一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂及其制备与应用的制作方法

文档序号:12248346阅读:895来源:国知局

本发明属于生物技术与环境保护领域,涉及生物发酵处理养殖排泄物污染及有机废弃物资源化利用、微生物降解抗生素与农药残留进行农业生态环境修复,具体涉及一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂及其制备与应用。



背景技术:

随着我国养殖业的规模化与工厂化,养殖过程中动物疾病多发,为防治动物疾病,各种化学药物、疫苗、抗生素等在动物养殖过程中被大量使用,导致药物直接进入动物体内,大部分药物通过粪便尿液排泄,在粪便尿液中形成高浓度的抗菌药物残留。

按照现有养殖业粪污处理技术,对畜禽粪污排泄物的处理方式分为两种:第一种是自然堆沤发酵形成堆肥,这种方式的缺陷是周期长、环境污染严重、肥效低、容易形成二次污染;第二种方式是将微生物发酵剂接种至排泄物中,将其发酵腐熟后制作有机肥。第二种处理方式虽然可通过腐熟除臭实现了有机质还田,但残留在有机物中的抗生素与其他化学药物未被分解,通过这种方式获得的有机肥施入农田后没有被降解的抗生素与化学药物残留物依然会破坏土壤中有益微生物菌落平衡,使得植物抗病虫害能力弱化,是农业生态环境中的潜在威胁与污染。

在现代农业种植中,为防治作物病虫害,提高产量,化肥农药普遍过量使用。很多农药喷施到农田后,只有5%左右的农药到达目标害虫,而95%的农药仍残留在水体、土壤和农业生态系统中,它会通过食物链的富集,最终进入到生物体内,严重影响人类的身体健康。要解决这些污染,最有效的办法就是利用微生物进行降解。但现有的农业复合微生物菌剂按其功效主要分为两种类型:一种是发酵处理畜禽粪污及有机物料,腐熟后肥料化利用;一种是作为功能性生物肥料或者生物农药使用。这两种类型的复合微生物菌剂,只作用于对有机物的发酵腐熟功能、微生物固氮、溶磷、解钾及部分生物防治功效,对畜禽粪污中的化学药物与抗生素残留及农业生态环境中的农药残留无法降解。按照现有的农业微生物菌剂的制备技术与产品功效,明显存在技术缺陷,即不能解决农业生态环境中农药与抗生素残留污染。在当前,化肥与农药长期的过量使用已经造成土壤有益微生物群落失衡、土壤板结、土壤持续供肥能力减弱、病虫害高发,农业生态环境承载能力已达到极限,因此,亟需生态修复与构建新的生态平衡。



技术实现要素:

本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种可降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂,该复合微生物菌剂是由微生物活性材料制备,具体是一种由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种微生物构成的复合微生物系;该复合微生物菌剂是依据复合微生物系中的微生物产生的不同功能性酶进行制备,具有降解抗生素与农药残留、有机物发酵腐熟、功能性肥料及修复环境等多种功能。

本发明的技术方案如下:一种降解农药与抗生素残留的复合微生物菌剂,是通过菌种筛选与培养条件优化、菌种活化、扩大培养、脱水干燥步骤,分别获得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌种的菌体干粉,将10种菌种的菌体干粉混合均匀,得到多菌体复合菌粉,即为复合微生物菌剂。

本发明的降解农药与抗生素残留的复合微生物菌剂,其制备方法具体包括如下步骤:

(1)将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌株分别进行菌株的筛选与培养条件优化,获得纯化菌株;将纯化菌株分别进行高密度培养、接种到摇瓶中活化培养、将活化培养好的菌种接种到发酵罐进行扩大培养;扩大培养结束后,将分别扩大培养得到的单菌种的发酵菌液经脱水干燥,获得上述10种菌种的菌体干粉;

(2)将10种菌株的菌体干粉均匀混合,得到多菌体复合菌粉;所述多菌体复合菌粉中,各菌种菌体干粉中活体菌数占复合菌粉活菌总数的重量百分比如下:枯草芽孢杆菌25-30%、地衣芽孢杆菌5-8%、黑曲霉8-10%、胶质芽孢杆菌12-15%、嗜热球菌2-6%、粪肠球菌10-13%、植物乳杆菌16-22%、多粘芽孢杆菌9-11%、巨大芽孢杆菌2-5%、荧光假单胞菌15-25%;所述多菌体复合菌粉中,有效活性菌含量为200-500亿个cfu/g,水分含量≦5%;在多菌体复合菌粉通入无菌空气包装,即得复合微生物菌剂。

优选的,由枯草芽孢杆菌菌株制备枯草芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)枯草芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.015-0.02g/L,补充成分:DDT 0.1-0.2g/L,pH 7.0-7.2,将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、DDT、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,然后倾注到灭菌平板上,平板上培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.2-7.5(温度为25℃时),得含有DDT的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通枯草芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有DDT的固体培养基平板上,置于35℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有DDT的液体培养基中,置于35℃-38℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在DDT浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,37-39℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解DDT的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-3%的接种量,转接到含有DDT的液体培养基中,35℃-37℃,220-250r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对DDT的降解率;

7)筛选得到对DDT降解率最高的枯草芽孢杆菌,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)枯草芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的枯草芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速为160-200r/min,在35-37℃温度下培养26h-32h,获得液体发酵种子;上述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-11.25g/L、牛肉膏1.25-1.3g/L、NaCl32.5-5.5g/L、葡萄糖22-25g/L,营养液pH7.5-7.8;

(3)枯草芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉18-20g/L、豆粉20-22g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 1.2-1.5g/L、MgSO4.7H2O 0.15-0.2g/L、碳酸钙6.5-8.0g/L、硫酸铵1.5-1.65g/L;发酵罐中温度控制在37-40℃,发酵pH7-8,搅拌速度为200-250r/min,发酵时间28-32h;当发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的枯草芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成枯草芽孢杆菌菌体干粉。

进一步的,所述扩大培养时最适合发酵条件如下:发酵罐温度38.5℃,pH7.0-7.5,发酵时间30h。

按照上述步骤获得的枯草芽孢杆菌,其特性与功能为:能产生多种抗菌素和生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶、木聚糖酶等十几种酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力;枯草芽孢杆菌的孢子体能够成功的转化为营养体并占据优势长期存活并继续繁殖发挥作用;能提高作物抗病、抗寒、抗旱能,增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率,促使土壤中的有机质分解成腐殖质,刺激作物生长;能固氮、解磷、解钾,提高肥料利用率;能产生类似细胞分裂素、植物生长激活素的物质,并分解重金属、农药的残留;降低成本、增加产量、提高收入。

优选的,由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株制备地衣芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)地衣芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:MnSO4 0.5-1.0g/L、蛋白胨8-10g/L、牛肉膏2-3g/L、NaCl 3-5g/L、葡萄糖1.5-2.5g/L、琼脂15-20g/L,补充成分:甲胺磷 0.15-0.25g/L,pH7.0-7.2,将MnSO4、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、甲胺磷、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.2(温度为25℃时),得含有甲胺磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通地衣芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有甲胺磷的固体培养基平板上,置于30℃-32℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有甲胺磷的液体培养基中,置于30℃-32℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在甲胺磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解甲胺磷的菌株;

6)将步骤5)能够降解甲胺磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到含有甲胺磷的液体培养基中,30℃-32℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对甲胺磷的降解率;

7)筛选得到对甲胺磷降解率最高的地衣芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)地衣芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的地衣芽孢杆菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速160r/min,在28-30℃温度下培养16h-20h,获得液体发酵种子;所述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-10.0g/L、牛肉膏4.5-5g/L、NaCl 4.8-5.0g/L、葡萄糖1.5g-2.0/L、营养液pH6.5-7.2;

(3)地衣芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为3-5%;扩大培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉22-25g/L、K2HPO40.08-0.20g/L、MgSO4.7H2O 0.005-0.01g/L、酵母粉0.1-0.15g/L;发酵温度25-40℃,发酵pH值6-8,搅拌速度为200 -300r/min,空气流量比为8-10%,发酵时间18-28h;当发酵罐中的地衣芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的地衣芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成地衣芽孢杆菌菌体干粉。

