一种利用短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物共价修饰蛋清溶菌酶，从而扩展天然溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围，特别是在食品保鲜领域的应用。

背景技术：

溶菌酶是一种碱性酶，可以水解黏多糖。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。存在于动植物体内和人的外分泌液中，目前可以从牛、羊、马等乳汁中分离出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最丰富，约为0.3％～0.4％。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种，129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。化学性质非常稳定，对热也极为稳定。溶菌酶的最适温度为50℃，最适pH为6，溶菌酶具有热稳定性，100摄氏度保持十分钟仍具有活性。它作为一种小分子蛋白质，具有对组织无刺激无毒性等优点。在《关于批准溶菌酶等物质为食品添加剂及部分食品添加剂和营养强化剂扩大使用范围、用量的公告((2010年第23号)中》，溶菌酶已经可以在干酪和发酵酒中作为防腐剂使用。

溶菌酶的应用过程中的优点：(1)溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；(2)溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；(3)溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；(4)溶菌酶适宜pH5.3-6.4，可用于低酸性食品防腐；(5)溶菌酶生产成本较低；(6)溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。

但由于革兰氏阴性菌的细胞膜外壁存在一层脂多糖LPS，天然的溶菌酶很难溶解该膜层，所以无法有效抑制该类菌的活性，限制了溶菌酶的应用范围。目前，为了提高溶菌酶对大肠杆菌等革兰氏阴性细菌的抑菌效果，国内外已经做了一些相关研究，可以通过热处理、利用还原剂还原溶菌酶的二硫键添加其它化学物质与溶菌酶协同作用等改变酶的构象。溶菌酶的化学修饰研究主要集中在：利用化学小分子(small molecule)或多糖(polysaccharides)与溶菌酶结合(conjugation)进而修饰溶菌酶，或利用蛋白水解酶(proteolytic enzymes)修饰的溶菌酶。

此外，槐糖脂(sophorolipids)是一类无毒、可生物降解的生物表面活性剂。槐糖脂亦可用作食品乳化剂和发泡剂。近年来，研究者们还发现一些槐糖脂还表现出良好的抑菌活性，可用作多功能食品保鲜剂。我们利用羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰天然蛋清溶菌酶，改善其对革兰氏阴性菌的抑菌效果，从而扩增溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围，特别是在食品保鲜领域的应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种利用羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的天然蛋清溶菌酶及其修饰方法及其应用，改善溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌效果，从而扩展溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围。

一种利用短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶，由短脂肪链槐糖脂衍生物与天然溶菌酶通过共价结合得到，其中，所述的短脂肪链槐糖脂衍生物的羧基与天然溶菌酶的氨基酸残基形成酰胺键；

所述的短脂肪链槐糖脂衍生物为羧酸型短脂肪链槐糖脂，结构下式所示：

本发明使羧酸型短脂肪链槐糖脂与溶菌酶的氨基酸残基通过共价结合得到修饰后的溶菌酶，从而将槐糖脂结构引入到溶菌酶的表面，经过活性测试，发现其对革兰氏阴性菌具有更好的抑菌效果，同时，对其抗菌谱也有较大的扩展。

本发明还提供了一种溶菌酶的修饰方法，包括以下步骤：

(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO₃水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；

(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。

形成活性酯的目的是为了活化羧基，使得槐糖脂衍生物能够与溶菌酶的氨基成键，完成修饰过程，作为优选，所述的活性酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯。

作为优选，所述的溶菌酶为蛋清溶菌酶。采用盐提法制备的蛋清溶菌酶的成本较低。

作为优选，所述的PSL-C9的添加量为1.0-2.0g/L。所述的溶菌酶的添加量为1.5-2.0g/L。溶菌酶与PSL-C9的混合温度为30℃-35℃。

通过上述方法可以羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物的活性羰基与溶菌酶的氨基酸残基通过共价结合得到修饰后的溶菌酶，从而将槐糖脂结构引入到溶菌酶的表面。

该修饰方法的具体步骤如下:

将羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物(PSL-C9)的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在5mL DMSO形成溶液的最终浓度为0.7mM，搅拌情况下，逐滴滴加入25mL 1％NaHCO₃的蛋清溶菌酶溶液(0.2mM)，继续缓慢搅拌30℃下反应6h。反应结束后，向体系内加入25mL 100mM的甘氨酸溶液，30℃恒温10min。反应体系室温下利用去离子水透析，再利用pH 7.0，20mM磷酸盐缓冲液4℃透析1天。为了除去未反应的羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物，透析物在5℃，12000rpm离心10min，做种收集悬浮物。

本发明还提供了一种所述的羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物的制备方法，具体可以通过以下步骤得到：

