本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的分离鉴定。
背景技术：
草铵膦(glufosinate)是一种广泛使用的有机磷类除草剂，其有效成分是phosphinothricin(简称ppt)，l-ppt具有植物毒性，化学名称为(rs)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵，是外消旋体混合物，属灭生性仿生茎叶处理剂。草铵膦的研制与开发是与双丙氨膦密切相关。双丙氨膦是从链霉菌(streptomyceshygroscopicus)发酵液中分离提纯的一种三肽天然产物，双丙氨膦本身无除草活性，在植物体内降解成具有除草活性的草铵膦。据此，德国艾格福公司直接合成草铵膦(glufosinate)，成功开发出一个新除草剂品种。草铵膦制剂已被广泛使用在非耕地防除多种一年生和多年生禾本科草和阔叶草(ahrenwhetal1994)。
由于草铵膦杀草谱广，在环境中迅速生物降解及对非靶生物低毒，因此如何将其作为作物田苗后选择性除草剂使用是十分必要的，而生物工程技术为此提供了可能。至今为止，在转基因抗除草剂作物研究与推广中，抗草铵膦作物仅次于抗草甘膦作物而居第2位，随着抗草铵膦作物种植面积的继续扩大，对抗草铵膦基因资源的需求也日益增大。然而如今对抗草铵膦作物的研究主要集中于发掘新的bar或pat抗除草剂基因，对草铵膦的靶标酶谷氨酰胺合成酶鲜有研究。
谷氨酰胺合成酶(gs，glutaminesynthetase；ec6.3.1.2)是生物体中最古老也是最广泛存在的酶(kumadayetal1993),它参与许多生物体中的氮和碳代谢。且是生物体氮代谢的关键酶之一，而生物体维持生命必须要有氮代谢作用，因此该酶对生物体是至关重要的。gs基因在细菌、真菌、植物体中均被广泛研究(streichersletal1980,sampiomjetal1979,staceygetal1979)。
对植物而言，谷氨酰胺合成酶是一个重要的解毒酶，可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。在正常情况下，gs可以由atp及glutamate形成λ-glutamylphosphate。但在ppt处理后，ppt先与atp结合，磷酸化的ppt占据gs分子的8个反应中心，使gs的空间构型发生变化，从而gs的活性受到抑制。ppt能抑制gs所有已知的形式， 抑制的结果导致细胞内氨积累、氨基酸合成及光合作用受抑制、叶绿素破坏；但主要是通过对rubp羧化酶/光呼吸作用迅速抑制造成引起植物死亡。除此之外，谷氨酰胺合成酶在植物体内具有多功能效应，向植物体内转入有效的外源gs基因或是超量表达gs酶，可以提高目标植物对草铵膦的抗性,同时也能增强植物抗土壤氮素贫瘠中、抗旱耐盐、抗强光照等特性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有对高草铵膦耐受能力的谷氨酰胺合成酶及其编码基因，为进一步通过基因工程的方法，构建具有草铵膦抗性的转基因植物提供基因资源。
本发明的申请人从华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的海洋菌中筛到一株高谷氨酰胺合成酶活性菌株n10-1，经16s鉴定该菌株为exiguobacteriumsp，申请人将该菌株命名为微小杆菌n10-1，exiguobacteriumsp.n10-1，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2016163。通过设计引物从该菌株的基因组中直接扩增得到exigs基因，该基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，序列全长为1341bp，编码446个氨基酸。该基因编码的蛋白质序列如seqidno：2所示。
