本发明具体涉及一种产清酒乳杆菌的分离筛选及鉴定方法。
背景技术：
：清酒乳杆菌是乳酸菌产生的细菌素，其具有抗菌活性的多肽蛋白质或蛋白质复合物,是一种具有潜在开发能力的天然食品防腐剂和饲料添加剂,对人类的生活有重要意义。由于其应用范围越来越广泛，使其需求量也逐日增加。如清酒乳杆菌作为一种潜在的天然的肉品保鲜剂，其不仅可以作为发酵香肠的发酵剂，能够赋予香肠良好的风味和品质，而且绝大多数的清酒乳杆菌对食源性致病菌单核增生李斯特菌具有较强的抑制作用，清酒乳杆菌种类多且性质各异，但由于其获取方式单一、产量少，同时其制备步骤繁琐且耗费高而严重影响其使用和推广。技术实现要素：本发明的目的是提供一种清酒乳杆菌的制备方法，以解决由于其获取方式单一、产量少且严重影响其使用和推广，同时其制备步骤繁琐且耗费高的问题。本发明为解决上述技术问题采取的技术方案是：步骤一：菌株的初筛工作：首先选取等重量的多份肉类熟食样品，每份肉类熟食样品对应有一份生理盐水，同时将选取的每份肉类熟食样品按质量比为1：9的比例放入其对应的生理盐水中进行稀释，形成多种菌液，其次将多种菌液依次接种到含有CaCO3的MRS固体培养基中，筛选出产透明圈的多个菌株，然后对多个菌株逐一进行单菌落培养，挑取多个单菌落进行H2O2酶触实验和革兰氏染色实验，最后选取H2O2酶触阴性且革兰氏染色阳性的多个菌株，即为多个乳酸菌菌株；步骤二：菌种的复筛工作：菌种的复筛即为对步骤一中得到的多个乳酸菌菌株以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为指示菌做抑菌试验；选取出不仅抑制革兰氏阳性菌，还能够抑制革兰氏阴性菌的多个具有双重抑制特性的菌落；步骤三：发酵特性试验工作：将步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落分别进行产粘液、耐盐性、耐硝性、产气试验、产H2S、氨基酸脱羧酶试验、精氨酸产氨试验及其他发酵特性试验，从而判断通过发酵特性试验得到的菌株是否可以加入到发酵肉制品中，确定多个具有双重抑制特性的菌落中能够满足发酵肉制品发酵剂要求的多个具有多重特性的菌落；步骤四：排除有机酸、H2O2和酶对抑菌作用影响的检测工作：排除有机酸、H2O2和酶使多个具有多重特性的菌落具有抑菌作用的检测工作如下：首先排除有机酸对抑菌作用的检测工作：将多个具有多重特性的菌落的无菌过滤液调节pH至6.5～7.0，向牛津杯中加入中和前后的粗提物无菌过滤液，35℃～37℃培养23～25h，利用抑菌圈法测抑菌圈直径，当菌圈直径小于8mm时，表明具有多重特性的菌落受有机酸影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当菌圈直径在8～16mm内，表明具有多重特性的菌落未受有机酸影响而产生抑菌作用，形成无菌过滤液待用；其次排除H2O2对无菌过滤液抑菌活性影响的检测工作：将过氧化氢酶溶解于50μmol/L的磷酸盐缓冲液中配成母液，加入到经有机酸排除的无菌过滤液中，使过氧化氢酶的终浓度达到5mg/mL，37℃水浴2h，加入到牛津杯中37℃培养24h，测抑菌活性，当抑菌为失活状态时，表明具有多重特性的菌落受H2O2影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当抑菌为活性状态时，表明具有多重特性的菌落未受H2O2影响而产生抑菌作用，形成发酵液；最后排除蛋白酶对发酵液抑菌活性影响的检测工作：把胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，分别溶解在3mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中配成母液，加入到排除有机酸和H2O2作用后的发酵液中，使酶的终浓度达到0.5mg/mL，37℃水浴2h，加入到牛津杯中，测抑菌活性，当抑菌为失活状态时，表明具有多重特性的菌落受蛋白酶影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当抑菌为活性状态时，表明具有多重特性的菌落未受蛋白酶影响而产生抑菌作用，形成细菌素粗提物；步骤五：pH和温度对细菌素粗提物的影响：经过步骤四检验得到的细菌素粗提物用1mol/LHCl调节pH2～8，将细菌素粗提物分别在60℃、80℃、100℃、115℃、121℃加热20min，以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌做抑菌试验，观察细菌素粗提物的抑菌效果并记录菌圈直径的变化；步骤六：生理生化鉴定工作以及分子鉴定工作：将步骤四检验得到的细菌素粗提物进行化学成分分析，同时将步骤四检验得到的细菌素粗提物利用PCR扩增原理进行分子鉴定工作，最终得到的菌种为清酒乳杆菌。