本发明属于药用植物种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用。
背景技术：
世纬苣苔Tengia scopulorum Chun，又名黔苣苔，中国贵州特有珍稀濒危药用植物。当年邓世纬先生与助手杨昌汉、徐方才、黄孜文四人为了采集这批植物野外染病，相继殉职，付出了生命的代价。如今原模式产地（贵定平伐）种群疑似已经消亡。就生物多样性而言，濒危物种是优先保护对象。并且世纬苣苔对于苦苣苔科系统分类和进化发育的研究具有非常重要的科学价值与意义，是不可替代的宝贵材料。同时受资源量限制，世纬苣苔的药用研究尚属空白。保护及进一步的科学研究，面临的首要问题都是原植物的鉴定。而传统的植物形态鉴定必须要等到花期，具有较大的时间限制，对操作人员的鉴别能力有较高的要求。同时由于样本量和相关研究较少，现有文献也未公开有用于世纬苣苔的DNA鉴定识别条形码序列。
技术实现要素：
针对现有世纬苣苔的物种鉴定存在鉴别时间段限制以及鉴别难度较大的技术问题，本发明公开了一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用，本鉴定方法从分子水平分析分析世纬苣苔的遗传物质，进而能够快速准确的鉴定植物世纬苣苔，为世纬苣苔的保护和药用价值研究奠定基础。
一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：获取植物组织样本并提取样本DNA；
S2：采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；
和/或采用trnL-F引物对样本DNA进行PCR扩增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物，电泳检测分离出PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；
S3：将多次测序得到的序列通过DNAMAN软件进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到植物组织样本的ITS序列和trnL-F序列，将ITS序列与SEQ ID NO.13所示的序列进行比对，将trnL-F序列与SEQ ID NO.14所示的序列进行比对，以鉴定该植物组织样本是否为世纬苣苔。
进一步的，在步骤S1中，所述植物组织样本为带有叶绿体的叶片组织样本，并采用硅胶对所述植物组织样本进行干燥。
进一步的，步骤S1包括：取0.5-2cm3的硅胶干燥叶片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷冻后用磨碎机碾磨30s，加入800μL65℃预热过的CTAB溶液，再加入0.5%浓度的β-巯基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液为包括体积比为24：1的氯仿和异戊醇，摇匀10min；然后10℃，12000rpm,离心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，离心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，4℃，12000rpm,离心7min；取上清，转至1.5mL的EP管；加入等量-20℃的异丙醇，-20℃下静置1-2h，使DNA沉淀出来；静置后，4℃，12000rpm,离心10min，弃上清；加入300μL 75%乙醇，洗涤两次，每次4℃，12000rpm，离心10min；自然风干30min左右，加60μL的DDH2O溶解DNA30min左右，得到样本DNA；用凝胶电泳检测总DNA。
进一步的，步骤S2中，PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，ITS上游引物或trnL-F上游引物 2 μL，ITS下游引物或trnL-F下游引物 2μL；
所述dNTP的浓度为2.5 mmol/L，所述ITS上游引物、trnL-F上游引物、ITS下游引物、trnL-F下游引物的浓度均为2 mmol/L。
进一步的，步骤S2中，PCR扩增的反应过程包括：94℃预变性4min后进入循环，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循环32次，72℃延伸10min。
进一步的，步骤S3中还包括：将得到的ITS序列和trnL-F序列输入植物遗传序列数据库进行比对，确定近缘物种。
如上所述的SEQ ID NO.13序列在世纬苣苔鉴定中的应用。
如上所述的SEQ ID NO.14序列在世纬苣苔鉴定中的应用。
根据本发明提供的世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，是本发明人通过不同引物PCR扩增试验后发现，采用ITS引物和trnL-F引物进行PCR扩增后得到的ITS序列和trnL-F序列具有与其他种类植物较大的区别特征，即ITS序列和trnL-F序列与其他物种的遗传序列具有较大的区分度，将其应用于世纬苣苔的物种鉴定，与传统的形态鉴定相比，本DNA序列鉴定方法受植物生长期限制小，鉴定所需的植物组织材料极少，格外适用于珍稀濒危植物的鉴定；另一方面本方法能够降低鉴定鉴定过程的不稳定因素，同时因为序列的量化特征而减少了人为主观的介入，使得世纬苣苔的鉴定过程更加快速准确，为世纬苣苔的保护与研究提供了可靠依据。
具体实施方式
下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例采用的材料是贵阳中医学院何顺志教授在贵阳市发现并鉴定的一个世纬苣苔居群的随机采样样本，凭证标本存放于中科院植物研究所王印政研究组，标本编号LMT-2012-016。选取居群不同位置点多个植株的新鲜叶片各1片，立即用硅胶干燥封存。
取世纬苣苔硅胶干燥的叶片，采用改良后的CTAB法提取总DNA。
提取总DNA操作为：取0.5-2cm3的硅胶干燥叶片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷冻后用磨碎机碾磨30s，加入800μL65℃预热过的CTAB溶液（十六烷基三甲基溴化铵溶液），再加入0.5%浓度的β-巯基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液为包括体积比为24：1的氯仿和异戊醇，摇匀10min；然后10℃，12000rpm,离心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，离心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，4℃，12000rpm,离心7min；取上清，转至1.5mL的EP管。加入等量-20℃的异丙醇，-20℃下静置1-2h，使DNA沉淀出来；静置后，4℃，12000rpm,离心10min，弃上清；加入300μL 75%乙醇，洗涤两次，每次4℃，12000rpm，离心10min；自然风干30min左右，加60μL的DDH2O（双蒸水）溶解DNA30min左右，得到样本DNA；用凝胶电泳检测总DNA（取2μL母液，用6× Loading buffer）。
采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，ITS上游引物（2 mM）2 μL，ITS下游引物（2 mM） 2μL。