将该基因连接到pgex-6p-1表达载体(购自美国gehealthcare公司)上，转化大肠杆菌escherichiacolibl21(购自invitrogen公司)，转化后的重组菌能在含有400mm/l的草铵膦的培养基中生长，而空白对照则不能生长。申请人将这个基因命名为exigs基因，功能验证表明exigs基因对草铵膦具有很高的耐受性。除此之外，该基因所编码的谷氨酰胺合成酶(简称为exigs)能在低温下保持较高的活性，而且具有很好地热稳定性。exigs最适ph为7.0，最适温度为35℃，在15℃保有50％左右的活性，在5℃时仍有20％左右的活性。经60℃处理一小时，相对活性仍剩余为50％左右。经测定发现该酶对草铵膦的ki为2.43±0.14mm,ki/km为0.20±0.01,说明该基因对草铵膦确实具有很高的耐受性，在转基因植物中具有巨大的潜在应用价值。
附图说明
序列表seqidno:1是本发明分离的exigs基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列(序列全长1341bp)。编码446个氨基酸。
序列表seqidno:2是本发明分离的exigs基因编码的蛋白质序列。编码446个蛋白质。
序列表seqidno:3是鉴定微小杆菌n10-1的16srdna序列。
图1：本发明涉及的起始质粒pgex-6p-1的图谱。
图2：是本发明制备的重组质粒pgex-6p-1-exigs的图谱。
图3：纯化后的重组谷氨酰氨合成酶exigs的sds-page分析。附图标记说明：泳道1：标准蛋白分子量；泳道2.含有pgex-6p-1-exigs重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)的破细胞上清3.纯化的谷氨酰氨合成酶exigs。
图4：本发明的生物材料对草铵膦耐受性的试验结果。附图标记说明：图4中的a图是含有起始质粒pgex-6p-1的大肠杆菌对草铵膦耐受性结果；图4中的b图是含有重组质粒pgex-6p-1-exigs的大肠杆菌对草铵膦耐受性结果。
图5：谷氨酰氨合成酶的最适反应温度的测试结果。
图6：谷氨酰氨合成酶的热稳定性的测试结果。
图7：是谷氨酰氨合成酶的最适ph的测试结果。
图8:是谷氨酰氨合成酶的ph稳定性的测试结果。
具体实施方式
实施例1：产谷氨酰胺合成酶的天然菌株的筛选
(1)产谷氨酰胺合成酶的天然菌株的筛选：
申请人实验室从山东青岛附近海水中分离得到近200株海洋菌，将申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的海洋菌株在高盐lb(1％的蛋白胨，0.5％酵母培养物和2％nacl，ph7.0)平板上活化后，挑出单菌落在液体高盐lb培养基中培养，于28℃培养36小时后，用超声波(30hz，400w)破碎细胞，分别对发酵后上清和细胞破碎后上清测定谷氨酰胺合成酶酶活(酶活测定方法如下所示)。经实验，筛选到一株编号为n10-1的高谷氨酰胺合成酶活性菌株，经16s鉴定该菌株为微小杆菌属(exiguobacteriumsp.)菌株高度同源，申请人将该菌株命名为微小杆菌n10-1，exiguobacteriumsp.n10-1，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2016163。
(2)谷氨酰胺合成酶活性测定方法：
谷氨酰胺合成酶活性测定混合物：18mm盐酸羟胺，0.36mmadp，25mm磷酸二氢钠，135mmph7.0的咪唑-hcl缓冲液，0.27mmmncl2，利用1m的盐酸或是2m的naoh调节至所需ph。
酶活力测定终止混合物：3.3％fecl3，2ml三氯醋酸，2.5ml浓盐酸。
酶活测定：取80μl不加入酶液的混合物加入10μl200mm的l-谷氨酰胺于恒温水浴锅中保温5min，再加入10μl酶液(需适当稀释以使反应产生的谷氨酰羟肟酸(0.3-0.4mm左右)，继续保温30min，立即加入100μl反应终止液终止反应，摇匀离心后用多功能酶标仪测定od540吸光值，以蒸馏水作对照。1u酶活力单位定义为在上述标准条件下，每分钟催化形成1.0μmol-谷氨酰羟肟酸所需的酶量。
(3)16s鉴定步骤及引物
16s鉴定所用引物为通用引物27f，1492r。引物序列如下：
27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'
1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'
pcr体系如下：
pcr条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒；60℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。