本发明具有以下有益效果：本发明操作过程合理且简便，经过菌株初筛、菌株复筛、发酵特性试验、排除有机酸H2O2蛋白酶敏感性、抑菌物质对pH和温度的敏感性、生理生化鉴定和分子鉴定的一系列操作，能够实现从肉类熟食中提取出清酒乳杆菌的效果。本发明耗费低且易于实现，对批量化进行清酒乳杆菌的制备过程具有指导意义，同时本发明也适合推广使用。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式是按照以下步骤进行的：步骤一：菌株的初筛工作：首先选取等重量的多份肉类熟食样品，每份肉类熟食样品对应有一份生理盐水，同时将选取的每份肉类熟食样品按质量比为1：9的比例放入其对应的生理盐水中进行稀释，形成多种菌液，其次将多种菌液依次接种到含有CaCO3的MRS固体培养基中，筛选出产透明圈的多个菌株，然后对多个菌株逐一进行单菌落培养，挑取多个单菌落进行H2O2酶触实验和革兰氏染色实验，最后选取H2O2酶触阴性且革兰氏染色阳性的多个菌株，即为多个乳酸菌菌株；步骤二：菌种的复筛工作：菌种的复筛即为对步骤一中得到的多个乳酸菌菌株以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为指示菌做抑菌试验；选取出不仅抑制革兰氏阳性菌，还能够抑制革兰氏阴性菌的多个具有双重抑制特性的菌落；步骤三：发酵特性试验工作：将步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落分别进行产粘液、耐盐性、耐硝性、产气试验、产H2S、氨基酸脱羧酶试验、精氨酸产氨试验及其他发酵特性试验，从而判断通过发酵特性试验得到的菌株是否可以加入到发酵肉制品中，确定多个具有双重抑制特性的菌落中能够满足发酵肉制品发酵剂要求的多个具有多重特性的菌落；步骤四：排除有机酸、H2O2和酶对抑菌作用影响的检测工作：排除有机酸、H2O2和酶使多个具有多重特性的菌落具有抑菌作用的检测工作如下：首先排除有机酸对抑菌作用的检测工作：将多个具有多重特性的菌落的无菌过滤液调节pH至6.5～7.0，向牛津杯中加入中和前后的粗提物无菌过滤液，35℃～37℃培养23～25h，利用抑菌圈法测抑菌圈直径，当菌圈直径小于8mm时，表明具有多重特性的菌落受有机酸影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当菌圈直径在8～16mm内，表明具有多重特性的菌落未受有机酸影响而产生抑菌作用，形成无菌过滤液待用；其次排除H2O2对无菌过滤液抑菌活性影响的检测工作：将过氧化氢酶溶解于50μmol/L的磷酸盐缓冲液中配成母液，加入到经有机酸排除的无菌过滤液中，使过氧化氢酶的终浓度达到5mg/mL，37℃水浴2h，加入到牛津杯中37℃培养24h，测抑菌活性，当抑菌为失活状态时，表明具有多重特性的菌落受H2O2影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当抑菌为活性状态时，表明具有多重特性的菌落未受H2O2影响而产生抑菌作用，形成发酵液；最后排除蛋白酶对发酵液抑菌活性影响的检测工作：把胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，分别溶解在3mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中配成母液，加入到排除有机酸和H2O2作用后的发酵液中，使酶的终浓度达到0.5mg/mL，37℃水浴2h，加入到牛津杯中，测抑菌活性，当抑菌为失活状态时，表明具有多重特性的菌落受蛋白酶影响而产生抑菌作用，除去该类菌落；当抑菌为活性状态时，表明具有多重特性的菌落未受蛋白酶影响而产生抑菌作用，形成细菌素粗提物；步骤五：pH和温度对细菌素粗提物的影响：经过步骤四检验得到的细菌素粗提物用1mol/LHCl调节pH2～8，将细菌素粗提物分别在60℃、80℃、100℃、115℃、121℃加热20min，以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌做抑菌试验，观察细菌素粗提物的抑菌效果并记录菌圈直径的变化；步骤六：生理生化鉴定工作以及分子鉴定工作：将步骤四检验得到的细菌素粗提物进行化学成分分析，同时将步骤四检验得到的细菌素粗提物利用PCR扩增原理进行分子鉴定工作，最终得到的菌种为清酒乳杆菌。