一种葡糖苷水解酶基因及其编码酶的应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种糖苷水解酶酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，葡糖苷水解酶和该水解酶在科学研究、环境监测以及植物遗传操作，尤其是增强植物抗病虫害方面的应用。

背景技术：

在生命科学研究领域，报告基因在基因克隆、基因表达调控、植物和动物基因工程研究中处于非常重要的地位。随着基因工程技术的发展，报告基因的作用会更加明显。目前最常用的报告基因有编码抗生素抗性蛋白、荧光素酶、荧光蛋白以及β半乳糖苷酶的基因。其中β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解，极易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。 但全长lacZ基因由大约3500个碱基组成，分子克隆相对困难；其编码糖苷酶的功能单位为4聚体，分子量大，从而大大地限制了β半乳糖苷酶的在生命科学研究中作为报告基因的应用。

重金属在水体和食品中是一类难以降解、移动性差、具有潜在危害、长期不可逆性的有毒有害危险品。在环境中存在会严重影响饮用水及农业、畜牧业产品的产量与品质，更重要的是它能通过食物链的生物放大作用进入人体，威胁人体健康。除矿山开采外，蓄电池生产、有色冶炼、催化剂、皮革、染料、农药等精细化工企业都伴有大量重金属排放。由于重金属具有毒性大、在环境中不易被代谢、易被生物富集并有生物放大效应等特点，使得水环境的重金属污染严重威胁水生生物的生存和人类健康。因此，水环境和食品中重金属含量的监测和控制已成为关系到环境保护、可持续发展和居民生活水平提高的重要问题。目前可用于重金属检测的方法很多，比如原子吸收光谱法、电感藕合等离子体法、原子荧光光谱法、溶出伏安法、生物酶抑制法等。与其他检测技术相比，生其中物酶抑制法具有方便、快速、经济等优点，更适合于重金属污染的现场检测和定量分析。生物酶抑制法是利用重金属离子与酶活性中心的特异结合来改变了酶活性中心的结构与性质，从而引起酶活力下降，使底物-酶系统中的显色剂颜色、pH、电 导率和吸光度等发生变化。通过测定这些变化进而可以确定重金属离子的含量。因此，生物酶是酶抑制法快速检测重金属技术的关键和核心，它必须有检测准确性，同时具有良好的敏感性和稳定性，能够容忍包括温度、酸碱度、氧化还原电位等左右酶促反应的重要条件。本发明所提供的糖苷水解酶酶具备以上特点，除了在生命科学研究中可用于报告基因外，在生物酶抑制法检测重金属污染方面也有巨大的应用潜力。

植物病虫害造成的损失和控制这些病害虫的花费每年高达亿万美元。这些损失包括作物产量的减少、作物质量的降低，农业成本的提高。尽管农药的大量使用提供了一些控制病害虫的有效方法；然而，这些农药残留在在食品、地下水和环境中而引发的一系列连锁性危害正日益受到公众的担心和仔细考查。全世界的管理部门都在限制和/或禁止使用许多农药，特别是那些在环境中持久而且进入生物链的合成化学试剂，包括最常用的有机氯类、有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类。对使用农药严格的新限制以及从市场上淘汰某些有效的农药都可能限制对控制代价高的害虫的经济而有效的选择。与此同时，农药的成本上升、病原微生物抗药性增以及农药对环境和人体健康的不良影响，要求现代的植物育种技术必须寻找新的方法来增强植物本身所具有的病虫害抗性，为植物提供额外的机制来保护植物免受植物害虫。目前，增强植物病虫害抗性的各种“基因工程”战略已经提出，有的显示出成功。比如通过DNA重组技术将苏云金芽孢杆菌毒素基因转入棉花中异源表达，从而使转基因植物本身产生生物杀虫剂，在无需重复使用的情况想，赋予植物以对抗或控制敏感昆虫蚕食者的能力。目前，全世界已有50多种转基因植物被批准投入商业化生产，其中最常见的是抗除草剂或者病虫害的大豆、玉米、油菜、西红柿和棉花。