进一步的,所述扩大培养时最适合发酵条件如下:发酵温度29.5℃,pH值6.5-7.5,发酵时间25h。

按照上述步骤获得地衣芽孢杆菌,其特性与功能为:能产生多种活性酶,为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等,其生防作用的机制以竞争、拮抗和诱导植物抗性为主;产生的拮抗物质主要有抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白,对抗生素与残留农药具有一定降解功能;释放到农业环境中,可改善土壤微生态环境,使土壤中的优势种群稳定的保持优势地位;施入土壤后,迅速繁殖100倍成为优势菌,控制了根际的营养和其他资源,致使病源菌在相当程度上丧失生存空间和条件;使植物有关组织细胞壁增厚、纤维化、木质化程度提高,并在表皮层外形成角质双硅层,形成一道阻止病菌侵袭的屏障;可提高氮的供应,解磷、解钾,可有效提高土壤中磷和钾的吸收率。

优选的,由黑曲霉菌株制备黑曲霉菌体干粉的具体步骤如下:

(1)黑曲霉菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨 5-10g/L、葡萄糖 20-25g/L、硫酸镁 0.5-1.0g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾 1.0-2.0g/L、琼脂 15-20g/L,补充成分:草甘膦0.15-0.25g/L、百草枯0.2-0.5g/L、土霉素0.1-0.2g/L,将蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、酵母浸出粉、磷酸氢二钾、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL 灭菌蒸馏水的补充成分草甘膦、百草枯、土霉素,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在6.5-6.8(温度为25℃时),得含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通黑曲霉菌制成菌液,涂布于含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的各菌落,在含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有草甘膦、百草枯的液体培养基中,置于30℃-32℃120-150r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在草甘膦、百草枯浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解草甘膦、百草枯的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解草甘膦、百草枯的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1-3%的接种量,转接到有草甘膦、百草枯液体培养基中,25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对除草剂草甘膦、百草枯的降解率;

7)筛选得到对除草剂草甘膦、百草枯的降解率最高的黑曲霉菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)黑曲霉菌种活化:将步骤7)置于冰箱4℃储存的黑曲霉接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为蛋白胨5.0-5.5g/L、葡萄糖 10.0-15g/L、硫酸镁 0.5-0.8g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾1-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为100-160r/min,在28-35℃温度下培养25h-28h,获得液体发酵种子;

(3)黑曲霉扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;扩大培养基配方马铃薯35-40g/L、葡萄糖20-50g/L、磷酸氢二钾5-8g/L、硫酸镁 1-1.5g/L、pH值为7.0;发酵温度为35℃,搅拌速度100-180r/min,发酵时间25-28h,当发酵罐中的黑曲霉含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的黑曲霉菌液经干燥脱水制备成黑曲霉菌体干粉。

进一步的,较优的发酵时间为26h。

按照上述步骤获得的多黑曲霉,其特性与功能为:能分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等,具有裂解大分子有机物和难溶无机物能力,便于作物吸收利用,改善土壤结构,增强土壤肥力,提高作物产量的效果;在其他微生物共代谢作用下,对百草枯、草甘膦等除草剂及化学农药具有一定降解作用。

优选的,由胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)菌株制备胶质芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)胶质芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖2-3g/L、硫酸铵 0.15-0.25g/L、酵母膏 0.1-0.g/L、KCl 0.01-0.02g/L、MgSO4.7H2O 0.01-0.02g/L、NaH2PO4 0.01-0.02g/L、CaCO3 0.1-0.2g/L、二氧化硅1-2g/L、琼脂10-15g/L,补充成分:氯氰菊脂0.1-0.3g/L、CuSO4.5H2O0.02-0.025g/L,起始pH 7.0-7.2;将葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、KCl、MgSO4.7H2O、NaH2 PO4、CaCO3、二氧化硅、CuSO4.5H2O、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分氯氰菊脂,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.5(温度为25℃时),得有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通胶质芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在氯氰菊脂浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,32-35℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解氯氰菊脂的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解氯氰菊脂的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有氯氰菊脂液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对氯氰菊脂的降解率;

7)筛选得到对氯氰菊脂的降解率最高的胶质芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)胶质芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的胶质芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:淀粉15-20g/L、磷酸氢二钾g/L、硫酸铵2-3g/L、酵母膏 3.5-5.5g/L、蔗糖8.5-10g/L、硫酸镁4.5-5g/L、碳酸钙2.5-3g/L、二氧化硅6.5-8g/L、三氯化铁 0.05-lg/L,pH7.0-7.2,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养18-20h,获得液体发酵种子;

(3)胶质芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为4-6%;发酵培养基的成分为蔗糖2.5-6.5g/L、磷酸氢二钾3-5.5g/L、酵母膏3-6g/L、硫酸铵 2.5-5g/L、大豆蛋白胨 5-10g/L、硫酸镁3-6/g/L、pH7.2-7.5;扩大培养条件:发酵温度32℃,pH7.2,搅拌速度180r/min-220r/min,发酵时间24h;当发酵罐的胶质芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的胶质芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成胶质芽孢杆菌菌体干粉。

按照上述步骤获得的多胶质芽孢杆菌,其特性与功能为:能分解硅酸盐和铝硅酸盐及其他矿石中的含钾矿物,具有溶磷、释钾和固氮功能,同时能在生长繁殖过程中产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等有利于植物吸收和利用的物质;在土壤中繁殖后,分泌植物生长刺激素及多种酶,以增强作物对一些病害的抵抗力,能抑制其他病原菌的生长;菌体灰分中的钾含量在33%以上,菌体内的钾可在菌体死亡后游离出来,可被植物直接吸收利用;具有活化疏松土壤、分解各种中微量元素、硅钙硫硼钼锌等;产生赤霉素、吲哚乙酸等多种生理活性物质,使作物生长健壮,增强作物抗寒抗旱抗病和抗逆能力,提高作物产量并改善产品品质;在作物根部形成有益菌群,有效抑制土传病害发生;具有一定的吸附重金属能力及与其他微生物共代谢降解农药。

优选的,由嗜热链球菌菌株制备嗜热链球菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)嗜热链球菌菌株的筛选与培养条件优化按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏2-3g/L、蛋白胨2-3g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁15-20g/L、葡萄糖2-4g/L、吐温0.5ml-1.0ml/L、碳酸钙1.0-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.5-7.0,依照比例取适量水于锅中,加热,将牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;所述培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通嗜热链球菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上培养得到菌株;

6)将步骤5)得到各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按5%-8%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的嗜热链球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)嗜热链球菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的嗜热链球菌接种到活化培养摇瓶中活化培养,活化培养基配方为:胰蛋白胨1-3.0g/L、鱼蛋白胨2-3g/L、牛肉膏2-3g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、硫酸镁0.3-0. 5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.0g/L、乳糖1-1.5g/L,营养液pH 6.5-6.8,在35-40℃温度下培养24h-28h,搅拌速度为80-100r/min,获得液体发酵种子;

(3)嗜热链球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养基配方:葡萄糖1-3g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、磷酸氢二钾2-3g/L、玉米汁40-50g/L、醋酸钠1-2g/L、脱脂乳10-15g/L、pH为6.5-6.8;发酵温度38-45℃,搅拌速度为100-120r/min,发酵时间48-72h;当发酵罐中的嗜热链球菌含量达到≧109个/ml时,将发酵好的嗜热链球菌菌液经干燥脱水制备成嗜热链球菌菌体干粉。

按照上述步骤获得的多嗜热链球菌,其特性与功能为:能抑制污染环境中的有害菌病原菌,如艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌等;在发酵动物粪便过程中,能很快抑制或者消灭有害病原菌,缩短发酵过程,提高腐熟发酵效果;具有一些功能活性,生产胞外多糖、细菌素和维生素。

优选的,由粪肠球菌菌株制备粪肠球菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)粪肠球菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨10-15g/L、麦芽糖20-25g/L、酵母浸粉10-2g/L、甘油磷酸钠5-6g/L、氯化钠1-2g/L、乳糖0.015-0.020g/L、琼脂 15-20,pH值8.0-8.5,另按照顺序在培养基中分别加入补充成分:红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L;将蛋白胨、麦芽糖、酵母浸粉、甘油磷酸钠、氯化钠、乳糖、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL 甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通粪肠球菌制成菌液,涂布于含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的液体培养基中,置于33℃-35℃,160-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,35℃-38℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到pH8.5-9.0的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑素液体培养基中,在38℃-40℃,180-250r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率;

7)筛选得到对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率最高的粪肠球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)粪肠球菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的粪肠球菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:葡萄糖4-5g/L、酵母粉0.15-0.3g/L、蛋白胨0.5-1g/L、无水氯化钙0.002-0.006g/L、七水合硫酸镁0.02-0.05g/L、磷酸氢二钾0.1-0.15g/L、七水合硫酸锰0.002-0.005g/L、碳酸钙0.5-1g/L,营养液pH7.5-8.0,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养30h-35h,获得液体发酵种子;