本发明中步骤六的生理生化鉴定工作利用现有的化学成分的鉴定方法实现。步骤六中的分子鉴定为16SrDNA鉴定，即基因组DNA提取，按SK8255细菌试剂盒操作并利用PCR扩增原理实现。具体实施方式二：本实施方式为具体实施方式一的进一步限定，本实施方式中步骤二中的抑菌试验的操作过程为：在平板底部加入10mLMRS培养基，把牛津杯打入到平板中，带培养基冷却后再倒入15mLLB培养基，待LB培养基冷却后摘掉牛津杯，打入100μL液体培养基上清液，培养24h后侧抑菌圈直径。本实施方式中MRS培养基和LB培养基均为现有培养基。具体实施方式三：本实施方式为具体实施方式一的进一步限定，本实施方式中步骤二中的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为大肠杆菌。具体实施方式四：本实施方式为具体实施方式一的进一步限定，本实施方式中步骤三中的产粘液、耐盐性以及耐硝性的试验过程如下：产粘液的试验过程：从步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落中直接挑取出若干个菌落直接观察各自产生粘液的情况；耐盐性的试验过程：把步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落选取三个具有双重抑制特性的菌落直接接种于添加2％、4％和6％NaCl的MRS液体培养基中，600nm测定OD值，比较各自的生长情况，同时以未接菌的MRS培养基作空白对照；耐硝性的试验过程：把步骤二得到的多个具有双重抑制特性的菌落选取三个具有双重抑制特性的菌落接种于添加50、100和150mg/kgNaNO2的MRS液体培养基，600nm测定OD值，比较各自的生长情况，以未接菌的MRS培养基作空白对照。具体实施方式五：本实施方式为具体实施方式一的进一步限定，本实施方式中当步骤一中选取等重量的七份肉类熟食样品时，每份肉类熟食样品对应有一份生理盐水，同时将选取的每份肉类熟食样品按质量比为1：9的比例放入其对应的生理盐水中，各菌液分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8，从而形成七种菌液。下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。实施例一：本实施例包括以下步骤：步骤一：菌种的初筛工作首先取板鸭、牛干巴、腊鱼、火腿、咸肉各10g样品，加入到90g生理盐水中。用生理盐水进行稀释为10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，接种到含有CaCO3的MRS固体培养基中，筛选出产透明圈的菌株，因为乳酸菌产生乳酸水解CaCO3，从而含有CaCO3的MRS固体培养基能够进行单菌落培养。挑取单菌落进行H2O2酶触实验和革兰氏染色实验，选取H2O2酶触阴性革兰氏染色阳性的菌株，同时这也是乳酸菌的筛选条件，即可初步确定其为乳酸菌。共得到95株乳酸菌。95株乳酸菌的来源及各项指标如下表一所示：表一菌种来源菌株数过氧化氢酶触革兰氏染色pH南京板鸭28-+4.44-4.59牛干巴37-+4.13-4.93海南腊鱼20-+4.37-4.51宣威火腿1-+4.31咸肉10-+4.23-4.92步骤二：菌种的复筛工作：对步骤一得到的95株乳酸菌进行抑菌实验以得到具有光谱抑菌作用的乳酸菌，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌做抑菌试验。抑菌试验具体步骤为首先在平板底部加入10mLMRS培养基，把牛津杯打入到平板中，带培养基冷却后再倒入15mLLB培养基，待LB培养基冷却后摘掉牛津杯。打入100μL液体培养基上清液，培养24h后侧抑菌圈直径。得到的95株菌进行抑菌试验，通过观察可知75株菌有抑菌效果，37株有明显抑菌作用，但是只有14株菌不仅抑制金黄色葡萄球菌而且抑制大肠杆菌。