(1)将购置的冻干假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214均匀分散至1mL灭菌后的YM培养基中(YM培养基组成包括，单位lL：酵母粉3.0g，麦芽粉3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，用蒸馏水定容至lL)。随后将其画线接种到YM琼脂培养基斜面上(YM琼脂培养基组成包括：酵母粉3.0g/L，麦芽粉3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂20.0g/L)，于25℃恒温2天后，挑取培养基斜面上的单菌落接种至灭菌后的液体培养基中，25℃，200rpm培养24h(液体培养基组成包括，单位lL：酵母粉3.0g，麦芽粉3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，用蒸馏水定容至lL)，并分装于甘油管中，-80℃保存备用。

(2)将上述步骤(1)菌悬液按照体积百分比5％的接种量将菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，2500-mL规格的摇瓶，装液量为500mL，摇瓶于25℃、转速为200rpm的摇床上培养24h，得到液体种子。

(3)将上述步骤(2)液体种子培养基接种至灭菌后的装配有电子数控与搅拌装置的10-L发酵罐培养基中，发酵温度25℃，转速不超过1200rpm，溶氧控制在30％，利用6M氢氧化钠溶液调控体系pH 3.5。当细胞生长进入静止期时，将葡萄糖(50％,v/v)及菜籽油以适宜的速率添加入发酵罐中，发酵过程中每隔3h监测发酵液中的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于150mM时，补加葡萄糖。

(4)发酵72h结束后，将发酵液于8000rpm下离心10min，离心后，发酵液体系呈三相，中间层主要含槐糖脂产物，利用等体积乙酸乙脂洗涤三次，合并乙酸乙酯，减压除溶剂得槐糖脂粗产品，得到产物产量为200-220g/L。

(5)向圆底烧瓶中顺序加入槐糖脂，绝干甲醇和甲醇钠，CaCl₂保护，加热回流3h，降至室温，酸调pH至中性，减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于0℃冰浴至粉末沉淀析出，过滤，水洗，减压干燥得产物。

(6)向圆底烧瓶中顺序加入步骤(5)产物，50mL绝干有机溶剂THF，乙酸酐和DMAP，室温下搅拌1h，CaCl₂保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙酯中，并利用饱和NaHCO₃溶液洗涤混合物3次，回收有机相，MgSO₄干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物。

(7)向圆底烧瓶中顺序加入，步骤(6)产物，甲醇，少量苏丹III指示剂。低温通臭氧至体系红色退去，加入NaBH(OAc)₃后升至室温继续搅拌1h，减压除溶剂，溶解于乙酸乙酯，盐水洗涤，收集有机相，干燥，减压除溶剂，色谱柱分离(石油醚/乙酸乙酯)。

作为优选，步骤(5)中所述槐糖脂与甲醇钠的添加量之摩尔比为1:015:-1:0.2。且反应回流时间控制在3-6h。所用的酸的浓度无特别严格的要求。

步骤(6)中，步骤(5)产物与乙酸酐的初始添加量摩尔比为1:6-1:10,步骤(5)产物与DMAP的初始添加量摩尔比为1:0.3-1:0.6。所述反应温度为25-30℃，反应时间为1-3h。

步骤(7)中，低温反应温度为-78℃，步骤(6)产物与NaBH(OAc)₃的摩尔比为1:1-1:1.5，反应时间为8-12h。

本发明还提供了一种所述的溶菌酶的应用，所述的溶菌酶用于制备多功能食品保鲜剂或者抑菌剂。

同现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物对天然蛋清溶菌酶实施了有效化学修饰，酶在修饰过程中的酶活损失小，调整酶活性中心的空间结构，强化了溶菌酶的抑菌效果，开发了一种新颖的溶菌酶修饰剂及修饰方法，方式简单灵活，是一种颇具实用价值的生物工程技术。

(2)本发明提供的一种扩展溶菌酶抗菌谱的方法，较之天然溶菌酶，不仅对革兰氏阳性菌具有抑菌活性，而且对革兰氏阴性菌的抑菌活性大幅提高，有效拓展了溶菌酶的抑菌谱。

附图说明

图1是羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物(PSL-C9)核磁碳谱图；

图2是天然溶菌酶与短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶的酶活力对比；

图3是槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶对常见食源性致病菌的抑菌圈直径。

具体实施方式

实施例1

羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物(PSL-C9)的制备方法：

(1)向100mL的圆底烧瓶中顺序加入29.80g(43.27mmol,1eq)槐糖脂，50mL绝干甲醇和1.62mL(6.49mmol,0.15eq)甲醇钠，CaCl₂保护，加热回流3h，降至室温，酸调pH至中性，减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于0℃冰浴至粉末沉淀析出，过滤，水洗，减压干燥，得产物22.5g(82％)。