(3)粪肠球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;培养基配方为胰蛋白胨10-15g/L、酵母粉10 -15g/L、葡萄糖10-15g/L、无水氯化钙0.04-0.06g/L、七水合硫酸镁0.019-0.025g/L、磷酸氢二钾0.04-0.06g/L、磷酸二氢钾0.04 -0.06g/L、磷酸氢钠0.4-0.6g/L、氯化钠0.08-0.1g/L、土豆汁50-80g/L、碳酸钙1-3g/L、乙酸钠10-15g/L、碳酸铵2-3g/L、乙酸铵1-2g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L,pH值为8.5-9;发酵温度35-37℃,搅拌速度180-220r/min,发酵时间20-32h,当发酵罐的粪肠球菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的粪肠球菌菌液经干燥脱水制备成粪肠球菌菌体干粉。

进一步的,所述发酵时间为25h。

按照上述步骤获得的多粪肠球菌,其特性与功能为:能在生长和代谢过程中产生有益的营养物质,如乳酸、氨基酸、维生素、酶及抑菌物质;粪肠球菌与芽孢杆菌及黑曲霉形成良好的互生共代谢作用,对青霉素类、红霉素、喹诺酮类、呋喃妥因、高浓度庆大霉素和高浓度链霉素及利福平具有降解能力;粪肠球菌为需氧及兼性厌氧菌,在发酵动物粪便过程中,能快速除臭,控制有害气体挥发。

优选的,由植物乳杆菌菌株制备植物乳杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)植物乳杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏1-2g/L、蛋白胨1-2g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁20 -30g/L、葡萄糖1-2g/L、吐温0.05ml-0.10ml/L、碳酸钙1.5-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.2-6.5,依照比例按照所需量取适量水于锅中,加热,称取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通植物乳杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到的各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,最后测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的植物乳杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)植物乳杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的植物乳杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-12g/L、牛肉膏10-15g/L、酵母膏5-6.5g/L、KH2PO4 2-3.5g/L、柠檬酸三钠2-2.5g/L、乙酸钠2-2.5g/L、葡萄糖20-28g/L、MgSO4.7H2O 0.58-0.60g/L、MnSO4.4H2O 0.25-0.3g/L,营养液pH 6.2-6.5,在35-40℃温度下培养24h-28h,静置培养,获得液体发酵种子;

(3)植物乳杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-8%;培养基配方为:蔗糖25-30g/L、酵母膏15-20g/L、KH2PO4 8-10g/L、柠檬酸三钠5-6g/L、乙酸钠3-5g/L、MgSO4.7H2O 0.8-1.2g/L、MnSO4.4H2O 0.5-0.8g/L,pH 6.2-6.5;发酵温度35-37℃,发酵时间24-28h,静置培养;发酵结束,将发酵好的植物乳杆菌菌液经干燥脱水制备成植物乳杆菌菌体干粉。

进一步的,所述发酵温度36℃,发酵时间25h。

按照上述步骤获得的多植物乳杆菌,其特性与功能为:能大量的产酸,使水中的pH值稳定不升高,而且其产出的酸性物质能降解重金属,植物乳杆菌具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点;能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质。

优选的,由多粘芽孢杆菌菌株制备多粘芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)多粘芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨10-15g/L、酵母提取物 5-8g/L、NaCl 3-5g/L、KH2PO4 0.1-0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.05-0.1g/L、MnSO4.7H2O 0.25-0.5g/L、琼脂15-20g/L,pH7.5-8.0;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、KH2PO4、NaCl、MgSO4.7H2O、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),得固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通多粘芽孢杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-40℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一优势菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,置于38℃-40℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,38-40℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃-40℃,180-200r/min振荡培养1-3天,最后测定各菌株所产生的如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的多粘芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)多粘芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到、置于冰箱4℃储存的多粘芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨8-10g/L、牛肉膏3-5g/L、氯化钠3-5g/L、葡萄糖10-12g/L、KH2PO4 0.2-0.3g/L、MgSO4.7H2O 0.2-0.35g/L、NaCl 0.2-0.3g/L、CaSO4.2H2O 0.2-0.25g/L、CaCO3 5.0-6.5g/L,营养液pH 7.0-8.0,摇瓶转速150-170r/min,在37-40℃温度下培养25h-30h,获得液体发酵种子;

(3)多粘芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量10-12%;扩大培养基配方为:玉米粉20-25g/L、豆粉8-12g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钠1.0-1.5g/L、Na2HP04 0.15-0.25g/L;发酵温度28-35℃,发酵pH7-8,搅拌速度为160-200r/min,发酵时间20-25h;当发酵罐的多粘芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的多粘芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成多粘芽孢杆菌菌体干粉。

进一步的,发酵温度32℃,pH 7.0-7.5,发酵时间22h。

按照上述步骤获得的多粘芽孢杆菌,其特性与功能为:能产生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质;抗菌谱广,对多种动植物病原细菌和真菌具有较强拮抗作用;发酵性状优异,能产生多组分的环肽类抗细菌活性物质,同时能产生抗真菌的活性物质,兼有生物农药和生物菌肥的作用;多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌,可用作微生物肥料,促进植物生长、提高作物产量;能有效防治植物细菌性和真菌性土传病害,多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性,且性质比较稳定,可用于多种植物病害的生物防治。

优选的,由巨大芽孢杆菌菌株制备巨大芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)巨大芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.025-0.035g/L,补充成分:对硫磷0.15-0.20g/L,pH7.5-8.0;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、对硫磷、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL 灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),得含有对硫磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通巨大芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有对硫磷的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在对硫磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解对硫磷的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解对硫磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有对硫磷液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对对硫磷的降解率;

7)筛选得到对硫磷的降解率最高的巨大芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)巨大芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的巨大芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-15g/L、牛肉膏3-5g/L、NaCl6.5-8.5g/L,葡萄糖2.5-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为190-210r/min,在37-40℃下培养22-28h,获得液体发酵种子;

(3)巨大芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-9%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉25-30g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钙5.5-6.5.0g/L、硫酸铵2.0-2.5g/L;发酵温度36-40℃,发酵pH值在7-8,发酵罐搅拌速度为200-250r/min,发酵时间25-32h;当发酵罐中的巨大芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的巨大芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成巨大芽孢杆菌菌体干粉。

进一步的,所述发酵温度39℃,pH 7.0-7.2,发酵时间为28h。

按照上述步骤获得的巨大芽孢杆菌,其特性与功能为:具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等一些特殊的性质;较其营养体细胞易保藏、复活率高;具有很好的降解土壤中有机磷的功效,对污染的水体具有修复作用,与自然界其他芽孢杆菌通过共生及共代谢,降解环境中残留的抗生素与农药;通过在植物根际定殖、分泌抗菌物质和营养竞争而拮抗病原菌。

优选的,由荧光假单胞菌菌株制备荧光假单胞菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)荧光假单胞菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨 10-12g/L、K2SO4 10-12g/L、MgCl2 1.4-1.6g/L、Fe2(SO4)3 0.5-1g/L、甘油 10mL、琼脂15~20g/L、蒸馏水1 L,补充成分:青霉素0.05-0.10g/L;将胰蛋白胨、K2SO4、MgCl2、Fe2(SO4)3、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.2(温度为25℃时),得含有青霉素的固体培养基,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通荧光假单胞菌制成菌液,涂布于含有青霉素的固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有青霉素的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有青霉素的液体培养基中,置于25℃-28℃,150-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在青霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,25-28℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解青霉素的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1%-3%的接种量,转接到含有青霉素液体培养基中,在25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对青霉素的降解率;

7)筛选得到对青霉素降解率最高的荧光假单胞菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)荧光假单胞菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的荧光假单胞菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:牛肉膏2.55-3.0g/L、蛋白胨1.65-2.2g/L、氯化钠0.18g-0.2g/L、酵母膏5.25-6.0g/L、Fe2(SO4)3 1-1.5g/L,培养液pH7.0-7.5,摇瓶转速为180r/min,在28.5-31℃温度下培养18-22h,获得液体发酵种子;

