本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种调控玉米生育酚合成的核苷酸序列及其应用。
背景技术：
维生素e(vitamine)是一种脂溶性抗氧化物质，维生素e系列包括两个分组：生育三烯酚(t3)和生育酚(t)，两者都是由一个极性芳香环头部和类异戊二烯基侧链组成，而主要区别在于生育三烯酚的类异戊二烯基侧链含有3个不饱和键，而生育酚则含有饱和侧链。在自然界中，维生素e有八种构象，根据芳香环上甲基的位置和数目的不同，生育酚和生育三烯酚都可分为α、β、γ、δ四种类型。生育酚和生育三烯酚的抗氧化能力是由芳香环上提供氢原子的能力决定的，在体内，四种生育酚抗氧化活性的顺序为α>β>γ>δ，据估计一个α-生育酚分子能够淬灭120个单态氧分子。在植物和动物中，生育酚能够清除脂质过氧化反应过程中产生的自由基，对植物来说，生育酚能够提高植物的抗逆性性，提高种子保存寿命，保证种子正常发芽，因此生育酚的合成也是种子进化过程中的一个关键的生化代谢途径。对动物来说，在老鼠中的研究表明，维生素e的缺乏会导致不育和胎儿的死亡。近来还发现维生素e可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环。
所有的植物、部分藻类和蓝细菌通过光合生物均可合成生育酚，人和动物不能合成生育酚，只能通过食物摄入。由于人和动物体内受肝脏生育酚结合蛋白与不同类型生育酚的结合能力不同，因此不同类型的生育酚生物活性不同，其中α-生育酚的活性最高。一般来说，作物种子的生育酚总含量要高于叶子，但是对大部分种子作物来说，α-生育酚是少量的，而β、γ、δ生育酚和生育三烯酚占主要成分。在自然界中，只有一种rrr-α-生育酚，它在人和动物体内最容易保留并分布于体内。成年人每天应该摄7-9mg的rrr-α-生育酚。如果摄入额外的生育酚，将有利于减少心血管疾病，癌症，提高免疫力。因此，提高食物中生育酚的含量，将有利于促进人类的健康。
人体所需维生素e70％来源于植物油，它是良好天然维生素e来源。近年来，天然维生素e年需求增长10％，而实际年产量难以满足市场需求，生产厂家主要集中在美国、日本、德国等发达国家，中国国内产量有限。随着人们对健康生活的关注，不饱和脂肪酸含量高的玉米油越来越被喜欢。玉米籽粒中生育酚的变异范围较广，这就为提高籽粒中生育酚的含量提供了遗传基础。因此，在有限的玉米种植面积下，选育富含高生育酚的玉米品种是满足玉米生育酚市场需求的必要途径。同时生育酚可保护油脂不被氧化，因此高生育酚含量的玉米油将有很大的应用前景。为了达到此目的，对调控玉米生育酚合成的主效基因进行挖掘，研究其调控机理，有利于了解玉米生育酚合成调控的分子基础并更换地对其进行利用。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明提供的解决方法基于分离并鉴定影响植物生育酚表达的基因，尤其是来源于玉米(zeamaysl.)的生育酚合成主效基因。应用上述基因可以特异性地研究并调控玉米生育酚的表达，还可以将该基因转入其他玉米植株进行超表达，从而提高生育酚的表达量，在获得玉米新品种和改善玉米油产品品质等方面将有很大的应用前景。
因此，本发明的目的就是提供一种调控玉米生育酚合成的核苷酸序列，该序列包含seqidno1中所示的核苷酸序列，或其中一段，或与所述序列基本同源的核苷酸序列，或与上述序列互补配对的序列。应用所述核苷酸序列生产玉米植株和杂种种子成为本发明附加的目的。
本发明另一个附加目的是构建包括整个或部分所述核苷酸序列的dna构建物，以及含所述的序列或dna构建物的载体和上述载体转化的细胞。
本发明另一个附加目的是应用所述的dna序列或所述的dna构建物生产提高玉米生育酚表达量的转基因植株，并详细提供了转基因植物的构建方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为qtl定位研究结果；图1a为控制籽粒生育酚含量的qtl定位，图1b为qtl置信区间在染色体中的位置，图1c为四个重组家系qtl置信区间内的基因型和其生育酚含量差异的检测，图1d为候选区间内的基因；
图2为实施例2中两转基因家系520和541阳性单株和阴性单株三种生育酚差异显著性分析。
具体实施方式
本发明提供的调控玉米生育酚合成的核苷酸序列，下文中称为本发明的核苷酸序列，其选自：
a).seqidno1中所示核苷酸序列的核苷酸序列；
b).保留玉米生育酚合成能力的任何所述seqidno1的片段；
c).与a)和b)中定义的核苷酸序列基本类似的核苷酸序列；和