PCR扩增的反应过程包括：94℃预变性4min后进入循环，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循环32次，72℃延伸10min,得到PCR扩增产物。
用1%琼脂糖的凝胶电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物送华大基因做双向测序。
用DNAMAN将3次测得序列进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到SEQ ID NO.13序列，长617个碱基。
将得到的SEQ ID NO.13序列输入“中药材DNA条形码鉴定系统”的数据库中进行物种鉴定，显示最接近的物种显示为Tengia scopulorum [Petrocodon scopulorus]，序列相似性99.2%。
将得到的SEQ ID NO.14序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，最接近的物种显示为Tengia scopulorum，序列相似性99%。
实施例2
本实施例包括如实施例1中的大部分技术特征，其不同之处在于：
本实施例中采用trnL-F引物对样本DNA进行PCR扩增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL， trnL-F上游引物（2 mM）2 μL，trnL-F下游引物（2 mM） 2μL。
最终得到SEQ ID NO.14序列，长838个碱基。
将得到的SEQ ID NO.14序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，在以“ident”为优先排序条件下，最接近的物种显示为Tengia scopulorum，序列相似性99%。
对比例1
本对比例包括如实施例1中的大部分技术特征，其不同之处在于：
本实施例中采用rbcL引物对样本DNA进行PCR扩增，所述rbcL引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.5所示）和rbcL下游引物（如SEQ ID NO.6所示）。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，rbcL上游引物（2 mM）2 μL，rbcL下游引物（2 mM） 2μL。。
得到SEQ ID NO.15序列，长636个碱基。
将SEQ ID NO.15序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，最接近的物种显示为Primulina liboensis，序列相似性99%。
对比例2
本对比例包括如实施例1中的大部分技术特征，其不同之处在于：
本实施例中采用matK引物对样本DNA进行PCR扩增，所述matK引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.7所示）和matK下游引物（如SEQ ID NO.8所示）。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，matK上游引物（2 mM）2 μL，matK下游引物（2 mM） 2μL。
得到SEQ ID NO.16序列，长847个碱基（比对后末端做了近200个碱基剪除后的长度）。
将SEQ ID NO.16序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，最接近的物种显示为Petrocodon coriaceifolius，序列相似性99%。
对比例3
本对比例包括如实施例1中的大部分技术特征，其不同之处在于：
本实施例中采用atpI-H引物对样本DNA进行PCR扩增，所述matK引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.9所示）和atpI-H下游引物（如SEQ ID NO.10所示）。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，atpI-H上游引物（2 mM）2 μL，atpI-H下游引物（2 mM） 2μL。
得到SEQ ID NO.17序列，长867个碱基（比对后前端做了约70个碱基剪除后的长度）。
将SEQ ID NO.17序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，最接近的物种显示为Petrocosmea iodioides，序列相似性98%。
对比例4
本对比例包括如实施例1中的大部分技术特征，其不同之处在于：
本实施例中采用rps16引物对样本DNA进行PCR扩增，所述rps16引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.11所示）和rps16下游引物（如SEQ ID NO.12所示）。
PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，rps16上游引物（2 mM）2 μL，rps16下游引物（2 mM） 2μL。
得到SEQ ID NO.18序列，长760个碱基
将SEQ ID NO.18序列输入NCBI的BLAST网页的数据库中进行物种鉴定，最接近的物种显示为Primulina dryas，序列相似性98%。
结果分析
实施例1-2、对比例1-4中所采用的ITS引物、trnL-F引物、rbcL引物、matK引物、atpI-H引物和rps16引物均为现有引物，根据鉴定效果分析，确定世纬苣苔的DNA鉴定识别条形码为核DNA的ITS序列（SEQ ID NO.13序列）和叶绿体DNA的trnL-F序列（SEQ ID NO.14序列）。
DNA片段应用于植物鉴定直接而有效，其关键环节在于数据的预先存储。就像形态鉴定依据的植物志，DNA鉴定所需的植物DNA数据库的预储存及鉴定效果评价至关重要。对比例序列，如世纬苣苔rbcL、matK、atpI-H、rps16，缺少预先储存的绝对近缘DNA数据，所以无法应用于鉴定。另一方面，有些片段对具体物种的区分度过低，也无法应用于鉴定；如世纬苣苔的matK序列，与其序列相似性99%的物种序列目前已达20多个，难以区分；rbcL、atpI-H、rps16序列也在植物DNA数据库找到序列相似性较高的其他物种，区分度不够。
DNA鉴定比之形态鉴定的优势主要有：受植物生长期限制极小，鉴定所需采取的材料极少，同时因为序列的量化特征而减少了人为主观的介入。其中对生长期与材料的极小要求特征，格外适用于珍稀濒危植物的鉴定。
单一序列片段对广泛物种鉴定的区分度有限，需要更可靠的多序列组合鉴定条形码，来达到准确鉴定的目的。故本研究确定的ITS和trnL-F序列条形码相互结合能达到对珍稀濒危药用植物世纬苣苔的快速准确鉴定，为世纬苣苔的保护与研究提供了可靠依据。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
<110> 刘, 明涛
<120> 一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用
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