(3)荧光假单胞菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5.5~8.5%;所述扩大培养的培养基配方为:麦芽糖20-35g/L、玉米粉12-15g/L、酵母膏4.5-4.62g/L、硫酸铵5.2-5.8g/L、K2HPO4 0.55-0.85g/L、MgSO4.7H2O 0.035-0.055g/L、FeSO4.7H2O 1.095-1.20g/L、CaCl2 0.075-1.0g/L、NaCl 0.15-0.25g/L;发酵温度27℃~29℃,发酵罐搅拌速度140~180r/min,通气量8~12%,发酵时间24~48h;当发酵罐中的荧光假单胞菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的荧光假单胞菌菌液经干燥脱水制备成荧光假单胞菌菌体干粉。

按照上述步骤获得的荧光假单胞菌,其特性与功能为:对青霉素有很好的降解作用,具有分解纤维素、蛋白质和结合Fe3+的能力;能产生几丁质酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外壳聚糖酶等对物质进行降解,在给植物提供营养的同时还可减少植物病害的发生;能进行反硝化,可分解脂肪。

本发明技术方案所述复合微生物菌剂可作为有机污染物无害化处理剂,应用于对畜禽粪便进行堆肥发酵的无害化处理,还可以对农业废弃的各类有机物、工业加工有机原料、有机垃圾、有机污泥等有机污染物的无害化处理。

本发明技术方案所述复合微生物菌剂还可作为土壤改良剂等,应用于农业种植中改良土壤、生物防治、降低农业境污染、增加作物产量及提高作物产品品质。

本发明技术方案所述复合微生物菌剂还可作为农业环境修复剂,应用于降解农药、处理重金属污染。

本发明所述的普通枯草芽孢杆菌、普通地衣芽孢杆菌、普通黑曲霉、普通胶质芽孢杆菌、普通嗜热球菌、普通粪肠球菌、普通植物乳杆菌、普通多粘芽孢杆菌、普通巨大芽孢杆菌、普通荧光假单胞菌10种原始菌株是指未经过筛选、纯化的、可直接从中国科学院微生物研究所普通微生物中心等国家认可的机构获得。

本发明所述干燥脱水可以采用菌液干燥常规方法,优选可以采用喷雾干燥法,干燥后获得的菌体干粉水分的质量含量≤5%。

本发明技术方案所述复合微生物菌剂可用于降解农药与抗生素残留的技术原理如下:

(1)本发明是利用微生物之间的互生关系,建立微生物群落的生态平衡,利用微生物共代谢作用,在农业环境中补充复合微生物菌与环境原生微生物共生,建立新的微生物生态系统,由微生物系统里的细菌或真菌把一些天然条件下并不存在的由人工合成杀虫剂、杀菌剂、除草剂等化学物质降解;

(2)本发明是让微生物直接以农药或者杀菌剂作为生长基质,并在多种微生物群落的作用下,使农药与抗生素残留物的结构发生改变,从而引起其化学和物理性质发生改变,即通过将农药或抗生素残留物从大分子化合物降解为小分子化合物,最后成为H20和C02,将其完全分解成无机物,实现被完全降解,成为无毒的无机物;

(3)本发明是利用微生物酶促途径和非酶促途径降解农药。酶促反应即是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因,通过氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用直接作用于农药,或者,虽然不含降解该农药的酶系,但在农药胁迫下,微生物的基因发生重组或改变,产生新的降解酶系;非酶促反应是指微生物活动使环境的pH 发生变化而引起农药降解,或产生辅助因子或化学物质参与农药的转化。

本发明相对于现有技术的有益效果如下:

(1)采用本发明技术方案制备的复合微生物菌剂将畜禽粪便、农作物秸秆、有机垃圾等农业污染物进行堆肥腐熟无害化处理,可将残留在畜禽粪便、农作物秸秆、有机垃圾等农业污染物中的抗生素与药物降解,经无害化处理后的有机质及有益微生物可直接应用于被污染的环境,有效消除农药污染;

(2)采用本发明技术方案将复合微生物菌剂直接作为生物肥料或农业生态环境修复剂利用,可将复合微生物菌剂中的有益微生物释放并补充到环境中,与环境中原生的有益微生物共同形成稳定的群落体系,通过微生物的互生及共代谢,实现农业环境中农药残留的可降解;

(3)本发明与传统的物理、化学方法相比,具有投入低、治理效果明显、不产生副作用、可恢复和建设生态环境的特点,可提供一种低成本的环境友好型去除污染物的方法。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。

本发明所采用的菌种来源于中国科学院微生物研究所普通微生物中心(CGMCC),其编号为:枯草芽孢杆菌CGMCC1.1086、地衣芽孢杆菌CGMCC1.0265、黑曲霉CGMCC3.0316、胶质芽孢杆菌CGMCC1.0910、嗜热链球菌CGMCC1.1855、粪肠球菌CGMCC1.2135、植物乳杆菌CGMCC1.0557、多粘芽孢杆菌CGMCC1.0548、巨大芽孢杆菌CGMCC1.0217、荧光假单胞菌CGMCC1.1802。

实施例1 采用如下步骤制备本发明的复合微生物菌剂:

一、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌株分别进行菌株的筛选与培养条件优化,获得纯化菌株;将纯化菌株分别进行高密度培养、接种到摇瓶中活化培养、将活化培养好的菌种接种到发酵罐进行扩大培养;扩大培养结束后,将分别扩大培养得到的单菌种的发酵菌液经脱水干燥,获得上述10种菌种的菌体干粉;具体步骤如下:

1、按以下步骤由枯草芽孢杆菌菌株制备枯草芽孢杆菌菌体干粉:

(1)枯草芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.015-0.02g/L,补充成分:DDT 0.1-0.2g/L,pH 7.0-7.2,将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、DDT、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,然后倾注到灭菌平板上,平板上培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.2-7.5(温度为25℃时),得含有DDT的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通枯草芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有DDT的固体培养基平板上,置于35℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有DDT的液体培养基中,置于35℃-38℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在DDT浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,37-39℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解DDT的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-3%的接种量,转接到含有DDT的液体培养基中,35℃-37℃,220-250r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对DDT的降解率;

7)筛选得到对DDT降解率最高的枯草芽孢杆菌,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)枯草芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的枯草芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速为160-200r/min,在35-37℃温度下培养26h-32h,获得液体发酵种子;上述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-11.25g/L、牛肉膏1.25-1.3g/L、NaCl32.5-5.5g/L、葡萄糖22-25g/L,营养液pH7.5-7.8;

(3)枯草芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉18-20g/L、豆粉20-22g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 1.2-1.5g/L、MgSO4.7H2O 0.15-0.2g/L、碳酸钙6.5-8.0g/L、硫酸铵1.5-1.65g/L;发酵罐中温度控制在37-40℃,发酵pH7-8,搅拌速度为200-250r/min,发酵时间28-32h;当发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的枯草芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成枯草芽孢杆菌菌体干粉。

2、按以下步骤由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株制备地衣芽孢杆菌菌体干粉:

(1)地衣芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:MnSO4 0.5-1.0g/L、蛋白胨8-10g/L、牛肉膏2-3g/L、NaCl 3-5g/L、葡萄糖1.5-2.5g/L、琼脂15-20g/L,补充成分:甲胺磷 0.15-0.25g/L,pH7.0-7.2,将MnSO4、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、甲胺磷、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.2(温度为25℃时),得含有甲胺磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通地衣芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有甲胺磷的固体培养基平板上,置于30℃-32℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有甲胺磷的液体培养基中,置于30℃-32℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在甲胺磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解甲胺磷的菌株;

6)将步骤5)能够降解甲胺磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到含有甲胺磷的液体培养基中,30℃-32℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对甲胺磷的降解率;

7)筛选得到对甲胺磷降解率最高的地衣芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)地衣芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的地衣芽孢杆菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速160r/min,在28-30℃温度下培养16h-20h,获得液体发酵种子;所述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-10.0g/L、牛肉膏4.5-5g/L、NaCl 4.8-5.0g/L、葡萄糖1.5g-2.0/L、营养液pH6.5-7.2;

(3)地衣芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为3-5%;扩大培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉22-25g/L、K2HPO40.08-0.20g/L、MgSO4.7H2O 0.005-0.01g/L、酵母粉0.1-0.15g/L;发酵温度25-40℃,发酵pH值6-8,搅拌速度为200 -300r/min,空气流量比为8-10%,发酵时间18-28h;当发酵罐中的地衣芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的地衣芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成地衣芽孢杆菌菌体干粉。

3、按以下步骤由黑曲霉菌株制备黑曲霉菌体干粉:

(1)黑曲霉菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨 5-10g/L、葡萄糖 20-25g/L、硫酸镁 0.5-1.0g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾 1.0-2.0g/L、琼脂 15-20g/L,补充成分:草甘膦0.15-0.25g/L、百草枯0.2-0.5g/L、土霉素0.1-0.2g/L,将蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、酵母浸出粉、磷酸氢二钾、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL 灭菌蒸馏水的补充成分草甘膦、百草枯、土霉素,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在6.5-6.8(温度为25℃时),得含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通黑曲霉菌制成菌液,涂布于含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的各菌落,在含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有草甘膦、百草枯的液体培养基中,置于30℃-32℃120-150r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在草甘膦、百草枯浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解草甘膦、百草枯的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解草甘膦、百草枯的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1-3%的接种量,转接到有草甘膦、百草枯液体培养基中,25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对除草剂草甘膦、百草枯的降解率;

7)筛选得到对除草剂草甘膦、百草枯的降解率最高的黑曲霉菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)黑曲霉菌种活化:将步骤7)置于冰箱4℃储存的黑曲霉接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为蛋白胨5.0-5.5g/L、葡萄糖 10.0-15g/L、硫酸镁 0.5-0.8g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾1-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为100-160r/min,在28-35℃温度下培养25h-28h,获得液体发酵种子;

(3)黑曲霉扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;扩大培养基配方马铃薯35-40g/L、葡萄糖20-50g/L、磷酸氢二钾5-8g/L、硫酸镁 1-1.5g/L、pH值为7.0;发酵温度为35℃,搅拌速度100-180r/min,发酵时间25-28h,当发酵罐中的黑曲霉含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的黑曲霉菌液经干燥脱水制备成黑曲霉菌体干粉。

4、按以下步骤由胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)菌株制备胶质芽孢杆菌菌体干粉:

(1)胶质芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖2-3g/L、硫酸铵 0.15-0.25g/L、酵母膏 0.1-0.g/L、KCl0.01-0.02g/L、MgSO4.7H2O 0.01-0.02g/L、NaH2PO4 0.01-0.02g/L、CaCO30.1-0.2g/L、二氧化硅1-2g/L、琼脂10-15g/L,补充成分:氯氰菊脂0.1-0.3g/L、CuSO4.5H2O 0.02-0.025g/L,起始pH 7.0-7.2;将葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、KCl、MgSO4.7H2O、NaH2PO4、CaCO3、二氧化硅、CuSO4.5H2O、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分氯氰菊脂,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.5(温度为25℃时),得有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通胶质芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在氯氰菊脂浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,32-35℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解氯氰菊脂的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解氯氰菊脂的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有氯氰菊脂液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对氯氰菊脂的降解率;

7)筛选得到对氯氰菊脂的降解率最高的胶质芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)胶质芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的胶质芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:淀粉15-20g/L、磷酸氢二钾g/L、硫酸铵2-3g/L、酵母膏 3.5-5.5g/L、蔗糖8.5-10g/L、硫酸镁4.5-5g/L、碳酸钙2.5-3g/L、二氧化硅6.5-8g/L、三氯化铁 0.05-lg/L,pH7.0-7.2,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养18-20h,获得液体发酵种子;

(3)胶质芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为4-6%;发酵培养基的成分为蔗糖2.5-6.5g/L、磷酸氢二钾3-5.5g/L、酵母膏3-6g/L、硫酸铵 2.5-5g/L、大豆蛋白胨 5-10g/L、硫酸镁3-6/g/L、pH7.2-7.5;扩大培养条件:发酵温度32℃,pH7.2,搅拌速度180r/min-220r/min,发酵时间24h;当发酵罐的胶质芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的胶质芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成胶质芽孢杆菌菌体干粉。

5、按以下步骤由嗜热链球菌菌株制备嗜热链球菌菌体干粉:

(1)嗜热链球菌菌株的筛选与培养条件优化按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏2-3g/L、蛋白胨2-3g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁15-20g/L、葡萄糖2-4g/L、吐温0.5ml-1.0ml/L、碳酸钙1.0-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.5-7.0,依照比例取适量水于锅中,加热,将牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;所述培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通嗜热链球菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上培养得到菌株;

6)将步骤5)得到各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按5%-8%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的嗜热链球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)嗜热链球菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的嗜热链球菌接种到活化培养摇瓶中活化培养,活化培养基配方为:胰蛋白胨1-3.0g/L、鱼蛋白胨2-3g/L、牛肉膏2-3g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、硫酸镁0.3-0. 5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.0g/L、乳糖1-1.5g/L,营养液pH 6.5-6.8,在35-40℃温度下培养24h-28h,搅拌速度为80-100r/min,获得液体发酵种子;

(3)嗜热链球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养基配方:葡萄糖1-3g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、磷酸氢二钾2-3g/L、玉米汁40-50g/L、醋酸钠1-2g/L、脱脂乳10-15g/L、pH为6.5-6.8;发酵温度38-45℃,搅拌速度为100-120r/min,发酵时间48-72h;当发酵罐中的嗜热链球菌含量达到≧109个/ml时,将发酵好的嗜热链球菌菌液经干燥脱水制备成嗜热链球菌菌体干粉。

6、按以下步骤由粪肠球菌菌株制备粪肠球菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)粪肠球菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨10-15g/L、麦芽糖20-25g/L、酵母浸粉10-2g/L、甘油磷酸钠5-6g/L、氯化钠1-2g/L、乳糖0.015-0.020g/L、琼脂 15-20,pH值8.0-8.5,另按照顺序在培养基中分别加入补充成分:红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L;将蛋白胨、麦芽糖、酵母浸粉、甘油磷酸钠、氯化钠、乳糖、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL 甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通粪肠球菌制成菌液,涂布于含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的液体培养基中,置于33℃-35℃,160-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,35℃-38℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到pH8.5-9.0的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑素液体培养基中,在38℃-40℃,180-250r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率;

7)筛选得到对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率最高的粪肠球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)粪肠球菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的粪肠球菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:葡萄糖4-5g/L、酵母粉0.15-0.3g/L、蛋白胨0.5-1g/L、无水氯化钙0.002-0.006g/L、七水合硫酸镁0.02-0.05g/L、磷酸氢二钾0.1-0.15g/L、七水合硫酸锰0.002-0.005g/L、碳酸钙0.5-1g/L,营养液pH7.5-8.0,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养30h-35h,获得液体发酵种子;

(3)粪肠球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;培养基配方为胰蛋白胨10-15g/L、酵母粉10 -15g/L、葡萄糖10-15g/L、无水氯化钙0.04-0.06g/L、七水合硫酸镁0.019-0.025g/L、磷酸氢二钾0.04-0.06g/L、磷酸二氢钾0.04 -0.06g/L、磷酸氢钠0.4-0.6g/L、氯化钠0.08-0.1g/L、土豆汁50-80g/L、碳酸钙1-3g/L、乙酸钠10-15g/L、碳酸铵2-3g/L、乙酸铵1-2g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L,pH值为8.5-9;发酵温度35-37℃,搅拌速度180-220r/min,发酵时间20-32h,当发酵罐的粪肠球菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的粪肠球菌菌液经干燥脱水制备成粪肠球菌菌体干粉。

7、按以下步骤由植物乳杆菌菌株制备植物乳杆菌菌体干粉:

(1)植物乳杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏1-2g/L、蛋白胨1-2g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁20 -30g/L、葡萄糖1-2g/L、吐温0.05ml-0.10ml /L、碳酸钙1.5-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.2-6.5,依照比例按照所需量取适量水于锅中,加热,称取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通植物乳杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到的各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,最后测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的植物乳杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)植物乳杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的植物乳杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-12g/L、牛肉膏10-15g/L、酵母膏5-6.5g/L、KH2PO4 2-3.5g/L、柠檬酸三钠2-2.5g/L、乙酸钠2-2.5g/L、葡萄糖20-28g/L、MgSO4.7H2O 0.58-0.60g/L、MnSO4.4H2O 0.25-0.3g/L,营养液pH 6.2-6.5,在35-40℃温度下培养24h-28h,静置培养,获得液体发酵种子;

(3)植物乳杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-8%;培养基配方为:蔗糖25-30g/L、酵母膏15-20g/L、KH2PO4 8-10g/L、柠檬酸三钠5-6g/L、乙酸钠3-5g/L、MgSO4.7H2O 0.8-1.2g/L、MnSO4.4H2O 0.5-0.8g/L,pH 6.2-6.5;发酵温度35-37℃,发酵时间24-28h,静置培养;发酵结束,将发酵好的植物乳杆菌菌液经干燥脱水制备成植物乳杆菌菌体干粉。