(4)谷氨酰胺合成酶活性菌株n10-1的菌学特征：
谷氨酰胺合成酶活性菌株n10-1细胞呈短杆状，属于革兰氏阳性菌，菌落酪黄色，光滑，边缘规整，凸起。经16srdna鉴定后属于微小杆菌属(exiguobacteriumsp.)本实施例以此菌为目的菌进行后续试验。
本实施例扩增得到的16srdna序列，其核苷酸序列如seqidno：3所示。
实施例2：exigs基因在大肠杆菌中克隆、表达和纯化
具体方法和步骤如下所述：
1、提取(exiguobacteriumsp)染色体dna：
(1)将分离的exiguobacteriumsp.菌株在高盐【氯化钠含量为100μl5mol/l，见步骤(4)】lb液体培养基于28℃下培养24小时后，取1.5ml菌液于一灭菌ep管中，在12000转/分钟离心1分钟，弃上清，收集菌体。
(2)用tebuffer缓冲液(50mmol/ltris-hclph8.0，10mmol/ledtaph8.0)洗菌体2次，之后加入50μl100μg/ml溶菌酶(购于sigma公司)悬浮菌体，于37℃水浴一小时。
(3)加入520μltebuffer，30μl10％sds和3μl20mg/ml的蛋白酶k(购于sigma公司)混匀后，于37℃水浴一小时。
(4)加入100μl5mol/l的氯化钠溶液充分混匀，再加ctab/nacl(10％ctab，0.7mnacl)溶液80μl混匀，于70℃水浴10分钟。
(5)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温下放置5-10分钟。12000rpm离心10分钟，抽提两次。
(6)取上清加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，在12000转/分钟下离心10分钟
(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μlte溶液中，置-20℃保存备用。
2、表达载体pgex-6p-1质粒的提取：
将含有质粒pgex-6p-1(质粒见图1)的大肠杆菌dh5α菌株接种到含100μg/ml氨苄青霉素lb液体培养基中37℃培养过夜，取1.5ml菌液于一灭菌ep管中，12000分钟/转离心1分钟,弃上清液，收集菌体。加入100μl溶液ⅰ(50mmtris-hcl，ph7.5，10mmedta，rnasea100μg/ml)充分混匀，然后加入溶液ⅱ(0.2mnaoh，1％sds)轻轻混匀，室温下静置3-5分钟，最后加入溶液ⅲ快速混匀，在12000转/分钟离心5分钟，收集上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温下放置5-10分钟，在12000转/分钟离心5分钟；再次收集上清，加2/3倍体积的异丙醇混匀后在12000转/分钟离心5分钟沉淀dna；弃上清，沉淀用70％乙醇洗1次；置于室温干燥后，溶于50μlte溶液中，置-20℃保存备用
3、构建重组表达载体pgex-6p-exigs：
(1)根据genebank报道的exiguobacteriumsp.的基因组扩增exigs基因，引物序列如下：正向引物(f)：5'-(bamhi)-cgcggatccatggccagaaaaacgttcacaaaagaag-3'反向引物(r)：5'-(sali)-acgcgtcgacttagtagagcgtcatgtactgatcgcgt-3'(下划线为酶切位点)；。以exiguobacteriumsp.基因组为模板，pcr扩增exigs基因。
(2)pcr体系如下：
(3)pcr条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒；60℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。
酶解pcr产物和质粒载体pgex-6p-1：
pcr产物用限制性内切酶bamhi/salii(购宝生物工程大连有限公司)酶解，酶解反应(100μl)含有:10μl10x酶解缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司),70μlpcr产物，3μl限制性内切酶bamhi/salii,加水至终体积为100μl，在37℃下保温3-5小时。质粒载体pgex-6p-1酶解条件和体系同上一致。
