一种细胞膜靶向的磷光铱配合物探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种含长烷基链的细胞膜靶向的磷光铱配合物探针及其制备方法和在次氯酸根检测、细胞成像和生物标记中的应用。

背景技术：

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是指分子氧在还原过程中产生的一系列中间产物，包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，包括有超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧自由基、烷氧自由基、次氯酸、过氧化氢、单线态氧、过氧化氢自由基。氧分子是生物体代谢过程中的必需物质，而生物体内的ROS主要是由这些氧分子通过一系列化学反应产生的。

分子氧是所有耗氧有机体维持其生命活动的必需组分。人体内的活性氧物种ROS主要是通过线粒体呼吸过程产生的氧气，同时，也可通过外部干扰诱导有机体内生成，例如外源性化学物质，传染剂和紫外线。ROS参与广泛的生理和病理过程，如信号转导，炎症，癌变和神经组织衰退性损伤。虽然在正常的细胞环境中产生ROS对于生命是必须的，但是当它们在外源性刺激下生成过量时，对有机体也是有危害的。过量的ROS通过生物分子的氧化引起的氧化应激，例如，脂质、蛋白质和DNA的氧化作用，并诱导细胞死亡。

ROS调节各种各样的生理过程。次氯酸(HOCl)，一个生物学意义的活性氧，是在活化白细胞内，通过髓过氧化酶催化过氧化氯离子产生的。在自然防御中，次氯酸也是一种重要的杀菌剂。然而，次氯酸水平的异常与许多炎症相关的疾病有着密切的联系，包括心血管疾病，人体红细胞的损伤，肺病，类风湿关节炎和癌症。所以，次氯酸的检测是非常重要的。目前，已经发展了许多检测次氯酸的方法，例如，电解法，电势法，分光光度法，化学发光检测等。WeiyingLin组合成了一种检测ClO^-的比率荧光探针，当作用于分析物时，荧光发射比率(I₅₀₉/I₄₃₉)的可从0.28增加到2.74，且具有较高的选择性(Chem.Eur.J.,2009,15,2305–2309)。陈忠宁组用肟化的2,2’-联吡啶选择性去检测次氯酸，相比于其他的活性氧和金属离子具有较高的灵敏性(Analyst,2011,136,2277–2282)。此探针是基于荧光信号的检测。

相比于荧光信号，磷光信号检测具有以下优势：具有大的Stokes位移、可见光激发、良好的光稳定性、长的发射寿命、高的量子效率和发射波长易调节等。其中大的斯托克斯位移可以很容易区分激发和发射，长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的信噪比和灵敏度以及可使用可见光进行激发降低光漂白。因此，开发具有选择性的、 可用于生物体检测的磷光探针具有重要意义。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在上述技术问题，本发明的目的在于提供一类细胞膜靶向的磷光铱配合物探针，给出它们的制备方法，并提出这类配合物探针在次氯酸根检测、细胞成像以及生物标记中的应用。本发明采用的技术方案如下所述：

本发明提供一种细胞膜靶向的磷光铱配合物探针，其特征在于，所述磷光铱配合物探针的N^N辅助配体上含有肟基团(-C＝N-OH)，环金属配体上含有长的烷基链，所述磷光铱配合物探针具有如下结构式通式：

其中，n为6、12或18，N^N辅助配体为选自下述结构中的一种：

上述磷光铱配合物探针可用来选择性检测次氯酸根。其环金属配体上含有长的烷基链，实现细胞膜靶向；其N^N辅助配体上含有肟基团(C＝N-OH)，当加入次氯酸钠溶液时，肟基团(C＝N-OH)被氧化为羧基(COOH)，铱配合物发光，实现了磷光探针的开启式，从而在细胞成像领域有良好的应用前景。

本发明还提供上述的细胞膜靶向磷光发射的铱配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：

(1)铱二氯桥的制备：将含有肟基(C＝N-OH)的N^N配体(所述N^N配体选自上述N^N结构中的一种)与三氯化铱在惰性气体保护下加入到乙二醇乙醚和水的混合溶液中，加热搅拌，制备得到二氯桥中间体；

(2)铱配合物中间体的制备：将得到的铱二氯桥中间体与含有长烷基链的C^N环金属配体在二氯甲烷和甲醇混合液中惰性气体保护下50℃密闭反应5h，反应结束后冷却至室温， 得到铱配合物中间体；所述C^N环金属配体的结构通式为：