8、按以下步骤由多粘芽孢杆菌菌株制备多粘芽孢杆菌菌体干粉:

(1)多粘芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨10-15g/L、酵母提取物 5-8g/L、NaCl3-5g/L、KH2PO4 0.1-0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.05-0.1g/L、MnSO4.7H2O 0.25-0.5g/L、琼脂15-20g/L,pH7.5-8.0;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、KH2PO4、NaCl、MgSO4.7H2O、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),得固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通多粘芽孢杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-40℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一优势菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,置于38℃-40℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,38-40℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃-40℃,180-200r/min振荡培养1-3天,最后测定各菌株所产生的如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的多粘芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)多粘芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到、置于冰箱4℃储存的多粘芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨8-10g/L、牛肉膏3-5g/L、氯化钠3-5g/L、葡萄糖10-12g/L、KH2PO4 0.2-0.3g/L、MgSO4.7H2O 0.2-0.35g/L、NaCl 0.2-0.3g/L、CaSO4.2H2O 0.2-0.25g/L、CaCO3 5.0-6.5g/L,营养液pH 7.0-8.0,摇瓶转速150-170r/min,在37-40℃温度下培养25h-30h,获得液体发酵种子;

(3)多粘芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量10-12%;扩大培养基配方为:玉米粉20-25g/L、豆粉8-12g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钠1.0-1.5g/L、Na2HP04 0.15-0.25g/L;发酵温度28-35℃,发酵pH7-8,搅拌速度为160-200r/min,发酵时间20-25h;当发酵罐的多粘芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的多粘芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成多粘芽孢杆菌菌体干粉。

9、按以下步骤由巨大芽孢杆菌菌株制备巨大芽孢杆菌菌体干粉:

(1)巨大芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.025-0.035g/L,补充成分:对硫磷0.15-0.20g/L,pH7.5-8.0;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、对硫磷、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL 灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.5-8.0(温度为25℃时),得含有对硫磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通巨大芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有对硫磷的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在对硫磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解对硫磷的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解对硫磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有对硫磷液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对对硫磷的降解率;

7)筛选得到对硫磷的降解率最高的巨大芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)巨大芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的巨大芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-15g/L、牛肉膏3-5g/L、NaCl6.5-8.5g/L,葡萄糖2.5-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为190-210r/min,在37-40℃下培养22-28h,获得液体发酵种子;

(3)巨大芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-9%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉25-30g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钙5.5-6.5.0g/L、硫酸铵2.0-2.5g/L;发酵温度36-40℃,发酵pH值在7-8,发酵罐搅拌速度为200-250r/min,发酵时间25-32h;当发酵罐中的巨大芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的巨大芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成巨大芽孢杆菌菌体干粉。

10、按以下步骤由荧光假单胞菌菌株制备荧光假单胞菌菌体干粉:

(1)荧光假单胞菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨 10-12g/L、K2SO4 10-12g/L、MgCl2 1.4-1.6g/L、Fe2(SO4)3 0.5-1g/L、甘油 10mL、琼脂15~20g/L、蒸馏水1L,补充成分:青霉素0.05-0.10g/L;将胰蛋白胨、K2SO4、MgCl2、Fe2(SO4)3、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在7.0-7.2(温度为25℃时),得含有青霉素的固体培养基,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通荧光假单胞菌制成菌液,涂布于含有青霉素的固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有青霉素的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有青霉素的液体培养基中,置于25℃-28℃,150-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在青霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,25-28℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解青霉素的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1%-3%的接种量,转接到含有青霉素液体培养基中,在25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对青霉素的降解率;

7)筛选得到对青霉素降解率最高的荧光假单胞菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)荧光假单胞菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的荧光假单胞菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:牛肉膏2.55-3.0g/L、蛋白胨1.65-2.2g/L、氯化钠0.18g-0.2g/L、酵母膏5.25-6.0g/L、Fe2(SO4)3 1-1.5g/L,培养液pH7.0-7.5,摇瓶转速为180r/min,在28.5-31℃温度下培养18-22h,获得液体发酵种子;

(3)荧光假单胞菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5.5~8.5%;所述扩大培养的培养基配方为:麦芽糖20-35g/L、玉米粉12-15g/L、酵母膏4.5-4.62g/L、硫酸铵5.2-5.8g/L、K2HPO4 0.55-0.85g/L、MgSO4.7H2O 0.035-0.055g/L、FeSO4.7H2O 1.095-1.20g/L、CaCl2 0.075-1.0g/L、NaCl 0.15-0.25g/L;发酵温度27℃~29℃,发酵罐搅拌速度140~180r/min,通气量8~12%,发酵时间24~48h;当发酵罐中的荧光假单胞菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的荧光假单胞菌菌液经干燥脱水制备成荧光假单胞菌菌体干粉。

二、将步骤一制备得到的10种纯化菌株的菌体干粉均匀混合,得到多菌体复合菌粉;所述多菌体复合菌粉中,各菌种菌体干粉中活体菌数占复合菌粉活菌总数的重量百分比如下:枯草芽孢杆菌10-15%、黑曲霉10-15%、胶质芽孢杆菌10-15%、粪肠球菌10-15%、地衣芽孢杆菌8-12%、巨大芽孢杆菌8-12%、荧光假单胞菌8-12%、植物乳杆菌5-8%、多粘芽孢杆菌5-8%、嗜热链球菌6-8%。所述多菌体复合菌粉中,有效活性菌含量为200-500亿个cfu/g,水分含量≦5%;在多菌体复合菌粉通入无菌空气包装,即得复合微生物菌剂。

实施例2按各菌种菌体干粉中活体菌数占复合菌粉活菌总数的重量百分比:枯草芽孢杆菌15%、黑曲霉15%、胶质芽孢杆菌15%、粪肠球菌15%、地衣芽孢杆菌8%、巨大芽孢杆菌8%、荧光假单胞菌8%、植物乳杆菌5%、多粘芽孢杆菌5%、嗜热链球菌6%。采用实施例步骤一制备得到的10种纯化菌株的菌体干粉混合均匀,得多菌体复合菌粉,通入无菌空气,包装制得复合微生物菌剂。

实施例3按各菌种菌体干粉中活体菌数占复合菌粉活菌总数的重量百分比::枯草芽孢杆菌10%、黑曲霉10%、胶质芽孢杆菌10%、粪肠球菌10%、地衣芽孢杆菌12%、巨大芽孢杆菌12%、荧光假单胞菌12%、植物乳杆菌8%、多粘芽孢杆菌8%、嗜热链球菌8%。采用实施例步骤一制备得到的10种纯化菌株的菌体干粉混合均匀,得多菌体复合菌粉,通入无菌空气,包装制得复合微生物菌剂。

实施例4按各菌种菌体干粉中活体菌数占复合菌粉活菌总数的重量百分比:枯草芽孢杆菌12%、黑曲霉12%、胶质芽孢杆菌12%、粪肠球菌12%、地衣芽孢杆菌10%、巨大芽孢杆菌10%、荧光假单胞菌10%、植物乳杆菌7%、多粘芽孢杆菌7%、嗜热链球菌8%。采用实施例步骤一制备得到的10种纯化菌株的菌体干粉混合均匀,得多菌体复合菌粉,通入无菌空气,包装制得复合微生物菌剂。

本发明的复合微生物菌剂是一种多功能的产品,现对其应用举例说明如下。

实施例5 本发明的复合微生物菌剂可应用于对畜禽粪便进行堆肥发酵无害化处理,解决抗生素与药物残留的问题。此种应用方式不局限于对养殖业畜禽粪便的无害化处理,也适用于农业废弃的各类有机物、工业加工有机原料、有机垃圾、有机污泥等的无害化处理。具体应用实例如下。

在福建、广东、河南、重庆、四川、山东养殖畜禽养殖企业区,按照养殖规模在畜1000-50000万头(禽5000-100000万羽)的养殖场抽取100个畜禽粪样(其中个猪粪样65个、35个鸡粪样),应用常规化学分析方法测定了其中的养分、抗生素、抗菌素及重金属含量,同时应用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法对其中的残留抗生素进行了专项测定。

