一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂及其制备与应用的制作方法

文档序号:12248346阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂,其特征在于:该复合微生物菌剂是通过菌种筛选与培养条件优化、菌种活化、扩大培养、脱水干燥步骤,分别获得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌种的菌体干粉,将10种菌种的菌体干粉混合均匀,得到的多菌体复合菌粉。

2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂,其特征在于:其制备方法包括以下步骤:

(1)将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌株分别进行菌株的筛选与培养条件优化,获得纯化菌株;将纯化菌株分别进行高密度培养、接种到摇瓶中活化培养、将活化培养好的菌种接种到发酵罐进行扩大培养;扩大培养结束后,将分别扩大培养得到的单菌种的发酵菌液经脱水干燥,获得上述10种菌种的菌体干粉;

(2)将10种菌株的菌体干粉均匀混合,得到多菌体复合菌粉;所述多菌体复合菌粉中,各活体菌占复合菌粉活菌总数的重量百分比如下:枯草芽孢杆菌10-15%、黑曲霉10-15%、胶质芽孢杆菌10-15%、粪肠球菌10-15%、地衣芽孢杆菌8-12%、巨大芽孢杆菌8-12%、荧光假单胞菌8-12%、植物乳杆菌5-8%、多粘芽孢杆菌5-8%、嗜热链球菌6-8%;所述多菌体复合菌粉中,有效活性菌含量为200-500亿个cfu/g,水分含量≦5%;在多菌体复合菌粉通入无菌空气包装,即得复合微生物菌剂。

3.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由枯草芽孢杆菌菌株制备枯草芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)枯草芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.015-0.02g/L,补充成分:DDT 0.1-0.2g/L,pH 7.0-7.2,将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、DDT、琼脂溶解于1000 mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2 mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,然后倾注到灭菌平板上,平板上培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.2-7.5,得含有DDT的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通枯草芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有DDT的固体培养基平板上,置于35℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有DDT的液体培养基中,置于35℃-38℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在DDT浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,37-39℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解DDT的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-3%的接种量,转接到含有DDT的液体培养基中,35℃-37℃,220-250r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对DDT的降解率;

7)筛选得到对DDT降解率最高的枯草芽孢杆菌,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)枯草芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的枯草芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速为160-200r/min,在35-37℃温度下培养26h-32h,获得液体发酵种子;上述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-11.25g/L、牛肉膏1.25-1.3g/L、NaCl3 2.5-5.5g/L、葡萄糖22-25g/L,营养液pH7.5-7.8;

(3)枯草芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉18-20g/L、豆粉20-22g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 1.2-1.5g/L、MgSO4.7H2O 0.15-0.2g/L、碳酸钙6.5-8.0g/L、硫酸铵1.5-1.65g/L;发酵罐中温度控制在37-40℃,发酵pH7-8,搅拌速度为200-250r/min,发酵时间28-32h;当发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的枯草芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成枯草芽孢杆菌菌体干粉。

4.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株制备地衣芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)地衣芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:MnSO4 0.5-1.0g/L、蛋白胨8-10g/L、牛肉膏2-3g/L、NaCl 3-5g/L、葡萄糖1.5-2.5g/L、琼脂15-20g/L,补充成分:甲胺磷 0.15-0.25g/L,pH7.0-7.2,将MnSO4、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、甲胺磷、琼脂溶解于1000 mL蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2 mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.0-7.2,得含有甲胺磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通地衣芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有甲胺磷的固体培养基平板上,置于30℃-32℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有甲胺磷的液体培养基中,置于30℃-32℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在甲胺磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解甲胺磷的菌株;

6)将步骤5)能够降解甲胺磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到含有甲胺磷的液体培养基中,30℃-32℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对甲胺磷的降解率;

7)筛选得到对甲胺磷降解率最高的地衣芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)地衣芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到的、置于冰箱4℃储存的地衣芽孢杆菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中,以摇瓶转速160r/min,在28-30℃温度下培养16h-20h,获得液体发酵种子;所述活化培养的活化培养基配方为:蛋白胨9.25-10.0g/L、牛肉膏4.5-5g/L、NaCl4.8-5.0g/L、葡萄糖1.5g-2.0/L、营养液pH6.5-7.2;

(3)地衣芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为3-5%;扩大培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉22-25g/L、K2HPO4 0.08-0.20g/L、MgSO4.7H2O 0.005-0.01g/L、酵母粉0.1-0.15g/L;发酵温度25-40℃,发酵pH值6-8,搅拌速度为200 -300r/min,空气流量比为8-10%,发酵时间18-28h;当发酵罐中的地衣芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的地衣芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成地衣芽孢杆菌菌体干粉。

5.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由黑曲霉菌株制备黑曲霉菌体干粉的具体步骤如下:

(1)黑曲霉菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨 5-10g/L、葡萄糖 20-25g/L、硫酸镁 0.5-1.0g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾 1.0-2.0g/L、琼脂 15-20g/L,补充成分:草甘膦0.15-0.25g/L、百草枯0.2-0.5g/L、土霉素0.1-0.2g/L,将蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、酵母浸出粉、磷酸氢二钾、琼脂溶解于1000 mL 蒸馏水中,然后加入10 mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL 灭菌蒸馏水的补充成分草甘膦、百草枯、土霉素,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为6.5-6.8,得含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通黑曲霉菌制成菌液,涂布于含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的各菌落,在含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有草甘膦、百草枯的液体培养基中,置于30℃-32℃120-150r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在草甘膦、百草枯浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解草甘膦、百草枯的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解草甘膦、百草枯的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1-3%的接种量,转接到有草甘膦、百草枯液体培养基中,25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对除草剂草甘膦、百草枯的降解率;

7)筛选得到对除草剂草甘膦、百草枯的降解率最高的黑曲霉菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)黑曲霉菌种活化:将步骤7)置于冰箱4℃储存的黑曲霉接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为蛋白胨5.0-5.5g/L、葡萄糖 10.0-15g/L、硫酸镁 0.5-0.8g/L、酵母浸出粉 2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾1-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为100-160r/min,在28-35℃温度下培养25h-28h,获得液体发酵种子;

(3)黑曲霉扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;扩大培养基配方马铃薯35-40g/L、葡萄糖20-50g/L、磷酸氢二钾5-8g/L、硫酸镁 1-1.5g/L、pH值为7.0;发酵温度为35℃,搅拌速度100-180r/min,发酵时间25-28h,当发酵罐中的黑曲霉含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的黑曲霉菌液经干燥脱水制备成黑曲霉菌体干粉。

6.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)菌株制备胶质芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)胶质芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖2-3g/L、硫酸铵 0.15-0.25g/L、酵母膏 0.1-0.g/L、KCl 0.01-0.02g/L、MgSO4.7H2O 0.01-0.02g/L、NaH2PO4 0.01-0.02g/L、CaCO3 0.1-0.2g/L、二氧化硅1-2g/L、琼脂10-15g/L,补充成分:氯氰菊脂0.1-0.3g/L、CuSO4.5H2O 0.02-0.025g/L,起始pH 7.0-7.2;将葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、KCl、MgSO4.7H2O、NaH2PO4、CaCO3、二氧化硅、CuSO4.5H2O、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分氯氰菊脂,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.0-7.5,得有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通胶质芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在氯氰菊脂浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,32-35℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解氯氰菊脂的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解氯氰菊脂的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有氯氰菊脂液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对氯氰菊脂的降解率;

7)筛选得到对氯氰菊脂的降解率最高的胶质芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)胶质芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的胶质芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:淀粉15-20g/L、磷酸氢二钾g/L、硫酸铵2-3g/L、酵母膏 3.5-5.5g/L、蔗糖8.5-10g/L、硫酸镁4.5-5g/L、碳酸钙2.5-3g/L、二氧化硅6.5-8g/L、三氯化铁 0.05-lg/L,pH7.0-7.2,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养18-20h,获得液体发酵种子;

(3)胶质芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量为4-6%;发酵培养基的成分为蔗糖2.5-6.5gg/L、磷酸氢二钾3-5.5gg/L、酵母膏3-6g/L、硫酸铵 2.5-5gg/L、大豆蛋白胨 5-10g/L、硫酸镁3-6/g/L、pH7.2-7.5;扩大培养条件:发酵温度32℃,pH7.2,搅拌速度180r/min-220r/min,发酵时间24h;当发酵罐的胶质芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的胶质芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成胶质芽孢杆菌菌体干粉。

7.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由嗜热链球菌菌株制备嗜热链球菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)嗜热链球菌菌株的筛选与培养条件优化按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏2-3g/L、蛋白胨2-3g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁15-20g/L、葡萄糖2-4g/L、吐温0.5ml-1.0ml/L、碳酸钙1.0-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.5-7.0,依照比例取适量水于锅中,加热,将牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;所述培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通嗜热链球菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上培养得到菌株;

6)将步骤5)得到各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按5%-8%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的嗜热链球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)嗜热链球菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的嗜热链球菌接种到活化培养摇瓶中活化培养,活化培养基配方为:胰蛋白胨1-3.0g/L、鱼蛋白胨2-3g/L、牛肉膏2-3g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、硫酸镁0.3-0. 5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.0g/L、乳糖1-1.5g/L,营养液pH 6.5-6.8,在35-40℃温度下培养24h-28h,搅拌速度为80-100r/min,获得液体发酵种子;

