一种黑鲷基因组DNA的快速提取方法与流程

本发明属于基因组DNA提取领域，特别涉及一种黑鲷基因组DNA的快速提取方法。

背景技术：

随着分子生物学手段在鱼类研究的大规模应用，基因组DNA的提取已经成为了一种最常用的技术之一，是各类研究成功进行的前提和保证。

酚/氯仿抽提法是一种常用的DNA提取方法，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质，通常是将处理好的样本，分别加入细胞裂解液，蛋白酶K，苯酚以及氯仿和异戊醇的混合液逐步进行处理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。苯酚可以使蛋白质变性，同时抑制DNase的降解作用。加入苯酚后，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿可以除去核酸溶液中的苯酚，加速有机相与液相分层。异戊醇可以降低表面张力，减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相和下层的有机溶剂相维持稳定。

酚/氯仿抽提法是鱼类基因组提取中最常用的方法，该方法技术较为成熟，提取效果理想，但操作较为繁琐，耗时较长，且提取试剂多具有毒性，易对实验操作人员造成伤害。而采用试剂盒提取的成本则较高，不适用于基因组DNA的大量提取。目前许多生物技术手段，如遗传育种中家系的鉴定，群体遗传多样性分析，利用分子标记对增殖放流效果进行评估等，都需要大量个体进行分析或筛查，基因组DNA提取工作量较大。所以，急需发明一种快速、低成本的DNA提取方法将为这些研究提供便利。

专利号201210031745.5公开了一种草鱼基因组DNA快速提取方法，相较于该方法，本发明所用试剂不含SDS、EDTA等会对PCR反应有直接影响的物质，因此，DNA提取液可不经吸附柱等方式纯化直接用于PCR反应。步骤大为简化，操作时间更短，对设备的要求更低，提取成本也更低，可在试验条件相对简陋的地点进行现场操作。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种黑鲷基因组DNA的快速提取方法，该方法提取步骤简单、快速，对实验仪器要求较低，基因组DNA的提取可在1h内完成，相较于试剂盒提取更便捷。

本发明的一种黑鲷基因组DNA的快速提取方法，包括：

将黑鲷鳍条或肌肉样品研磨或剪碎，加入提取缓冲液，震荡混匀，得到黑鲷组织提取液；然后于65℃放置20～40min，取出样品，冷却，静置或离心取上清，得到黑鲷基因组DNA；其中，提取缓冲液为1％TritonX-100、pH＝8.0的100mM Tris-HCl、300mM NaAc和500mM NaCl的混合液。

所述黑鲷鳍条或肌肉样品为新鲜样品或无水乙醇保存样品。

所述提取缓冲液与黑鲷鳍条或肌肉样品的比例为10～20μL:1μg。

所述取出样品前采用金属浴或恒温水浴锅65℃放置30min，期间间或混匀。

所述静置的时间为3～5min。

所述离心的条件为13000r/min离心3min。

所述黑鲷基因组DNA可通过加入2倍体积预冷无水乙醇沉淀，再经70％乙醇洗涤纯化以满足更高实验要求或用于长期保存。

专利号201210031745.5公开了一种草鱼基因组DNA快速提取方法，相较于该方法，本发明所用试剂不含SDS、EDTA等会对PCR反应有直接影响的物质，因此，DNA提取液可不经吸附柱等方式纯化直接用于PCR反应。步骤大为简化，操作时间更短，对设备的要求更低，提取成本也更低，可在试验条件相对简陋的地点进行现场操作。

有益效果

(1)本发明提取步骤简单、快速，对实验仪器要求较低，基因组DNA的提取可在1h内完成，相较于试剂盒提取更便捷；

(2)本发明中所用试剂成本极低，适用于黑鲷基因组DNA的大规模提取；

(3)本发明中所用试剂较为安全，对人体伤害小，对环境友好；

(4)本发明中试剂对PCR和酶切等反应的影响小，DNA提取液可不经纯化直接进行下一步实验操作，进一步简化了实验步骤，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为生工生物DNA Marker D；

图2为实施例2中基因组DNA的PCR扩增效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

从无水乙醇保存黑鲷背鳍鳍条样品提取DNA，并用于线粒体COⅠ基因的PCR扩增。实施步骤如下：

(1)剪取20μg无水乙醇浸泡黑鲷鳍条样品于1.5mL离心管中，用玻璃研磨棒将样品在管壁充分研碎；

(2)加入200μL提取缓冲液(1％TritonX-100+100mM Tris-HCl(pH＝8.0)+300mM NaAc+500mM NaCl)，震荡1min充分混匀；

(3)金属浴或恒温水浴锅65℃放置30min，期间间或混匀；

(4)取出样品，冷却，于离心机中13000r/min离心3min；

(5)吸取上清于另一新管中，用于下一步PCR扩增。用本方法提取的黑鲷基因组DNA，较为完整，效果理想。所取的黑鲷基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图如图1所示(M为生工生物DNAMarker D)。

实施例2

(1)剪取20μg黑鲷新鲜肌肉样品于1.5mL离心管中，用玻璃研磨棒将样品在管壁充分研磨；

(2)加入300μL提取缓冲液(1％TritonX-100+100mM Tris-HCl(pH＝8.0)+300mM NaAc+500mM NaCl)，震荡1min充分混匀，得到黑鲷组织提取液；

(3)恒温水浴锅65℃放置35min，期间间或混匀；

(4)取出样品，冷却，静置5min；

(5)上清液即为得到的黑鲷基因组DNA，用于下一步PCR扩增。

(6)用一对黑鲷线粒体COⅠ基因引物对上述提取DNA进行PCR扩增，引物序列为：

上游引物：5′-TACTCCTTACAGACCGAAAT-3′；

下游引物：5′-TTATGAAGAAAGTGGCAGA-3′；

采用25μL扩增体系：2.5μL 10×PCR buffer，0.5μL dNTP(10mmol/L)，1.5μL Mg²⁺(25mmol/L)，2.5μL DNA提取液，上下游引物各0.75μL(10μmol/L)，0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，用灭菌双蒸馏水补足体积。反应程序为：94℃预变性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃90s，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增条带清晰，无杂带，符合预期目标大小，可以满足测序等分析的需要。扩增效果如图2所示。

对比例1

试剂盒提取黑鲷基因组DNA：

(1)20-50mg组织剪成小碎块，转入装有180μl组织裂解液的1.5ml离心管中，用大口径枪头吹打混匀；

(2)加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋震荡充分混匀；

(3)将裂解物放置在55℃水浴1-3小时，期间轻柔震荡几次；

(4)加入200μl结合液，立刻涡旋震荡充分混匀，70℃放置10min；

(5)冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋震荡充分混匀；

(6)用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管，13000rpm离心60s，倒掉收集管中废液；

(7)加入500μl抑制物去除液，12000rpm离心30s，弃去废液；

(8)加入700μl漂洗液，12000rpm离心30s，弃去废液；

(9)将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；

(10)取出吸附柱，放入干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。离心管中基因组DNA放置4℃备用。

对比实施例1和对比例1可以发现，试剂盒提取步骤繁琐，采用的试剂种类多，工艺成本高，不适用于大规模作业。