结果表明:养殖场畜禽粪中含有丰富的有机质和总氮、总磷、总钾等养分;Cr、Ni、Cd、Hg、Pb等重金属元素含量较低,但是Cu、Zn含量普遍较高,As、Cu和Zn含量分别为0.654-81.92 mg/kg、18.50-631.98 mg/kg和85.06-289.92 mg/kg。与我国农用污泥污染物控制的国家标准(GB 4284-1984)相比,畜禽粪中As、Cu和Zn的超标率十分严重。65个猪粪样中,其中:35个样本中土霉素、四环素、金霉素的平均含量分别为11.13、7.31、5.52 mg/kg;20个样本中土霉素、四环素、金霉素的平均含量分别为19.12、10.35、70.55 mg/kg;10个样本中土霉素、四环素、金霉素的平均含量分别为36.03、49.34、191.12 mg/kg。35个鸡粪样中,土霉素、四环素、金霉素的平均含量分别为6.91、8.52、9.47 mg/kg,喹诺酮类和磺胺二甲嘧啶的含量分别为20.93-66.62 mg/kg。在畜禽粪便中,其他如青霉素、链霉素等检出率为100%、65.3%。因此,养殖场畜禽粪中有害成分对农田施用后存在潜在的危害性,使用前应对畜禽粪进行无害化处理。

本发明复合微生物菌剂能够强烈分解蛋白质、纤维素、半纤维素、木质素等,并将嗜热、耐热细菌、真菌、酵母菌菌株及相关分解酶复合而成,其有效活菌数含量高,降解能力强,同时能够达到升温、除臭、消除病虫害、杂草种子和提高养分的效果。在适宜的条件下,能迅速将堆料中的碳、氮、磷、钾、硫等分解矿化,降解形成简单有机物,从而进一步分解为作物可吸收的营养成分。

将本发明的复合微生物菌剂应用于粪便或污泥或有机垃圾或工业有机废料的无害化处理,可按如下进行:

(1)按照如下质量配比准备待处理物料:主料为畜禽粪便或污泥或有机垃圾或工业有机废料70%-80%,辅料为干燥的米糠、锯末、饼粕粉、秸杆粉等20%-30%;

(2)按照待处理物料重量的百分比计,复合微生物菌剂在待处理物料的接种量为0.02%-0.1%;

(3)物料混合与控制调节:将主料、辅料及复合微生物菌剂混合,水分控制在50%-60%,手抓物料成团无水滴,松手即散为标准;按照万分之一到万分之十左右的尿素调节碳氮比到25-30:1(调节碳氮比的氮,也可以用其他植物可利用的氮源替代);建堆高度为1.2-1.6米以内,宽度与长度不限;建堆最佳体积在100-1000立方米;一般情况,建堆时环境温度为常温;冬季建堆环境温度在0℃以上,最佳环境温度为15℃以上,2-3天即可消除臭味。建堆后堆体温度达到55℃-68℃且持续在48小时以上时,翻堆一次;在55℃-68℃度高温可持续10天以上,杀灭发酵物中的病菌、虫卵、杂草种子,夏季一周左右完全腐熟,冬季15天左右完全腐熟;

(4)抗生素与药物残留降解:在上述物料腐熟后,采用厌氧与微需氧的控制方式,进行堆体物质后熟期;在7-10天内不翻动堆体,中高温菌停止生长,进入休眠期;在后期由低温厌氧菌与兼厌氧菌控制堆体温度在35℃左右,让堆体的各种真菌、细菌等建立小型微生物群落体系,以有机质及堆体其他营养源为共同主要基础能量源,利用良好的互生与共代谢关系,降解抗生素与药物残留。10天以后-15后,堆体完成后熟,抗生素与药物残留基本全部降解,不同抗生素与化学药物降解率达到99.5-100%。

采用上述的步骤,腐熟无害化的有机物质具有如下优点,并可进一步利用:

(1)腐熟无害化的有机物质可直接作为无毒、无害、无污染的高品质有机肥料使用,该物质养分均衡,总养分损失少,腐殖质含量高,氮磷钾含量增加;

(2)发酵过程中繁殖大量功能菌并产生多种特效代谢产物,从而刺激作物生长发育,提高作物抗病、抗旱、抗寒能力,功能细菌进入土壤后,可固氮、解磷、解钾,增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率;

(3)物料经过矿质化,养分由无效态和缓效态变为有效态和速效态;经过腐殖化,产生大量腐殖酸,刺激作物生长。

实施例6 本发明复合微生物菌剂在农业种植中改良土壤、进行生物防治、降低农业环境污染、增加作物产量及提高作物产品品质的应用说明如下。

1、本发明的多功能复合微生物菌剂由10种细菌或真菌组成,其单个菌株的功能与主要特性如下。

(1)荧光假单胞菌:其特性与功能为对青霉素有很好的降解作用,具有分解纤维素、蛋白质和结合Fe3+的能力;荧光假单胞菌还能产生几丁质酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外壳聚糖酶等对物质进行降解,在给植物提供营养的同时还可减少植物病害的发生;能进行反硝化,可分解脂肪。

(2)地衣芽孢杆菌:其特性与功能为能产生多种活性酶,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等其生防作用的机制以竞争、拮抗和诱导植物抗性为主,地衣芽孢杆菌的生理特征丰富多样,分布广泛,极易分离培养,很容易在土壤和植物体表、根际形成优势微生物种群,从而有效地抑制具有相同营养和空间位点病原菌的生长和繁殖。地衣芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白,对抗生素与残留农药具有一定降解功能。同时,地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性,不仅能抑制或杀害病原菌,而且可以降解土壤中的大分子有机物,活化土壤养分,有助于植物营养的吸收,提高作物产量,改善品质。释放到农业环境中,可改善土壤微生态环境,使土壤中的优势种群稳定的保持优势地位。地衣芽孢杆菌施入土壤后,迅速繁殖100倍成为优势菌,控制了根际的营养和其他资源,致使病源菌在相当程度上丧失生存空间和条件;使植物有关组织细胞壁增厚、纤维化、木质化程度提高,并在表皮层外形成角质双硅层,形成一道阻止病菌侵袭的屏障。同时可提高氮的供应,解磷、解钾,可有效提高土壤中磷和钾的吸收率。

(3)枯草芽孢杆菌:其特性与功能为能产生多种抗菌素和生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶、木聚糖酶等十几种酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌的孢子体能够成功的转化为营养体并占据优势长期存活并继续繁殖发挥作用。能提高作物抗病、抗寒、抗旱能力;增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率;促使土壤中的有机质分解成腐殖质,刺激作物生长。能固氮、解磷、解钾,提高肥料利用率。可改良土壤结构,促使土壤中的有机质分解成腐殖酸,促进作物生长、成熟、降低成本、增加产量、提高收入。产生类似细胞分裂素、植物生长激活素的物质,并分解重金属、农药的残留。

(4)巨大芽孢杆菌其特性与功能为主要通过在植物根际定殖、分泌抗菌物质和营养竞争而拮抗病原菌。巨大芽孢是细菌在其生长后期在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体。芽孢具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等一些特殊的性质。芽孢较其营养体细胞易保藏、复活率高。巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌具有很好的降解土壤中有机磷的功效,对污染的水体具有修复作用,与自然界其他芽孢杆菌通过共生及共代谢,降解环境中残留的抗生素与农药。

(5)多粘芽孢杆菌:其特性与功能为能产生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质。抗菌谱广,对多种动植物病原细菌和真菌具有较强拮抗作用,发酵性状优异,能产生多组分的环肽类抗细菌活性物质,同时能产生抗真菌的活性物质,兼有生物农药和生物菌肥的作用,已广泛应用于农业、工矿业及废水处理等领域。多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌,可用作微生物肥料,促进植物生长、提高作物产量。能有效防治植物细菌性和真菌性土传病害,多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性,且性质比较稳定,可用于多种植物病害的生物防治。

(6)植物乳杆菌:其特性与功能为能大量的产酸,使水中的PH值稳定不升高,而且其产出的酸性物质能降解重金属,植物乳杆菌具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点。植物乳杆菌能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质。

(7)粪肠球菌:其特性与功能为能在生长和代谢过程中产生有益的营养物质,如乳酸、氨基酸、维生素、酶及抑菌物质。粪肠球菌与芽孢杆菌及黑曲霉形成良好的互生共代谢作用,对青霉素类、红霉素、喹诺酮类、呋喃妥因、高浓度庆大霉素和高浓度链霉素及利福平具有良好的降解能力。粪肠球菌为需氧及兼性厌氧菌,在发酵动物粪便过程中,能快速除臭,控制有害气体挥发。

(8)黑曲霉:其特性与功能为黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能。黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物能力,便于作物吸收利用,改善土壤结构,增强土壤肥力,提高作物产量的效果。在其他微生物共代谢作用下,对百草枯、草甘膦等除草剂及化学农药具有一定降解作用。