(4)纯化酶解产物：
按qiagen公司pcr纯化试剂盒(qiaquickpcrpurificationkit)及操作程序进行。具体过程:取400μlpb缓冲液(购自qiagen公司)，与100μlpcr产物充分混匀后,上纯化柱(购自qiagen公司)，以12000转/分钟离心1分钟,弃去流出液,再加750μlpe缓冲液(购自qiagen公司)，用12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后,加50μl无离子水，用12000转/分钟离心1分钟,离心收集纯化酶解dna。
纯化质粒pgex-6p-1酶解产物的方法参照实施例2中“纯化酶解产物”的方法。
(5)连接：
20μl连接体系含有:
(6)转化：
将连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞dh5α混合,冰浴放置30分钟,42℃处理90秒,加800μllb培养基(1％胰蛋白胨,1％nacl,0.5％酵母粉，ph7.0)，37℃保温1小时，铺含100μg/ml氨苄青霉素固体lb平皿，37℃保温14小时，挑取转化子，抽提质粒。
质粒制备方法同实施例2中“表达载体pgex-6p-1质粒的提取”
(7)序列测定:
以pgex-6p-exigs重组质粒为模板，以pgex-6p-1的通用引物为测序引物，交由武汉擎科创新生物技术有限公司测序。
(8)序列分析：
测序结果通过blast比对发现，扩增得到的exigs基因全长1341bp(序列见seqidno：1)，该基因编码446个氨基酸，其完整的氨基酸序列与genebank上各种已报道的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列同源性比较，最高的为75.11％，属于gsi-α类的谷氨酰胺合成酶(结果如图6和图7)。
实施例3：谷氨酰胺合成酶的表达与纯化：
1、重组谷氨酰胺合成酶在大肠杆菌中的诱导表达：
将重组质粒pgex-6p-exigs转化致大肠杆菌bl21(de3)中表达纯化谷氨酰胺合成酶。将质粒pgex-6p-exigs与100μl大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)混合，冰浴放置30分钟,， 42℃处理90秒，加800μllb培养基(1％胰蛋白胨，1％nacl，0.5％酵母粉，ph7.0),，37℃保温1小时，铺含100μg/ml氨苄青霉素固体lb平皿，37℃保温14小时，挑取转化子诱导表达谷氨酰胺合成酶。
将过夜活化的转化子以1％的接种量转接至1l含100μg/ml氨苄青霉素lb液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使od600达到0.6-0.7，加入iptg至终浓度为0.2mm，18℃200转/分钟培养10小时。离心收集菌体，然后用pbs缓冲液(ph7.4,，140.0mmnacl,，2.7mmkcl,，10.0mmna2hpo4,，1.8mmkh2po4)洗涤一次，再用50mlpbs悬浮，然后用高压破碎仪(thermofrenchcellpress)破细胞，收集细胞破碎液。4℃、12000转/分钟离心30分钟，收集上清。对上清进行初步活性试验和sds-page检测上清是否有目的蛋白表达。
2、利用亲和层析方法纯化谷氨酰胺合成酶：
采用gst融合蛋白纯化试剂盒(购自pharmacia公司)操作(按试剂盒的说明书操作)。具体方法为：
(1)装柱：取lml柱材料gshsepharose4b至层析柱中，用50mlpbs(ph7.4，140.0mmnacl,，2.7mmkcl,，10.0mmna2hpo4，1.8mmkh2po4)缓冲液过柱，平衡柱材料。
(2)上样：将细胞破碎液的上清以0.5ml/min的流速过柱。
(3)洗脱：再用200mlpbs缓冲液过柱，洗脱没有结合的蛋白。
(4)酶解：取10μl浓度为10u/μl的3c蛋白酶(购自pharmacia公司)与1ml的pbs缓冲液混匀，加入层析柱酶切，在4℃酶解16小时。
(5)收集蛋白：收集上次添加的pbs缓冲液，然后再加1mlpbs缓冲液第二次洗脱收集。pbs缓冲液中即溶有目的蛋白exigs；
(6)利用sds-page方法检测重组谷氨酰胺合成酶纯度。