糖苷酶是催化芳基/烷基 - 糖苷键和纤维二糖糖苷键和的水解酶。其中β-葡萄糖苷酶水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键, 同时释放β-D-葡萄糖和相应的配体。 在纤维素的糖化作用中, β-葡萄 糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员, 而纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低, 因此成为纤维素酶解的瓶颈。在纤维素水解时, 增加β-葡萄糖苷酶活性, 会有效提高纤维素酶解效率。目前, 国内外多家研究机构正致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究, 以期望更好改善纤维素酶的催化效率, 更加充分地利用纤维素资源。同时，糖苷酶在调控动植物物的生长发育和抗病虫害方面也起着非常重要的作用。比如玉米β-D-糖苷酶的一个生理功能是水解异羟肟酸葡糖苷，从而释放出具有生物学活性的羟肟酸。羟肟酸极不稳定，有比羟肟酸葡糖苷高出50倍的活性。当植物组织被破坏时，被β-D-糖苷酶释放出的羟肟酸便发挥其对昆虫和病原微生物的毒性，有效帮助植物防御了各种病虫害。由于植物内源的Β-D-糖苷酶通常仅存在于在植物的特定组织，浓度和酶活性也个不相同，因此不同植物和同一植物不同组织对病原体攻击的敏感也存在不同。通过转基因技术引入外源的β-D-糖苷酶来有效调节这些有生物学活性在植物体内定时定量的释放，可以有效增强植物的病虫害抗性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种糖苷水解酶及其在生命科学研究，重金属检测以及增强植物病虫害抗性方面的应用。本发明通过对微生物基因组序列进行筛选鉴定，获得了编码一种新颖糖苷水解酶基因及其蛋白质序列。所述糖苷水解酶与其他类似水解酶相比，其基因序列小，在各种实验条件下酶活性稳定，同时对微量重金属敏感，并能有效释地在植物体内把存在于糖苷里的具有生物学活性的配体释放出来，增强植物病虫害抗性。

本发明一方面提供了一种糖苷水解酶，其氨基酸序列为：

“MDDERAYPMTDHKALAARFPGDFLFGVATASFQIEGATKVDGRKPSIWDAFCNMPGHVFGRHNGDVACDHYNRWEDDLDLIKEMGVEAYRFSIAWPRIIPDGFGPINEKGLDFYDRLVDGCKARGIKTYATLYHWDLPLTLMGDGGWASRSTAHAFQRYAKTVMARLGDRLDAVATFNEPWCAVWLSHLYGIHAPGERNMEAALAAMHHINLAHGFGVEASRHVAPKVPVGLVLNAHSVIPASNSDADMKAAERAFQFHNGAFFDPVFKGEYPAEMIEALGSRMPVVEAEDLSIISQKLDWWGLNYYTPMRVADDATEGAEFPATKQAPAVSDVKTDIGWEVYAPALHSLVETLYERYELPDCYITENGACYNMGVENGEVDDQPRLDYYAEHLGIVADLVKDGYPMRGYFAWSLMDNFEWAEGYRMRFGLVHVDYETQVRTLKNSGKWYSALASGFPKGNHGVMKG”