d).与a)、b)、c)任一项互补的核苷酸序列。
在本说明书所用的意义上，单词“类似”意在包括任何至少具有在生育酚特异表达调控能力的核苷酸序列。
典型的类似dna序列：以seqidno1中所示的核苷酸序列为基础可从任何产该类似序列的生物中分离得到，或以seqidno1中所示的核苷酸序列为基础通过替换一或多个碱基，在序列中插入一或多个碱基，在序列的任一末端添加一或多碱基或，在任一末端或序列内部缺失一或多个碱基构建而得。如，类似的dna序列可能是seqidno1中所示的核苷酸序列的子序列。
一般说来，类似的dna序列与seqidno1中定义的核苷酸序列基本同源。从本说明书的意义来看，“基本同源”意即在核苷酸水平所讨论的核苷酸序列至少有60％的同一性，优选至少85％或更优选至少95％，或更优选至少97％、98％或99％。
本发明的核苷酸序列可源于包含它的任一生物，如来自玉米(zeamaysl.)或来自该dna序列转化的宿主生物。本发明的核苷酸序列可用传统技术分离，应用本发明核苷酸序列的信息制备寡聚核苷酸探针从任何其他物种的dna中起始。
在具体的实施方案中，本发明的核苷酸序列是seqidno1中所示的序列，并将其命名为zmpor1基因。
基于分子生物学技术普通知识，可以从其他植物种类中获得与zmpor1基因同源的其他基因。所有与本发明中所述的一个序列同源，并基本保持特异调控生育酚表达的能力的核苷酸序列构成本发明的一部分。
本发明提供dna构建物，它包括本发明的核苷酸序列，和dna非编码调控序列和/或目的多肽的编码序列。在具体的实施方案中，dna非编码调控序列可选择启动子(例如用ubiquitin启动子驱动表达)、增强子、终止子等非编码序列。在另一个具体的实施方案中，所述dna构建物包括具有其他具有编码生育酚合成相关酶的编码序列，以更好的促进玉米生育酚合成能力的调控。
本发明的核苷酸序列，或本发明提供的dna构建物，可以插入合适的载体。因此，本发明也涉及重组载体，本发明所提供的核苷酸序列及dna构建物可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选表达载体，其含有如上所述的核苷酸序列，或如上所述的dna构建物。
更优选的，所述载体可以选择为pzz-egfp表达质粒。
本发明也提供细胞，其含有本发明的核苷酸序列，或含所述核苷酸序列的dna构建物或上文提及的载体。可以转化本发明核苷酸序列的宿主细胞可以是原核细胞，优选真核细胞如植物组织细胞。转化植物组织细胞同样可用常规方法实现。关于基因转移到植物的综述包括载体，dna转移的方法等，例如，可见martalzquierdo，ed.piramide(1999)的书“ingenieriageneticaandtransferenciagenica”，具体到第九章，第283-316页，标题为“transferenciagenicaaplantas”。
本发明还涉及所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
由本发明所提供的核苷酸序列得到其对于的氨基酸序列，这对于本领域技术人员是容易的。
本发明也提供了一种转基因方法，包括：
1).构建如上所述的重组载体；
2).将步骤1)获得的重组载体直接导入植物细胞，或通过中间宿主细胞介导导入植物细胞；
3).再生出转基因植物；和
4).选择出转基因植物。
优选的，所述方法还包括：增殖步骤4)获得的植物以获得后代。
本发明的核苷酸序列可用于转化植物并获得转化的植物。在现有技术中广泛描述植物转化。众所周知，可采用多种系统例如质粒载体，脂质体，电穿孔，微量注射，扩散，基因枪，磷酸钙共沉淀，使用病毒载体等。在本发明中，采用质粒载体转化植物作为许多技术可能性的实施例被描述，其所有都组成本发明的部分。
优选的中间宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌，最优选的为农杆菌。
农杆菌可包含质粒(例如ti或ri质粒等常规质粒)和本发明提供的dna元件(即上述基因或dna序列)，所述质粒和元件在用农杆菌转染后被转移至植物，而dna元件被整合进植物细胞的基因组中。本发明的核苷酸序列尤其适用于玉米的植物细胞，但不排除在其它物种中也具有调节生育酚合成能力的作用。
本发明所提供的核苷酸序列在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明所提供的核苷酸序列在培育或鉴定高维生素e含量的玉米品种中的应用。