浓缩胶浓度为5％，配制方法如下：
分离胶浓度为12％，配制方法如下：
取10μl纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2×)，沸水浴5-10min，然后上样10μl电泳检测。sds-page电泳检测结果(图3)表明，纯化的蛋白为单一条带，大小约为50.1kda。
(7)测定谷氨酰胺合成酶蛋白浓度：
采用bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生物工程技术服务有限公司)，按说明书测定谷氨酰胺合成酶蛋白浓度。
1)取4μl蛋白标准品(购自上海生物工程技术服务有限公司)加pbs稀释至100μl，使终浓度为200μg/ml；
2)取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15μl的梯度浓度分别加到96孔板中，每孔加pbs补足至20μl，每孔蛋白含量分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3μg，每个浓度梯度处理重复3次；
3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加pbs至20μl，重复3次；
4)各孔加入200μlbradfordreagent，混匀，室温放置5min；
5)用预热的酶标仪(购自thermoscientific公司)测定od595读数；
6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度；
7)计算获得谷氨酰胺合成酶浓度为0.13mg/ml。
实施例4：草铵膦耐受性实验：
为了验证含有exigs基因的大肠杆菌对草铵膦的耐受，将含有重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)接种到添加有不同浓度的草铵膦的lb培养基中，含有原始空载质粒的大肠杆菌作为对照。图4结果表明，草铵膦对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用，转exigs基因的大肠杆菌能在最高含有400mm的草铵膦的培养基中较好地生长。
实施例5：谷氨酰胺合成酶酶学性质的测定
谷氨酰胺合成酶酶活测定方法如实施例1。
(1)谷氨酰胺合成酶最适温度与热稳定性的测定：
谷氨酰胺合成酶最适温度的测定是在ph7.0的反应液中在不同温度下测定酶活。热稳定性的测定是谷氨酰胺合成酶在50℃、60℃和70℃处理不同时间，再在最适温度下测定酶活。图5和图6结果分别表明exigs的最适温度为35℃，在50℃、60℃和70℃处理一小时后残余酶活为85％、50％和20％左右。
(2)谷氨酰胺合成酶最适ph和ph稳定性测定：
利用1m的hcl或2m的naoh将反应液调节至不同ph，在最适温度下反应。ph稳定性是将酶用不同ph的缓冲液处理不同时间，再在最适条件下测定酶活。图7和图8表明exigs的最适ph是7.0，在ph7的缓冲液中谷氨酰胺合成酶比较稳定。
(3)谷氨酰胺合成酶的km和vmax测定方法如下：
分别配制缺少l-谷氨酰胺、盐酸羟胺、adp的ph为7.0的反应液。反应时分别向体系中添加不同浓度的对应底物。在最适温度下测定酶活性，计算exigs在35℃的km和vmax。经测定，exigs在35℃的km如表1所示。
表1谷氨酰胺合成酶的动力学参数
(5)各种化学试剂对exigs酶活的影响测定如下：
向反应体系中添加不同浓度的金属离子和化学试剂，然后按常规方法测定酶活。以未额外添加任何试剂的对照酶活为100％。结果表明(表2，表3)，edta强烈抑制exigs的活性，高浓度的ni+,mg2+,co2+,cu2+,ba2+对exigs有非常明显的抑制，nh4+，li+，na+，k+对exigs没有影响。而且对sds，dtt，urea具有耐受性，加入后，仍有90％左右的酶活。
表2不同化合物对exigs酶活的影响
表3不同试剂对谷氨酰胺合成酶的影响
终上所述，本发明克隆得到的谷氨酰胺合成酶基因exigs具有高活性，耐低温和高温稳定性好等突出特点，并且能耐受较高浓度的草铵膦，本发明为抗除草剂转基因植物的应用提供了新的基因资源。
参考文献
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