购自pierce公司）按照说明书对纯化后纳米颗粒sc-nano进行定量分析，测定结果表明：纳米颗粒sc-nano的含量为2.5mg/ml。
1.6融合蛋白sd-ferri及对应纳米颗粒的制备及鉴定
按照表1所示的上游引物scf、下游引物scr及猪流行性腹泻病毒s蛋白基因序列（详情seqidno.3）第1381-2370位基因序列，以及实施例1.5所示的方法（所用的质粒为pcdna-sp-ferri）制备融合蛋白sd-ferri，以及含融合蛋白sd-ferri的纳米颗粒sd-nano，并对其进行鉴定，结果与预期相符；然后对其进行纯化，并对纯化后的纳米颗粒sc-nano进行elisa鉴定，鉴定结果（见表2）表明：纯化获得的重组纳米颗粒sc-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量试剂盒（购自pierce公司）按照说明书对纯化后纳米颗粒sd-nano进行定量分析，测定结果表明：纳米颗粒sd-nano的含量为3.3mg/ml。
1.7融合蛋白se-ferri及对应纳米颗粒的制备及鉴定
按照表1所示的上游引物sef、下游引物ser及猪流行性腹泻病毒s蛋白基因序列（详情seqidno.3）第1-3978位基因序列，以及实施例1.3所示的方法制备融合蛋白se-ferri以及含融合蛋白se-ferri的纳米颗粒se-nano，并对其进行鉴定。结果显示，未纯化出蛋白，表明蛋白未成功表达。
实施例2疫苗组合物的制备
使用ph7.4pbs将实施例1制备的纳米颗粒sa-nano、sb-nano、sc-nano、sd-nano分别进行稀释，并加入铝胶佐剂充分混匀，使疫苗组合物中所含纳米颗粒的含量如表3所示，同时保证铝胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4℃保存备用。
表3猪流行性腹泻疫苗组合物所含组分
实施例3猪流行性腹泻疫苗组合物免疫效力评价
3.1主动免疫试验
选取3日龄pedv抗体、抗原阴性仔猪88头，随机分成11组（详情见表2），8头/组。第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g组分别按表2肌肉注射实施例2所制备的疫苗1-6，2ml/头；第1h、1i组均为按照中国专利cn103301476a方法制备的现有疫苗对照组，免疫2ml/头；第1j、1k组均为空白对照组免疫注射相同剂量的ph7.4的pbs溶液。免疫后14日，采集免疫组和对照组猪血清，分别检测各组血清中和抗体效价。使用spss15.0软件对各仔猪平均抗体效价进行统计分析。同时，免疫组除第1g、1h组和空白对照组第1j组猪每头口服1ml沪毒株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）进行攻毒外，其余免疫组第1a、1b、1c、1d、1f、1i组和空白对照组第1k组猪每头口服1mlhn1301株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）进行攻毒。攻毒后观察7天，统计各组发病情况，并根据发病判断标准进行评判。
主动免疫效力试验结果见表4。
表4主动免疫效力试验结果
由表4可知：
（1）仔猪主动免疫后测定的中和抗体效价，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物（第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g组）仔猪的几何平均抗体效价分别为1:60、1:62.5、1:63、1:65、1:58、1:75、1:67，发现抗原含量相同时抗体效价相当，随抗原含量的升高而抗体效价略有升高，并且显著高于现有疫苗免疫组（第2h、2i组）的（p<0.05），显著高于空白对照组的（p<0.05）。
（2）攻毒后，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物（第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g组）的仔猪，除免疫当日食欲有所下降外，在观察期未见腹泻，精神、饮食均正常，保护率均为100%；而现有技术对照组（第1h、1i组）分别有3、2头仔猪出现腹泻等症状，精神、食欲均下降，保护率仅为62.5%、75%；空白对照组（第1j、1k组）仔猪分别先后于攻毒后第2、3天发病，至观察期结束，发病率为100%，其中3头仔猪因腹泻脱水而死亡。
3.2被动免疫试验
选取22头外观正常、同期配种，pedv、tgev等抗原、抗体检测均呈阴性的妊娠后期母猪，随机分为11组（详情见表3），2头/组。第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g组母猪分别在分娩前5-7周按表3肌肉注射免疫实施例3制备的疫苗1-6，2ml/头，3周后，以同样免疫方式及剂量进行二免。
免疫母猪分娩后，同时采集母猪血液，分别处理后，测定中和抗体效价。结果见表3，表明：免疫疫苗1-6的试验组第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g组母猪血清几何平均抗体效价分别为1:46、1:50、1:52、1:56、1:48、1:64、1:54，发现抗原含量相同时抗体效价相当，随抗原含量的升高而抗体效价略有升高，并且显著高于现有疫苗免疫组（第2h、2i组）的（p<0.05），显著高于空白对照组的（p<0.05）。
从各免疫组及对照母猪所产仔猪，随机挑选8头3日龄仔猪，其中免疫组除第2g、2h组和空白对照组第2j组每头猪口服1ml沪毒株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）进行攻毒外，其余免疫组第2a、2b、2c、2d、2e、2f组和空白对照组第2k组每头猪口服1mlhn1301株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）进行攻毒。攻毒后，观察7天，统计各组发病情况，并根据发病判断标准进行评判。
被动免疫效力试验结果见表5。
表5被动免疫效力试验结果
由表5可知：
使用分离的猪流行性腹泻病毒沪毒株或hn1301株攻毒后，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物的免疫组（第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g组）母猪所产仔猪，均未出现腹泻等典型症状，精神、食欲正常，保护率均为100%；而现有免疫对照组（第2h、2i组）分别有4、3头仔猪出现腹泻等症状，精神、食欲均下降，保护率仅为50%、62.5%；空白对照组（第2j、2k组）未免疫的母猪所产仔猪攻毒后，均于第3天出现腹泻等临床症状，至第7天观察期结束，全部仔猪出现腹泻等临床症状，其中4头仔猪因脱水发生死亡。
综上所述，不论是主动免疫还是被动免疫，所用纳米颗粒制备的猪流行性腹泻疫苗组合物免疫后均能获得较好的免疫效果，能获得完全保护。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>普莱柯生物工程股份有限公司
<120>一种融合蛋白及其应用
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