(2)向100mL的圆底烧瓶中顺序加入21.56g(33.86mmol,1eq)步骤(1)产物，50mL绝干有机溶剂THF，25.4mL(270.84mmol,8eq)乙酸酐和1.654g(13.54mmol,0.4eq)DMAP，室温下搅拌1h，CaCl₂保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙酯，并利用饱和NaHCO₃溶液洗涤混合物3次，回收有机相，MgSO₄干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物33.8g。IR v 2936,1740,1450,1351,1165,1053,1012,813cm21；HRESIMS m/z:1028.5571[M+Na]⁺(for C₅₂H₈₄O₂₀,1028.55)。

(3)向圆底烧瓶中顺序加入，步骤(2)产物12.49g，100mL甲醇，少量苏丹III指示剂。反应体系将为至-78℃，并鼓吹臭氧至体系红色退去，室温下搅拌1h，减压除溶剂，溶解于乙酸乙酯，盐水洗涤，收集有机相，干燥，减压除溶剂，色谱柱分离得产物6.8g,65％，流动相为石油醚/乙酸乙酯(89:11to 10:90,v/v)。

IR(cm^-1)ν_max:1036(CHOCH),1064(CHOCH),1224(COAc),1367,1748(C＝O)₁H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ_H1.22(3H,d,J＝6.2Hz,CH3CH),1.28-1.45(7H,m,3xCH₂(CH₂)₂,CH_aH_bCHCH₃),1.54-1.62(1H,m,CH_aH_bCHCH₃),1.68(2H,txt,J＝7.4Hz,J＝7.3Hz,CH₂CH₂(C＝O)H),1.99(3H,s,CH₃C＝O),2.00(3H,s,CH₃C＝O),2.02(3H,s,CH₃C＝O),2.03(3H,s,CH₃C＝O),2.06(3H,s,CH₃C＝O),2.08(3H,s,CH₃C＝O),2.09(3H,s,CH₃C＝O),2.47(2H,txd,J＝7.4Hz,J＝1.8Hz),CH₂(C＝O)H),3.63-3.76(4H,m,2xCHCH₂OAc,CH₃CHO,CHOC),4.06-4.11(2H,m,2xCHCH_aH_bOAc),4.23-4.31(2H,m,2xCHCH_aCH_bOAc),4.46(1H,d,J＝7.6Hz,CH(O)₂),4.71(1H,d,J＝8.0Hz,CH(O)₂),4.90(1H,dxd,J＝9.4Hz,J＝8.1Hz,CHOC),4.93(1H,dxd,J＝9.8Hz,J＝9.8Hz,CHOC),5.05(1H,dxd,J＝9.6Hz,J＝9.6Hz,CHOC),5.13(1H,dxd,J＝9.4Hz,J＝9.4Hz,CHOC),5.17((1H,dxd,J＝9.5Hz,J＝9.5Hz,CHOC),9.78(1H,t,J＝1.8Hz,HC＝O)).

实施例2

利用羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物(PSL-C9)共价修饰天然蛋清溶菌酶：

1)将羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物(PSL-C9)的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在5mL DMSO形成溶液的最终浓度为0.7mM，搅拌情况下，逐滴滴加入25mL，0.2mM，1％NaHCO₃的蛋清溶菌酶溶液，继续缓慢搅拌30℃下反应6h。反应结束后，向体系内加入25mL 100mM的甘氨酸溶液，30℃恒温10min，室温下利用去离子水透析，再20mM磷酸盐缓冲液透析，pH 7.0，4℃维持1天左右。为了除去未反应的酸型全乙酰基槐糖脂，透析物在5℃ 12000rpm离心10min，做种收集悬浮物。

2)溶菌酶酶活测定：

将待测酶液和底物悬液分别置于25℃水浴中保温20min，吸取底物悬液2.8mL，置于1cm比色皿中比色测定450nm下的OD值，此为零时读数，然后加入酶液0.2mL，迅速摇均，从加入酶液起计时，每隔1min测定1次450nm下的OD值，共测定3次。本实验的酶活力单位定义为：每分钟OD值下降0.001为1个活力单位(25℃、pH值6.2)，即每毫克活力单位(U/mg)＝(ΔOD₄₅/min)×10³/样品的质量(mg)。槐糖脂衍生物修饰溶菌酶酶活是天然酶活95.5％。

实施例3

抑菌圈的测定：采用杯碟法。取20mL溶化的固体培养基于培养皿中，凝固后，取0.2mL浓度为10⁶-10⁷CFU/mL的各菌悬液均匀涂布于固体培养基中，10min后，将牛津杯放置于培养皿表面，加入样品液，盖好培养基，置于37℃恒温培养24h，测抑菌圈直径。每个样品液实验重复3次，取平均值。