本发明涉及一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis，简称bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。
现有技术主要认为bt之所以能够具有杀虫活性，主要是由于其体能能够产生各种cry蛋白、cyt蛋白和vip蛋白。
然而，鲜有报道bt还能够产生不同于以上三种蛋白的杀虫活性物质，特别是对某些鞘翅目(coleoptera)害虫，例如华北大黑鳃金龟(holotrichiaoblita)具有优良活性的杀虫活性物质。
技术实现要素：
本申请之一提供了一种杀虫蛋白，其具有如(i)和(ii)中的至少一种的氨基酸序列：
(i)seqidno.2所示的氨基酸序列；
(ii)与如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如seqidno.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如seqidno.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如seqidno.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如seqidno.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，所述杀虫蛋白还可以为如(i)的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸后，与具有如(i)的氨基酸序列的杀虫蛋白具有相同功能的蛋白。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如seqidno.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(ii)限定的杀虫蛋白在与如seqidno.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
本申请的杀虫蛋白对害虫的杀虫活性，特别是对华北大黑鳃金龟的杀虫活性显著优于现有技术中的杀虫蛋白的杀虫活性，其可以弥补例如cry8g蛋白在对华北大黑鳃金龟(holotrichiaoblita)杀虫活性较弱的不足。因此，其丰富了杀虫蛋白资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高bt转基因产品的抗虫效果，具有重要的经济、社会和生态效益。
本申请之二提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码如本申请之一所述的杀虫蛋白中任意一种的核苷酸序列。该核苷酸序列可以以其来源菌株为模板，或以克隆的全长dna片段为模板，通过pcr扩增得到；也可以根据给定的序列人工合成。
在一个具体的实施例中，当所述杀虫蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示时，编码所述杀虫蛋白的所述核苷酸序列如seqidno.1所示。
本申请之三提供了一种组合物，其包括如本申请之一所述杀虫蛋白的至少一种。
在一个具体的实施例中，当所述杀虫蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示时，编码所述杀虫蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本申请之四提供了一种含有本申请之二所述的核苷酸序列，且能产生本申请之一相应的所述的杀虫蛋白的转基因微生物。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因微生物包括芽胞杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonas)、肠杆菌(escherichia)和酵母(saccharomyces)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)、枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)、萎缩芽胞杆菌(bacillusatrophaeus)和蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(escherichiacoli)。
在一个具体实施例中，本申请的转基因微生物的出发株(即在转入本申请之二所述的核苷酸序列之前的微生物)为野生微生物和/或遗传工程微生物。
其中，野生微生物是指从自然界中分离出的未经过人工改造的微生物。
遗传工程微生物是指将野生微生物人工改造的微生物。
本申请的转基因微生物和/或遗传工程微生物的物种并不因进行了转基因修饰而改变，因此，转基因微生物与发生转基因之前的微生物(即作为受体微生物)为相同的物种。
在一个具体实施例中，如上的本申请二的所述的核酸序列能够被连接在表达载体上。所述表达载体例如可以是能够在大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌中穿梭的pstk表达载体。
本申请之五提供了根据本申请之二所述的核苷酸序列在制备转基因植物中的应用，其中，所述转基因植物能够产生如本申请之一所述的杀虫蛋白；所述转基因植物包括十字花科(cruciferae)、蝶形花科(papilionaceae)、藜科(chenopodiaceae)和菊科(compositae)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因植物包括芸薹属(brassica)、萝卜属(raphanus)、苜蓿属(medicago)、甜菜属(beta)和莴苣属(lactuca)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因植物包括油菜(brassicacampestris)、大白菜(brassicarapa)、小白菜(brassicachinensis)、甘蓝(brassicaoleracea)、萝卜(raphanussativus)、苜蓿(medicagosativa)、甜菜(betavulgaris)和莴苣(lactucasativa)中的至少一种。