上述糖苷水解酶其编码基因的核酸序列为：

“5’-ATGGATGACGAAAGGGCCTATCCGATGACCGATCACAAAGCGCTTGCAGCCCGT

TTCCCCGGCGATTTCCTGTTCGGCGTGGCGACCGCCTCCTTCCAGATCGAGGGTGCCACCAAGGTTGACGGCCGCAAGCCATCCATCTGGGATGCCTTCTGCAACATGCCGGGACATGTCTTCGGGCGCCACAATGGCGACGTTGCCTGCGATCACTATAATCGCTGGGAGGATGATCTCGATCTCATAAAGGAAATGGGTGTCGAGGCCTATCGTTTCTCCATTGCCTGGCCGCGCATCATTCCCGATGGATTCGGCCCGATCAACGAGAAGGGGCTGGATTTCTACGACCGCCTCGTCGATGGCTGCAAGGCGCGCGGCATCAAGACCTATGCGACGCTTTACCATTGGGACCTGCCGCTGACACTGATGGGCGACGGCGGCTGGGCCTCGCGTTCCACCGCCCATGCCTTCCAGCGTTACGCCAAGACCGTCATGGCACGGCTGGGCGACCGGCTGGATGCGGTGGCGACCTTCAATGAGCCCTGGTGTGCGGTCTGGCTCAGCCATCTCTATGGCATTCATGCGCCGGGCGAGCGCAACATGGAAGCAGCCCTTGCGGCCATGCACCACATCAACCTTGCCCATGGTTTCGGCGTCGAGGCGTCCCGCCATGTTGCGCCCAAGGTGCCGGTCGGACTGGTGCTGAACGCCCATTCCGTCATCCCGGCCTCCAATAGCGACGCCGACATGAAGGCAGCTGAACGGGCATTCCAGTTCCACAACGGCGCGTTTTTCGATCCGGTCTTCAAGGGCGAATATCCGGCCGAAATGATAGAGGCCCTGGGCAGCCGCATGCCGGTGGTGGAGGCGGAAGACCTGTCCATCATCAGCCAGAAGCTCGACTGGTGGGGTCTCAATTATTATACACCGATGCGCGTTGCCGACGACGCCACCGAAGGTGCGGAATTCCCTGCCACCAAACAAGCCCCGGCCGTCAGCGACGTCAAAACCGATATCGGCTGGGAAGTCTATGCGCCGGCGCTGCATTCCCTGGTGGAGACGCTTTACGAGCGCTACGAGCTGCCCGATTGCTACATCACCGAAAATGGCGCCTGCTACAATATGGGCGTCGAAAACGGCGAGGTGGACGATCAACCCCGTCTTGACTATTACGCCGAACATCTTGGTATCGTTGCTGATCTGGTGAAGGACGGTTACCCCATGCGGGGTTACTTCGCCTGGAGCCTGATGGACAATTTCGAATGGGCGGAAGGGTACCGCATGCGCTTTGGTCTCGTGCACGTGGATTACGAAACGCAGGTTCGTACGTTGAAGAACAGCGGCAAATGGTACAGCGCGCTGGCATCGGGTTTTCCGAAGGGGAATCACGGTGTGATGAAGGGGTGA-3’”

本发明提供了一种重组质粒，其携带有编码序列为所述水解酶的基因 （及其突变体）。

本发明提供了一种重组菌株，是通过将上述重组质粒转化入大肠杆菌(E. coli)中获得的。

本发明提供了上述糖苷水解酶（及其突变体）在生命科学研究中的应用。

本发明提供了上述糖苷水解酶（及其突变体）在检测重金属方面的应用。

本发明提供了上述糖苷水解酶（及其突变体）在增强植物抗病虫害方面的应用。

附图说明

图1 A 本发明的糖苷水解酶编码基因的PCR产物凝胶电泳图谱；

图1B本发明的糖苷水解酶编码基因的部分测序图谱；

图2A本发明的糖苷水解酶和大肠杆菌lacZ基因编码的β－半乳糖糖苷酶均能水解Xgal，释放出的产物在培养基上形成蓝色的斑点；

图2B在液体缓冲液中，本发明的糖苷水解酶和大肠杆菌lacZ基因编码的β－半乳糖水解酶也能够同时作用于ONPG为底物，产生有在波长520nm处有最大光吸收的可溶性黄色产物；

