一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法与流程

文档序号:12346201阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法,其特征在于它是按照以下步骤进行的:

步骤一:菌株的初筛工作:首先选取等重量的多份肉类熟食样品,每份肉类熟食样品对应有一份生理盐水,同时将选取的每份肉类熟食样品按质量比为1:9的比例放入其对应的生理盐水中进行稀释,形成多种菌液,其次将多种菌液依次接种到含有CaCO3的MRS固体培养基中,筛选出产透明圈的多个菌株,然后对多个菌株逐一进行单菌落培养,挑取多个单菌落进行H2O2酶触实验和革兰氏染色实验,最后选取H2O2酶触阴性且革兰氏染色阳性的多个菌株,即为多个乳酸菌菌株;

步骤二:菌种的复筛工作:菌种的复筛即为对步骤一中得到的多个乳酸菌菌株以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为指示菌做抑菌试验;选取出不仅抑制革兰氏阳性菌,还能够抑制革兰氏阴性菌的多个具有双重抑制特性的菌落;

步骤三:发酵特性试验工作:将步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落分别进行产粘液、耐盐性、耐硝性、产气试验、产H2S、氨基酸脱羧酶试验、精氨酸产氨试验及其他发酵特性试验,从而判断通过发酵特性试验得到的菌株是否可以加入到发酵肉制品中,确定多个具有双重抑制特性的菌落中能够满足发酵肉制品发酵剂要求的多个具有多重特性的菌落;

步骤四:排除有机酸、H2O2和酶对抑菌作用影响的检测工作:排除有机酸、H2O2和酶使多个具有多重特性的菌落具有抑菌作用的检测工作如下:

首先排除有机酸对抑菌作用的检测工作:

将多个具有多重特性的菌落的无菌过滤液调节pH至6.5~7.0,向牛津杯中加入中和前后的粗提物无菌过滤液,35℃~37℃培养23~25h,利用抑菌圈法测抑菌圈直径,当菌圈直径小于8mm时,表明具有多重特性的菌落受有机酸影响而产生抑菌作用,除去该类菌落;当菌圈直径在8~16mm内,表明具有多重特性的菌落未受有机酸影响而产生抑菌作用,形成无菌过滤液待用;

其次排除H2O2对无菌过滤液抑菌活性影响的检测工作:

将过氧化氢酶溶解于50μmol/L的磷酸盐缓冲液中配成母液,加入到经有机酸排除的无菌过滤液中,使过氧化氢酶的终浓度达到5mg/mL,37℃水浴2h,加入到牛津杯中37℃培养24h,测抑菌活性,当抑菌为失活状态时,表明具有多重特性的菌落受H2O2影响而产生抑菌作用,除去该类菌落;当抑菌为活性状态时,表明具有多重特性的菌落未受H2O2影响而产生抑菌作用,形成发酵液;

最后排除蛋白酶对发酵液抑菌活性影响的检测工作:

把胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,分别溶解在3mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中配成母液,加入到排除有机酸和H2O2作用后的发酵液中,使酶的终浓度达到0.5mg/mL,37℃水浴2h,加入到牛津杯中,测抑菌活性,当抑菌为失活状态时,表明具有多重特性的菌落受蛋白酶影响而产生抑菌作用,除去该类菌落;当抑菌为活性状态时,表明具有多重特性的菌落未受蛋白酶影响而产生抑菌作用,形成细菌素粗提物;

步骤五:pH和温度对细菌素粗提物的影响:经过步骤四检验得到的细菌素粗提物用1mol/LHCl调节pH2~8,将细菌素粗提物分别在60℃、80℃、100℃、115℃、121℃加热20min,以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌做抑菌试验,观察细菌素粗提物的抑菌效果并记录菌圈直径的变化;

步骤六:生理生化鉴定工作以及分子鉴定工作:将步骤四检验得到的细菌素粗提物进行化学成分分析,同时将步骤四检验得到的细菌素粗提物利用PCR扩增原理进行分子鉴定工作,最终得到的菌种为清酒乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法,其特征在于步骤二中的抑菌试验的操作过程为:

在平板底部加入10mLMRS培养基,把牛津杯打入到平板中,带培养基冷却后再倒入15mL LB培养基,待LB培养基冷却后摘掉牛津杯,打入100μL液体培养基上清液,培养24h后侧抑菌圈直径。

3.根据权利要求1所述的一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法,其特征在于步骤二中的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌;革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法,其特征在于步骤三中的产粘液、耐盐性以及耐硝性的试验过程如下:

产粘液的试验过程:从步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落中直接挑取出若干个菌落直接观察各自产生粘液的情况;

耐盐性的试验过程:把步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落选取三个具有双重抑制特性的菌落直接接种于添加2%、4%和6%NaCl的MRS液体培养基中,600nm测定OD值,比较各自的生长情况,同时以未接菌的MRS培养基作空白对照;

耐硝性的试验过程:把步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落选取三个具有双重抑制特性的菌落接种于添加50、100和150mg/kg NaNO2的MRS液体培养基,600nm测定OD值,比较各自的生长情况,以未接菌的MRS培养基作空白对照。

5.根据权利要求1所述的一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法,其特征在于当步骤一中选取等重量的七份肉类熟食样品时,每份肉类熟食样品对应有一份生理盐水,同时将选取的每份肉类熟食样品按质量比为1:9的比例放入其对应的生理盐水中,各菌液分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8,从而形成七种菌液。

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