转基因植物的物种并不因进行了转基因修饰而改变，因此，转基因植物与发生转基因之前的植物(即作为受体植物)为相同的物种。
本申请之六提供了一种制备如本申请之一所述的杀虫蛋白的方法，其包括利用本申请之四所述的转基因微生物，和/或利用本申请之五所述的应用中的转基因植物来生产所述杀虫蛋白。
在一个具体的实施例中，优选还包括在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到80％以上。
在一个具体的实施例中，更优选在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到90％以上。
在一个具体的实施例中，甚至是在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到99％以上。
因此，本申请之七提供了根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治鞘翅目(coleoptera)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治叶甲科(chrysomelidae)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，特别优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治猿叶甲属(colaphellus)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，最优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治大猿叶甲(colaphellusbowring)中的应用。
单克隆抗体的制备技术已经较为成熟，因此，根据现有技术的常规技术手段，可以制得本申请之一所述的杀虫蛋白的单克隆抗体。在制备单克隆抗体过程中，选用的抗原可以是本申请之一所述的杀虫蛋白的全长序列，也可以是本申请之一所述的杀虫蛋白的部分氨基酸序列。所述抗原的纯品可以通过本申请之六提供的制备如本申请之一所述的杀虫蛋白的方法来获得；所述抗原，特别是当其为部分氨基酸序列时，也可以通过人工合成的方式获得。因此，本申请之八提供了根据本申请之一所述的杀虫蛋白的单克隆抗体。优选所述单克隆抗体为仅特异识别所述杀虫蛋白的单克隆抗体。
在本申请中没有特殊说明的情况下，本申请中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
1)液体lb：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。
2)固体lb：在液体lb培养基中加1.3％琼脂，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。
3)抗生素：氨苄青霉素水溶液100mg/ml，用时稀释500倍-20℃保存。其中pet21b质粒载体具有氨苄青霉素抗性。
蛋白电泳检测
120v预电泳约10-20min，取蛋白样品40μl，加入10μl5×加样缓冲液，混匀，再将上清和沉淀分别梯度稀释，煮沸5-10min，12000rpm离心5min，取10l上清点样。80v恒压电泳至样品浓缩呈直线，150v恒压电泳至指示的溴酚蓝到达凝胶底部。
脱色：电泳后取出凝胶，电泳后取出凝胶并用蒸馏水冲洗，加入50ml溶液i，微波炉中加热30s，60rpm振荡10min。
染色：倒掉溶液i后加入溶液ii(每50ml溶液ii加200l溶液iii)微波炉加热30s，60rpm振荡15min以上。
倒掉溶液ii，加入无菌水，凝胶成像系统照相保存。
观察结果，根据蛋白条带着色程度比较目的蛋白表达情况，用凝胶成像系统照相保存。
表1为sds聚丙烯酰氨凝胶的制备表。
表1sds聚丙烯酰氨凝胶的制备表
实施例1新基因的筛选及克隆
bt基因组提取
s1：5ml1mtris-hcl，1ml0.5medta，171.15g蔗糖，ph7.0，定容至500ml，115℃20min灭菌。
s2：10％sds4ml+ddh2o6ml，ph4.8-5.2。
s3：5m异硫氰酸胍，1mnaac。
te：10mmtris-hcl3ml，1mmedta600ul，ph8.0，定容至300ml。
1)将苏云金芽胞杆菌4ce1菌株划线接种于lb培养基上，30℃培养过夜；
2)尽可能刮取平板上全部菌体于1.5mlep管中，用150μls1充分悬浮；
3)加入100mg石英砂，组织破碎仪上破碎1分钟；
4)加入200μls2，充分混匀；
5)加入400μls3，充分混匀，12000rpm离心10分钟；
6)将最上层上清转移至1.5ep管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置20分钟；
7)12000rpm离心10分钟，弃上清；
8)70％无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；
9)加100μlte溶液溶解沉淀；
10)0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组质量和浓度，-20℃保存备用。