图3 本发明的糖苷水解酶以ONPG为底物按照标准的酶学研究方法进行分析的结果：

表A反映了该酶反应速度与底物浓度的关系；表B反映了该酶反应速度与pH值和温度的关系；表C反映了本发明的糖苷水解酶的热稳定性能；

图4 在20 mM的无金属离子的HEPES (pH 8)缓冲液中进行，反应温度为30 °C，反应底物为ONPG.，检测金属离子对本发明的糖苷水解酶的影响：表A显示对金属离子螯合剂和单价金属盐对本发明的糖苷水解酶活性的影响；表B显示不同的金属离子对本发明的糖苷水解酶活性的影响；表C在含有Xgal的固体培养基里面分别添加了微量的铜离子和锌离子。然后将本发明的水解酶溶液（5微升）滴在该培养基上，室温放置10分钟。结果显示不含重金属离子的空白对照组出现了一个蓝斑，而含有微量铜离子或锌离子的培养基则没有颜色；

图5A 本发明的糖苷水解酶水解水杨苷的高效液相色谱图谱；

图5B. 采用常用的根癌农杆菌介导的方法将本发明的糖苷水解酶基因转入拟南芥进行过量表达，然后用根癌农杆菌进行人工感染，4周以后的效果。红色圆圈表示细菌侵染的位置，其中实验组1和3为空白对照组，实验组2和4为本发明的糖苷水解酶的拟南芥过量表达组。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook, 2001)和Current Protocols In Molecular Biology (Ausubel, 2003) 中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合具体的实施方式对本发明进行描述。

实施例1：糖苷水解酶基因的克隆及蛋白表达

通过大量的生物信息学分析对比根癌农杆菌的基因组序列，设计、合成两条PCR引物，引物序列分别如下，F1：5-CCGCTCGAGATGGATGACGAAAGGGC-3; R1：5-CCGCTCGAGAAAGC CTCACCCCT TC-3。以根癌农杆菌的总ＤＮＡ为模板进行，利用上述ＰＣＲ引物Ｆ１和Ｒ１进行ＰＣＲ扩增，获得本发明所述的基因片段。图1A是这个产物的电泳图谱。 将上述ＰＣＲ产物割胶回收，ＸｈｏＩ进行酶切处理后与经同样酶切后的pET１４ｂ载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑单克隆进行ＰＣＲ筛选和ＤＮＡ测序鉴定。然后选一阳性克隆接种到含有0.1mM IPTG的LB+Amp液体培养基中37 ℃培养， 220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有糖苷水解酶基因的大肠杆菌细胞裂解液。此裂解液经Ni-NTA 树脂纯化，获得本发明的糖苷水解酶。对所得到的糖苷水解酶进行编码基因的测序，结果如图1B) 所示。

实施例2：本发明的糖苷水解酶在生命科学研究中作为报告基因的应用

考虑到大肠杆菌中lacZ基因编码的β－半乳糖糖苷酶能够水解Ｘｇａｌ和ＯＮＰＧ并释放出有色物质，因而在分子克隆和检测基因表达方面被广泛使用，本实例的目的是证明本发明的糖苷水解酶也能有效地水解Xgal和ONPG底物，释放出有颜色或者有光吸收的产物，从而证明本发明水解酶在生命科学研究中作为报告基因的可行性。将上述方法纯化的糖苷水解酶和lacZ基因编码的β－半乳糖糖苷酶点到含有Xgal （25 µg/ml）的固体基本培养基上，30 ℃ 保育。15分钟后， 两种酶都能有效地将Xgal水解，释放出的产物在培养基上形成蓝色的斑点（如图2A) 。此外，在液体缓冲液中，本发明的糖苷水解酶和大肠杆菌lacZ基因编码的β－半乳糖水解酶也能够同时作用于ONPG为底物，产生有在波长520 nm处有最大光吸收的可溶性黄色产物 （如图2B)。