步骤三：发酵特性试验工作：1)产粘液：挑取菌落直接观察。2)耐盐性：把菌接种于添加2％、4％和6％NaCl的MRS液体培养基，600nm测定OD值，比较其生长情况，以未接菌的MRS培养基作空白对照。3)耐硝性：把菌接种于添加50、100和150mg/kgNaNO2的MRS液体培养基，600nm测定OD值，比较其生长情况，以未接菌的MRS培养基作空白对照。4)进行产气试验、产H2S、氨基酸脱羧酶试验、精氨酸产氨试验及其他的发酵特性试验。试验进行的过程与现有的发酵特性试验相同。通过发酵特性试验可以判断得到的菌株是否可以加入到发酵肉制品中。抑菌试验得到的14株菌。由于得到的菌株要加入到发酵肉制品中，所以要满足发酵肉制品发酵剂的要求，只有Y2、Y9、Y19、Y24、B1、B18既满足抑菌条件又满足发酵条件。具体情况如下表二所示：表二步骤四：排除有机酸、H2O2和酶对抑菌作用影响的检测工作：检测有机酸、H2O2、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对抑菌作用的影响。细菌粗提物抑菌有可能是因为有机酸H2O2的作用，因此要排除这两种物质的作用，大多数抑菌物质为蛋白，因此也需要测定抑菌物质的具体成分，所以进行蛋白酶的敏感作用。1)排除有机酸对抑菌作用的影响粗提物的无菌过滤液调节pH至6.5-7.0，向牛津杯中加入中和前后的粗提物无菌过滤液，37℃培养24h，测抑菌圈直径。2)排除过氧化氢对抑菌活性的影响将过氧化氢酶溶解于50μmol/L的磷酸盐缓冲液中配成母液，磷酸盐缓冲液为pH7.0，加入到经酸排除的无菌过滤液中，使过氧化氢酶的终浓度达到5mg/mL。37℃水浴2h。加入到牛津杯中37℃培养24h，测抑菌活性。3)酶对粗提物抑菌活性的影响把胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，分别溶解在3mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中配成母液，加入到排除有机酸和过氧化氢作用后的发酵液中，使酶的终浓度达到0.5mg/mL，37℃水浴2h。加入到牛津杯中，测抑菌活性。具体检测过程如下表三：表三上表中“+”表示有活性抑菌直径在8-12mm之间，“++”表示活性抑菌直径在12-16mm之间，“-”表示失活，“(-)”表示部分失活。结果表明在pH对抑菌作用的影响不大。这6株菌抑菌结果均不受过氧化氢的影响。发现Y2、Y9、B1抑菌作用不受蛋白酶的影响，证明其抑菌物质的非蛋白特性，Y19、Y24、B18抑菌作用受蛋白酶的影响，但是其对不同的蛋白酶影响作用不同，Y19对木瓜蛋白酶敏感，Y24对胰蛋白酶敏感，B18对胃蛋白酶更敏感。步骤五：检测pH和温度对细菌素粗提物的影响：将细菌素粗提物用1mol/LHCl调节pH2-8，将细菌素粗提物分别在60℃、80℃、100℃、115℃、121℃加热20min，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌做抑菌试验。具体检测结果如下表四：表四结果表明这株菌在pH2-8均有抑菌作用，但是在本身菌液的pH附近抑菌效果最好。这株菌对温度从60-100℃的抑菌作用基本稳定，Y24在115℃仍有抑菌活性，在121℃这3株菌基本失活。步骤六：生理生化鉴定工作以及分子鉴定工作：参照GB4789.35—2010，生理生化鉴定结果如下表五：表五上表中“-”表示阴性，“+”表示阳性分子鉴定工作：基因组DNA提取、按SK8255细菌试剂盒操作以及PCR扩增过程，利用细菌通用引物进行扩增16SrDNA，反应条件为94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。通用引物为27F【5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’】和1492R【5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’】将PCR产物送交相关专业部门进行16SrDNA序列的测定。经过以上实验得到Y19抑菌效果最好，同时又适合作为肉品发酵剂，最终鉴定为清酒乳杆菌。当前第1页1 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