以4ce1sip_f1：atgtgtgtatctgcccctggtagtgt(seqidno.3)和4ce1sip_r：attgaaacttcttgtcgccactaatt(seqidno.4)为引物，以4ce1菌株基因组为pcr模板，进行pcr扩增。扩增循环：94℃预变性10min；94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸；30个循环，最后72℃延伸10min，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照axygen公司的dna回收试剂盒的操作说明进行pcr产物回收，并将其连接到pmd-19t克隆载体上，转化dh5α感受态细胞，获得重组克隆载体，被命名为pmd-4ce1sip。然后以4ce1sip_f2：caccatgtgtgtatctgcccctggtagtgt(seqidno.5)；4ce1sip_r：attgaaacttcttgtcgccactaatt(seqidno.4)为引物，以pmd-4ce1sip为pcr模板，利用金牌mix(green)试剂盒(购自北京擎科新业生物技术有限公司)进行pcr扩增。扩增循环：94℃预变性10min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸；30个循环，最后72℃延伸10min，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照axygen公司的dna回收试剂盒的操作说明进行pcr产物回收，并将其连接到pde2表达载体(北京擎科新业生物技术有限公司pde2directionaltopoexpressionkitver.2试剂盒)上，转化dh5α感受态细胞，进行抗性筛选，获得重组表达载体，被命名为pde2-4ce1sip。
经测序分析，4ce1sip(seqidno.1)基因长度912bp，其编码蛋白为4ce1sip，共304个氨基酸(seqidno.2)，表达33kda蛋白。
然后提取pde2-4ce1sip重组质粒，并将其转化到表达菌株rosetta(de3)。将4ce1sip在大肠杆菌rosetta(de3)中进行iptg诱导表达，sds-page电泳结果发现，4ce1sip基因在可溶组分和不可溶组分中均表达；其中表达约33kda左右蛋白，与预期结果相符。阴性对照(即不含有4ce1sip基因，但含有pet-21b载体的大肠杆菌rosetta(de3))在可溶和不可溶性组分中都没有相应蛋白的表达条带。
实施例2
蛋白的表达与定量分析
将携带4ce1sip基因的大肠杆菌rosetta(de3)菌株以1％的接种量接种于lb液体培养基中，37℃培养至od600值达到0.5-1.0之间时，加入诱导物50mmiptg，在150rpm，20℃低温下诱导12h。然后在4℃下，8000rpm离心3min。离心收集菌体，加入50mmtris·cl(ph8.0)悬浮；破碎菌体(利用超声波常规完全破碎)，将超声破碎后的菌液在4℃下12,000rpm离心15min；然后收集上清液。按照如下方法对所述上清液进行sds-page定量分析：制备以下5种不同浓度梯度的bsa：0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl，并将目标蛋白进行梯度稀释，使其终浓度介于0.8-0.05μg/μl，目标蛋白和5种不同浓度的bsa(蛋白定量试剂盒：dcproteinassay)上样量均为10μl，进行蛋白电泳检测。以牛血清蛋白(bsa)为标准蛋白制作蛋白浓度标准曲线，测定大肠杆菌rosetta(de3)重组菌株中总蛋白的浓度。结合imagemastervds软件分析sds-page中目的蛋白所占比例，计算目的蛋白，即得到上清液中的4ce1sip的浓度。
对比例1
以克隆到pet21b上的cry3aa7(seqidno.5)基因在大肠杆菌rosetta(de3))中相同条件下的表达产物为生物活性测定分析的阳性对照。cry3aa7(seqidno.6)蛋白的表达与定量分析同实施例2。
实施例3
活性分析
大猿叶甲(colaphellusbowringii)由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组提供。
害虫的生物活性测定操作步骤如下：
(1)选取鲜嫩一致的叶片，用清水洗净，晾干，剪成一次性平皿(直径＝6cm)大小；
(2)将叶片在配制好的系列稀释的上清液(加入洗涤剂，终浓度0.1％)中浸泡30s；
(3)在实验台上铺一层保鲜膜，蘸有样品的叶片置于保鲜膜上，室温晾干；
(4)将叶片分别放于培养皿中，培养皿(直径＝9cm)中垫入无菌水喷湿的滤纸(所述滤纸需用锡箔纸包装灭菌)；
(5)用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个叶片接幼虫30头作为一个处理，每个处理做三次重复，接完虫后以2层吸水纸严格密封，并用橡皮筋固定，防止幼虫爬出；
(6)放置25℃生化培养箱中，光周期为16h：8h，湿度50％左右，每天观察叶片是否腐烂或干枯，是否有水蒸气凝结，并调整生化培养箱内的水分，保持箱内湿度；
(7)48h后调查各个处理的死、活虫数，计算死亡率、存活率、校正死亡率和lc50。
其中，对试虫进行lc50测定之前，首先使用如上的生物活性测定方法经过初筛初步确定杀虫的浓度范围，然后再测定一系列的浓度梯度下的杀虫活性，进而计算出lc50。在某一特定浓度下的死亡率和校正死亡率计算公式如下：
根据生测数据采用spss(v13.0)软件计算致死中浓度(lc50)。其结果见表2。
表2
由表2的结果可知，本申请的4ce1sip杀虫蛋白对大猿叶甲的活性显著地优于已知的cry类杀虫蛋白cry3aa7。将本申请的4ce1sip杀虫蛋白用于防治大猿叶甲，不但提供了一种新型的杀虫蛋白，而且还可以显著地降低生产成本，从而带来更为可观的经济效益。
虽然本发明已经参照其优选地具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。例如，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物或方法步骤。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。并且利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
lha1760148核苷酸和氨基酸序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
<130>lha1760148
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<213>苏云金芽胞杆菌（bacillusthuringiensis）
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<213>苏云金芽胞杆菌（bacillusthuringiensis）
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