(9)嗜热链球菌:特性与功能为能抑制污染环境中的有害菌病原菌,如艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌等。在发酵动物粪便过程中,能很快抑制或者消灭有害病原菌,缩短发酵过程,提高腐熟发酵效果。同时,广泛用于生产一些重要的发酵乳制品。嗜热链球菌具有一些功能活性,比如生产胞外多糖、细菌素和维生素。

(10)胶质芽孢杆菌:其特性与功能为分解硅酸盐和铝硅酸盐及其他矿石中的含钾矿物,具有溶磷、释钾和固氮功能,同时能在生长繁殖过程中产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等有利于植物吸收和利用的物质。在土壤中繁殖后,分泌植物生长刺激素及多种酶,以增强作物对一些病害的抵抗力,能抑制其他病原菌的生长。菌体灰分中的钾含量在33%以上,菌体内的钾可在菌体死亡后游离出来,可被植物直接吸收利用。具有活化疏松土壤、分解各种中微量元素、硅钙硫硼钼锌等。产生赤霉素、吲哚乙酸等多种生理活性物质,使作物生长健壮,增强作物抗寒抗旱抗病和抗逆能力,提高作物产量并改善产品品质。在作物根部形成有益菌群,有效抑制土传病害发生。具有一定的吸附重金属能力及与其他微生物共代谢降解农药。

2、上述10种微生物单菌体经复合后形成复合微生物菌剂,按照微生物的互生、共代谢、协同作用在农业中使用,具有功能性肥料、生物防治病虫害、修复农业生态环境的功效与作用,具体应用如下:

(1)上述复合微生物菌剂是多种有益微生物的复合菌群,可以改良土壤,发展绿色农业、畜牧养殖、环境治理和资源再生,是一项新兴的生物环保产品,符合经济发展需要;本发明的微生物复合菌经试验田实验,其结果显示了比已报道的同类产品的增产效果更明显,抗病虫害更强;不用或少用化肥和农药就能提高产量、消灭杂草和病虫害,很好地促进了绿色有机农业的发展和自然生态系统的修复;

(2)复合微生物菌剂提供的是能固氮、解磷、解钾等有益微生物,这些活的微生物能在植物根际生长、繁殖,可以带来几方面的好处:一是通过这些有益微生物的生命活动,固定转化空气中不能利用的分子态氮为化合态氮,解析土壤中不能利用的化合态磷、钾为可利用态的磷、钾,并可解析土壤中的10多种中、微量元素;二是通过这些有益微生物的生命活动,分泌生长素、细胞分裂素、赤霉素、吲哚酸等植物激素,促进作物生长,调控作物代谢,按遗传密码建造优质产品;三是通过有益微生物在根际大量繁殖,产生大量粘多糖,与植物分泌的粘液及矿物胶体、有机胶体相结合,形成土壤团粒结构,增进土壤蓄肥、保水能力。四是能促进农作物生长,改良土壤结构,改善作物产品品质和提高作物的防病、抗病能力,从而实现增产增收;四是通过微生物互生与共代谢,解决抗生素与农药残留污染。

3、采用本发明的复合微生物菌剂应用于农业种植中改良土壤、进行生物防治、降低农业环境污染、增加作物产量及提高作物产品品质的应用时,使用方法用量与范围如下:本发明的多功能微生物菌复合菌剂适用于全部农作物种植及自然环境污染治理,在农作物整地时,与有机肥料一同作为基肥使用,每亩农作物使用1-2公斤;或者用载体稀释100倍后混匀后直接施入土壤,可与其他化学肥料混合使用;在作为追肥使用时,直接稀释至500-800倍液进行喷灌施肥,每亩农作物用量为300-500克。

注意事项:不能与杀菌剂、农药混合使用。作为功能性肥料使用时,一般不能单独施用,可化肥、有机肥配合施用,才能充分发挥多功能微生物菌复合菌剂的增产效能。而且要求一定的环境条件和栽培措施,以保证微生物生长繁殖所需要的环境条件,使肥料充分发挥作用。

实施例7 本发明的复合微生物菌剂作为农业环境修复剂,在降解农药与处理重金属污染使用的方法与应用说明如下。

本发明的复合微生物菌剂降解农药与抗生素残留的技术原理,一是利用微生物之间的互生关系,建立微生物群落的生态平衡,利用微生物共代谢作用,在农业环境中补充复合微生物菌与环境原生微生物共生,建立新的微生物生态系统,由微生物系统里的细菌或真菌把一些天然条件下并不存在的由人工合成杀虫剂、杀菌剂、除草剂等化学物质降解;二是让微生物直接以农药或者杀菌剂作为生长基质,并在多种微生物群落的作用下,使农药与抗生素残留物的结构发生改变,从而引起其化学和物理性质发生改变,即通过将农药或抗生素残留物从大分子化合物降解为小分子化合物,最后成为H20和C02将其完全分解成无机物,实现被完全降解,成为无毒的无机物;三是利用微生物酶促途径和非酶促途径降解农药,。酶促反应即是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因,通过氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用直接作用于农药,或者,虽然不含降解该农药的酶系,但在农药胁迫下,微生物的基因发生重组或改变,产生新的降解酶系,非酶促反应是指微生物活动使环境的pH 发生变化而引起农药降解,或产生辅助因子或化学物质参与农药的转化。

具体使用方法与应用一:第一步,对需要修复的农业环境进行污染物成分检测,测定土壤的碳、氮、磷、钾含量,确定需要的碳源量及比例,碳源以有机质为标准;第二步,需要修复的农业土壤C/N变幅在6.2~20.9之间的,将C/N调节到25-30;一般原则每亩使用300-500公斤用无害化处理的有机物作为碳源,按照有机物重量混合加入10%有机氮、5%有机钾、5%有机磷、微量元素0.1%;第三步,按照每亩施用500-1000克复合微生物菌剂,将复合微生物菌剂按照300-500倍比例稀释,与无害化处理的有机物混合后按照常规施肥的方法使用。

复合微生物菌剂修复土壤是在适当的水分、温度、pH值条件下,菌剂中的微生物菌群与土壤中原有的有益微生物共同形成优势菌群,促进土壤生态系统中碳、氮、氧等元素的良性循环,降解农药残留,从而修复土壤生态环境系统,使生态系统达到新的稳定的平衡。其中,微生物复合菌系对无机污染物的修复机理是微生物肥料进入土壤生态系统后,好氧菌、厌氧菌等微生物益生菌群,通过自身的生物反应,降低土壤的酸度,提高土壤的pH值,从而降低土壤中有害重金属的毒害;同时肥料中的微生物菌可以将重金属固定,促使土壤中活性重金属变为有机结合态,形成过滤层和隔离层,降低作物对土壤中重金属的吸收。按照本方法实施,残留在土壤中的农药降解率可达到95%以上,土壤中重金属被植物吸收的机率降低到3%左右。

具体使用方法与应用二:

1、在水稻、水根类作物种植农药污染区的应用:使用微生物复合修菌剂200 g/亩/次,稀释500-800倍,移栽、抛秧田,与有机肥或农家肥料等混合均匀后同时浸田;直播田,两叶一心时使用,拌合肥料撒施或稀释后注入流水口。追肥(抽穗前)200 g/亩/次,配合追肥施用,将本产品用水稀释,放入流水口,随水流流入田中即可,或直接拌合肥料撒施。

2、在大田作物种植农药污染区的应用:使用微生物复合修菌剂400~800 g/亩/次,稀释300-500倍,配合有机肥、农家肥等使用,按倍数稀释,灌根为主,喷叶为辅,保持土攘湿润;或直接拌水肥、冲施肥灌根、滴灌。

3、在经济作物种植农药污染区的应用:使用微生物复合修菌剂800~1600g/亩/次,稀释300-500倍,配合有机肥、农家肥等使用,按倍数稀释,灌根为主,喷叶为辅,保持土攘湿润;或直接拌水肥、冲施肥灌根、滴灌。菌剂对土壤中农药等有机污染物修复方面的作用是降低病虫害的防治次数,降解已经残留在土壤中的农药残留,降低农药的使用量,从而减少农药在作物中的残留量。微生物复合菌能改变土壤耕作层微生物区系,在作物根系周围形成优势菌落,从而强烈抑制病原菌繁殖,降低病虫害发生次数;同时,微生物在其生命活动过程中产生多种物质,如激素类、腐植酸类以及抗生素类,这些物质能刺激作物生长健壮,增强作物自身抗病害能力。

当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1