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本发明利用申请人实验室的超高效液相色谱仪的实验平台，具有广泛多样性和适应性的玉米材料，已构建的超高密度连锁图谱，以及丰富的剩余杂合材料，进行生育酚qtl的初定位和精细定位，解析玉米籽粒生育酚的遗传基础。
本发明提供的zmpor1基因的克隆方法为：
利用包含192个材料d340×k22f6群体，利用超高效液相色谱对各材料生育酚含量包括α、γ、δ三种组分进行测定，并结合该群体高密度连锁图谱用winqtlcatv2.5进行qtl定位，chromosome1定位到一个主效qtl命名为qvte1，可解释γ生育酚36％遗传变异，置信区间两端标记为put-163a-71443302-3341和pze-101183853,物理距离约2.4mb。从192个f6材料中筛选出qvte1候选区段为杂合，背景区段绝大部分为纯合的材料，自交，后代在目标区段分离产生两种纯合基因型与杂合基因型，形成一个近等基因系。即本课题利用剩余杂合材料构建了该qtl区间的近等基因系进行后续的精细定位，通过多次重组单株筛选和后代测验，最终将qtl置信区间定位至vn4和xinh两标记之间，约27kb范围内，其中只有一个候选基因zmpor1。
图1a为控制籽粒生育酚含量的qtl定位，图1b为qtl置信区间在染色体中的位置，图1c为四个重组家系qtl置信区间内的基因型和其生育酚含量差异的检测，图1d为候选区间内的基因。
实施例2
为验证zmpor1基因的功能，申请人构建了包含该基因的超表达载体：
用引物dmp455-f/r在玉米自交系b73中扩增zmpor1基因的全长序列：
dmp455-f:
ctagtatcccgggaaggcgcgccatggcgctccaggccgcgacgtcc,标下划线为acsⅰ
dmp455-r:
gaacgataagcttatggcgcgcctcacgccaagccgacgagcttctc,标下划线为acsⅰ
以20μl反应体系计，所述扩增的反应体系包括：
pcr扩增程序为：
⑤将②③④重复34个循环；
⑥72℃5min。
通过同源重组连接在超表达载体pzz-egfp(中国种子集团提供)上，用ubiquitin启动子驱动表达,将构建好的载体转入一个优良玉米自交系c01内。由于载体含有筛选基因bar，那么t0代转基因阳性植株通过除草剂抗性进行筛选(转基因过程至t0植株种子获得由中国种子集团完成)。两个转基因阳性植株520和541的t1代家系种植于华中农业大学，并通过bar试纸检测转基因阳性和阴性单株，同时取各单株叶片用55qp-1引物进行qpcr检测zmpor1基因的表达量。
55qp-1：5’acagttcgtgctatccgctc/caagaacgccgagtccttca
结果：两转基因家系中，转基因植株无明显农艺性状的改变，两种生育酚α、γ和总生育酚含量转基因阳性植株显著高于阴性材料。家系520和521中总生育酚在超表达材料中分别提高了约19％和14％(图2)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>华中农业大学
<120>调控玉米生育酚合成的核苷酸序列及其应用
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2747
<212>dna
<213>zeamaysl.
<400>1
atggcgctccaggccgcgacgtccttcctcccctcggccctctcggcgcgcaaggaggtg60
agcggcagctgtgcgttttccagcgaccattcgtgccttcgtcgccgttttttttttctc120
cgattcgtgctcagcttcagtgtctgagctgccaagttggtaagggactgtggagtgtct180
cggtagtaaattgtggttgcaatgttggtgctgtgcgttgcaggggtcgtcggtgaagga240
ctcggcgttcttgggtgtccatctcgcggacgatggcctcaagctggagaccgctgctct300
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tcattctgttgctgcgtgtcggttgttcgctgctgcttgctagctgcggctttcacataa420
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