家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用与流程

文档序号:11126094阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒,其特征在于:

所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA],是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因,包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR,以及两个转座臂之间的两个功能表达框。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒,其特征在于:

一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框,即A3Promoter–EGFP-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端序列的表达框,即Ser1 Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。

3.根据权利要求1或2所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒,其特征在于:

所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点,两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。

4.一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法,其特征在于该方法的步骤如下:

1)通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因-SV40]-[A3基因启动子-EGFP-SV40]的质粒piggy-14413,以质粒piggy-14413为模板,以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2为引物,获得片段长为583bp的丝胶基因启动子,其碱基序列如SEQ ID NO.4;

2)用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切质粒piggy-5257,质粒piggy-5257的碱基序列如SEQ ID NO.5,得到长度为4549bp,包含18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段;

连接步骤1)获得的丝胶蛋白1基因启动子与包含18s rRNA基因启动子- 丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段,得到包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的质粒piggy-5140;

3)用AflII和BglII、ScaI酶切步骤2)获得的piggy-5140质粒,得到长度为2493bp的包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段;

4)用AflII和BglII双酶切包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的质粒piggy-6212,质粒piggy-6212的碱基序列如SEQ ID NO.6,得到长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段;

5)连接步骤3)获得的包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段与步骤4)获得的包含A3基因启动子-EGFP-SV40的片段,得到包含A3基因启动子-EGFP-SV40-丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-8363质粒。

5.一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的应用,其特征在于:权利要求1~3所述的质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1