(3)铱配合物探针的制备：在步骤(2)反应结束后的反应液中加入六氟磷酸钾继续反应8h后，分离提纯得到的铱配合物探针。

本发明所述制备方法的一个可行的合成路线为(仅是本发明所述制备方法中的一个实施例，不代表本发明包含的所有技术方案)：

磷光重金属铱配合物具有良好地光物理性质，例如较长的发射寿命、良好地光化学稳定性、室温下高的三线态光量子效率、易调节的发射波长、大的斯托克斯位移和可见光区激发等优点，当前，已经应用于电致发光和发光电化学池器件、生物传感等领域。相对于小分子有机荧光染料分子，磷光重金属配合物长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的灵敏度和信噪比。本发明所述的铱配合物探针具有很好的应用前景，尤其是在生物细胞检测和成像领域。

本发明所述的细胞膜靶向的磷光铱配合物探针可应用于次氯酸根检测。

将上述铱配合物探针溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中，逐次滴加到ClO^-的CH₃OH/H₂O混合溶液中，每次滴加ClO^-后均加热搅拌以使ClO^-与上述铱配合物充分反应，并测试其荧光发射光谱。通过分析荧光发射光谱可以看到，在光波波长为600nm附近，上述铱配合物溶液本身发光很弱，随着ClO^-的加入，铱配合物溶液的荧光光谱立刻发生了变化，伴随着ClO^-滴加浓度的升高，铱配合物的荧光光谱发生蓝移且荧光强度逐渐升高。当ClO^-的滴加浓度当量达到30eq.时，滴定达到终点，再继续滴加ClO^-，光谱则不再发生变化。

可见本发明所述的铱配合物探针对次氯酸根的响应性非常明显，具有很好的灵敏度和很低的检测最低限。这是因为上述铱配合物探针本身只有很低的荧光效果，但是，在次氯酸根的强氧化作用下，上述铱配合物探针上的含肟基团(-C＝N-OH)被氧化为羧基(-COOH)，生成一种新的铱配合物，该铱配合物具有很强的荧光效应。于是，即使只有很少的次氯酸根，在荧光效应的对比下，也很容易得到明显的检测结果。

在上述铱配合物探针溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液分别加入过量的NaClO₃、CuCl₂、LiClO₃、AlCl₃、MgCl₂、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaOAc、ZnCl₂、H₂O₂、NaNO₂、NaClO溶液，分别测其发射光谱。通过对比可知，其他离子均对发射光谱的强度和发射波长均无明显影响，即铱配合物探针对ClO^-有较好的选择性。

综上可知，本发明所述的细胞膜靶向的磷光铱配合物探针可应用于次氯酸根检测，这对深入研究ClO^-在生物体体内的生理和毒理作用具有重要意义。

本发明所述的细胞膜靶向的磷光铱配合物探针还可应用于细胞成像和生物标记。

培养好的两组Hela细胞，其中一组用所述铱配合物溶液孵育，并用培养液洗涤3次，作为空白对照组；另一组用铱配合物孵育，并滴加ClO^-溶液，并用培养基洗涤3次，作为实验组。使用共聚焦显微镜对两组细胞拍照，对比两组细胞的照片可见，对照组细胞膜上基本没有荧光发射，而实验组细胞胞膜内有较强的磷光发射。

另外，所述铱配合物及被次氯酸根氧化后得到的铱配合的荧光效应均可使用可见光激发，可以避免使用紫外激发光源对活体生物细胞的潜在光损伤，这样有利于探针应用于活体细胞靶向的次氯酸根的光成像测定、细胞成像和生物标记领域。

本发明具有如下有益效果：1、本发明所述铱配合物用作磷光探针，在ClO^-存在下磷光发射显著增强，检测效果显著；2、本发明所述的磷光探针材料对ClO^-具有高的选择性，并且响应快；3、本探针材料具有低生物毒性，且容易进入细胞膜中，使得这类探针可用于细胞膜靶向ClO^-检测、细胞成像和生物标记领域；4、所述铱配合物的制备方法简单、条件温和

附图说明

图1.本发明中实施例1合成的配合物Ir-1的紫外-可见吸收谱图。

图2.本发明中实施例2合成的配合物Ir-2的荧光发射滴定谱图。

图3.本发明中实施例2合成的配合物Ir-2的MALDI-TOF谱图。

图4.本发明中实施例2合成的配合物Ir-2的细胞成像图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。实施例1：配合物Ir-1的制备：

本实施例中的N^N辅助配体为C＝N-OH-bpy，C^N环金属配体为带有12个碳的长链烷基的C-12，两者的结构式分别为：

本实施例的合成反应式为：

(1)铱二氯桥的制备：称取N^N辅助配体C＝N-OH-bpy(2.2mmol)与IrCl₃·3H₂O(1mmol)混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应。