实施例3：本发明的糖苷水解酶的酶学性质分析

本发明的糖苷水解酶动力学分析均以ONPG为底物按照标准的酶学研究方法进行分析，结果如图3所示。其中图3中表A 反映了该酶反应速度与底物浓度的关系，由此计算出该酶对ONPG的最大反应速度为V_max=16.4 (0.1 OD₄₂₀ min^-1µg^-1) ， 与大肠杆菌lacZ基因编码的β－半乳糖水解酶的最大反应速度相当。 图3B为最适作用pH值（虚线）和最适作用温度（实线）分析。其中最适作用pH分析时，分别用pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液稀释， 在30 ℃条件下以ONPG为底物测定其水解酶酶活，以最高酶活为基准计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。对于最适作用温度的分析，则分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和pH7.0的条件下，分别测定上述水解酶酶活，以最高酶活为基准计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图3中表B所示，本发明的糖苷水解酶的最适作用pH为7.0-8.0， 最适反应温度为40℃-50℃之间，与其他糖苷水解酶相比，本发明的糖苷水解酶在耐pH和抗温特性等方面都有明显提高。此外，把上述水解酶加热到不同温度并保育1小时后再用ONPG为底物测定其酶活性。 结果表明该酶在低于40℃的条件下保育1小时，酶的活性可保持在93%以上；在50℃的条件下保持1小时，其酶活性也可保持60%左右（如图3中表C所示）。这些结果显示了本发明水解酶很好的热稳定性。

实施例4：本发明的糖苷水解酶的在检测重金属方面的应用

为了证明本发明的糖苷水解酶可用在生物酶抑制技术中来检测重金属污染，我们首先研究了金属离子螯合剂EDTA (虚线) 和 氯化钠 (实线) 对本发明的糖苷水解酶酶活性的影响. 图4中的实验是在20mM的无金属离子的HEPES (pH 8)缓冲液中进行，反应温度为30 °C，反应底物为ONPG.。表A显示该酶对金属离子螯合剂和单价金属盐均不敏感。在10 mM的EDTA条件下，该酶任可以保持90% 以上的活性； 即使在65mM的EDTA里面，该酶任然保持有60%左右的酶活性。 同样，100mM 的钠离子对该酶活性基本没有影响。即使在0.5M的氯化钠里面，该酶任然保持65%的活性。 表B的结果显示，不同的金属离子对本发明的糖苷水解酶活性影响很大。尽管钙离子、镁离子、钠离子和钾离子对该酶活性无明显影响，微量的铜离子和锌离子却能够极大地抑制该酶的活性。 为了进一步证明本发明的糖苷水解酶可重金属污染检测方面的可行性，我们在含有Xgal的固体培养基里面分别添加了微量的铜离子和锌离子。然后将上述水解酶溶液（5微升）滴在该培养基上，室温放置10分钟。结果显示不含重金属离子的空白对照组出现了一个蓝斑，而含有微量铜离子或锌离子的培养基则没有颜色（如表C所示），充分证明了本发明的糖苷水解酶在检测重金属离子方面有适用性。

实施例5：本发明的糖苷水解酶在增强植物病虫害抗性方面的应用

在鉴定上述水解酶的特性的同时，我们发现该酶可以有效水解水杨苷（Salicin），释放出水杨醇，如图5A所示，小面小图是水杨醇特定的最大光吸收波长。将同量的该水解酶热变性后，在相同是实验条件下则检测不到相应的水解产物，充分证明了该反应的特异性。 在植物体内，水杨醇会被进一步代谢成水杨酸[2]。而游离的水杨酸在增强植物免疫性提高其病虫害抗性方面起着非常重要的作用。同时考虑到水杨苷和水杨酸甙 （Salicylic acid beta-glucoside ）化学结构上只有一个H原子的差别，具有高度相似性，我们认为本发明的糖苷水解酶也能水解水杨酸甙释放出有生物活性的水杨酸，从而调节植物的病虫害抗性。为了证明一点，我们采用常用的根癌农杆菌介导的方法将本发明的糖苷水解酶基因转入拟南芥进行过量表达，然后用根癌农杆菌进行人工感染。经过4周的培养，空白对照组在感染的茎上可见明显的植物肿瘤，而过量表达本发明的糖苷水解酶的植物则没有发现相对应的肿瘤（如图5B所示）。尽管其中的分子机理目前还不十分清楚，上述结果无疑表明本发明的糖苷水解酶在增强植物病虫害抗性方面潜在的应用价值。