(2)铱配合物中间体的制备：再称取铱二氯桥(1mmol)、C-12(2.4mmol)加入至三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中，将温度升至50℃，搅拌回流。

(3)铱配合物探针的制备：反应5小时后，加入0.75mmol的六氟磷酸钾固体，继续搅拌反应8h。反应结束后浓缩提纯，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到固体产物即为铱配 合物Ir-1。产率:69％。¹H NMR(400MHz DMSO):δ＝7.90(d,J＝5.6Hz,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,2H),7.40(m,2H),7.28(d,t,J＝3.2Hz,7.6Hz,2H),6.33-6.28(m,2H),5.77-5.70(m,2H),4.71-4.58(m,4H),2.08-1.95(m,4H),1.82-1.65(m,4H),1.52-1.43(m,4H),1.29-1.17(m,32H),0.87(t,J＝6.8Hz,6H)；[m/e](M,MALDI-TOF)理论值:1128.56，实验值:1128.79。

实施例2：配合物Ir-2的制备：

本实施例中的N^N辅助配体为C＝N-OH-bpy，C^N环金属配体为带有18个碳的长链烷基的C-18，C-18的结构式为：

本实施例的合成反应式为：

(1)铱二氯桥的制备：称取N^N辅助配体C＝N-OH-bpy(2.2mmol)与IrCl₃·3H₂O(1mmol)混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应。

(2)铱配合物中间体的制备：再称取铱二氯桥(1mmol)、C-18(2.4mmol)加入至三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中，将温度升至50℃，搅拌回流。

(3)铱配合物探针的制备：反应5小时后，加入0.75mmol的六氟磷酸钾固体，继续搅拌反应8h。反应结束后浓缩提纯，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到固体产物即为铱配合物Ir-2。产率:75％。¹H NMR(400MHz DMSO):8.23-8.19(m,2H),7.96-7.90(m,4H),7.72-7.68(m,2H),7.41-7.39(m,1H),7.20-7.13(m,4H),6.40(d,J＝6.0Hz,2H),3.95-3.88(m,4H),1.40-1.20(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,6H)；[m/e](M,MALDI-TOF)理论值:1296.89，实验值:1296.752。

实施例3：紫外-可见吸收谱图

将铱配合物Ir-1溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中测的吸收谱图，结果如图1所示，由图1可知，它的最大吸收波长在225nm左右。

实施例4：探针Ir-2的发射光谱对ClO^-的响应性：

将铱配合物Ir-2溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中，逐次加入ClO^-的CH₃OH/H₂O混合溶液中，每次滴加ClO^-后，在37℃恒温水浴中加热搅拌5分钟，使ClO^-与铱配合物Ir-2充分反应，随后测试其荧光发射光谱，如图2所示。在601nm处，铱配合物Ir-2溶液本身发光很弱，随着ClO^-的加入，铱配合物Ir-2溶液的荧光光谱立刻发生了变化，伴随着ClO^-滴加浓度的升高，铱配合物Ir-2的荧光光谱蓝移并在595nm处的荧光强度逐渐升高。当ClO^-的滴加浓度当量达到30eq.时，滴定达到终点，再继续滴加ClO^-，光谱则不再发生变化。

实施例5：探针Ir-2在溶液中对ClO^-的选择性实验：

配制1.5μM的配合物溶液(CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)，移取2.5mL所配化合物溶液于比色皿中，加入过量的NaClO₃、CuCl₂、LiClO₃、AlCl₃、MgCl₂、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaOAc、ZnCl₂、H₂O₂、NaNO₂、NaClO溶液，分别测其发射光谱。其他离子均无明显影响。实验数据表明：材料对ClO^-有较好的选择性。

实施例6：活细胞成像实验：

Hela细胞按照American Type Tissue Culture Collection规定进行培养。Hela细胞用1.5μM铱配合物Ir-2溶液在37℃下孵育30分钟，用培养液洗涤3次，作为空白对照组的共聚焦显微镜照片结果如图4所示，细胞膜上基本没有荧光发射；实验组在Hela细胞用1.5μM铱配合物Ir-2在37℃条件下孵育30分钟后，再用1.5ClO^-溶液焦显微镜下拍照，之后用培养基洗涤3次，置于共聚焦显微镜下拍照，照片显示细胞胞膜内有较强的磷光发射，结果如图4所示。此实验结果表明，铱配合物Ir-2可用于检测活细胞内的ClO^-。