(3)嗜热链球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量2-5%;扩大培养基配方:葡萄糖1-3g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、磷酸氢二钾2-3g/L、玉米汁40-50g/L、醋酸钠1-2g/L、脱脂乳10-15g/L、pH为6.5-6.8;发酵温度38-45℃,搅拌速度为100-120r/min,发酵时间48-72h;当发酵罐中的嗜热链球菌含量达到≧109个/ml时将培养菌液离心后冻干,制得嗜热链球菌菌体干粉。

8.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由粪肠球菌菌株制备粪肠球菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)粪肠球菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:蛋白胨10-15g/L、麦芽糖20-25g/L、酵母浸粉10-2g/L、甘油磷酸钠5-6g/L、氯化钠1-2g/L、乳糖0.015-0.020g/L、琼脂 15-20,pH值8.0-8.5,另按照顺序在培养基中分别加入补充成分:红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L;将蛋白胨、麦芽糖、酵母浸粉、甘油磷酸钠、氯化钠、乳糖、琼脂溶解于1000mL 蒸馏水中,然后加入10mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分红霉素0.05-0.15g/L、环丙沙星 0.01-0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.25-0.35g/L,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.5-8.0,的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通粪肠球菌制成菌液,涂布于含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的液体培养基中,置于33℃-35℃,160-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,35℃-38℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到pH8.5-9.0的含有红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑素液体培养基中,在38℃-40℃,180-250r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率;

7)筛选得到对红霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑的降解率最高的粪肠球菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)粪肠球菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的粪肠球菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:葡萄糖4-5g/L、酵母粉0.15-0.3g/L、蛋白胨0.5-1g/L、无水氯化钙0.002-0.006g/L、七水合硫酸镁0.02-0.05g/L、磷酸氢二钾0.1-0.15g/L、七水合硫酸锰0.002-0.005g/L、碳酸钙0.5-1g/L,营养液pH7.5-8.0,摇瓶转速为180-200r/min,在30-35℃温度下培养30h-35h,获得液体发酵种子;

(3)粪肠球菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量8-10%;培养基配方为胰蛋白胨10-15g/L、酵母粉10 -15g/L、葡萄糖10-15g/L、无水氯化钙0.04-0.06g/L、七水合硫酸镁0.019-0.025g/L、磷酸氢二钾0.04-0.06g/L、磷酸二氢钾0.04 -0.06g/L、磷酸氢钠0.4-0.6g/L、氯化钠0.08-0.1g/L、土豆汁50-80g/L、碳酸钙1-3g/L、乙酸钠10-15g/L、碳酸铵2-3g/L、乙酸铵1-2g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L,pH值为8.5-9;发酵温度35-37℃,搅拌速度180-220r/min,发酵时间20-32h,当发酵罐的粪肠球菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的粪肠球菌菌液经干燥脱水制备成粪肠球菌菌体干粉。

9.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由植物乳杆菌菌株制备植物乳杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)植物乳杆菌菌株的筛选与培养条件优化,按常规方法进行:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:水100ml、牛肉膏1-2g/L、蛋白胨1-2g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁20-30g/L、葡萄糖1-2g/L、吐温0.05ml-0.10ml/L、碳酸钙1.5-2.0g/L、琼脂2-5g/L,pH6.2-6.5,依照比例按照所需量取适量水于锅中,加热,称取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中,待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎,121℃灭菌20min,得灭菌后的培养基,放在37℃恒温培养箱培养24h,无菌生长者方可使用;培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养;所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通植物乳杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,静置于36℃-38℃,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,37-38℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到的各菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按3%-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃,静置培养1-2天,最后测定各菌株所产生的生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的植物乳杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)植物乳杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的植物乳杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-12g/L、牛肉膏10-15g/L、酵母膏5-6.5g/L、KH2PO4 2-3.5g/L、柠檬酸三钠2-2.5g/L、乙酸钠2-2.5g/L、葡萄糖20-28g/L、MgSO4.7H2O 0.58-0.60g/L、MnSO4.4H2O 0.25-0.3g/L,营养液pH 6.2-6.5,在35-40℃温度下培养24h-28h,静置培养,获得液体发酵种子;

(3)植物乳杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-8%;培养基配方为:蔗糖25-30g/L、酵母膏15-20g/L、KH2PO4 8-10g/L、柠檬酸三钠5-6g/L、乙酸钠3-5g/L、MgSO4.7H2O 0.8 -1.2g/L、MnSO4.4H2O 0.5-0.8g/L,pH 6.2-6.5;发酵温度35-37℃,发酵时间24-28h,静置培养;发酵结束,将发酵好的植物乳杆菌菌液经干燥脱水制备成植物乳杆菌菌体干粉。

10.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由多粘芽孢杆菌菌株制备多粘芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)多粘芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨10-15g/L、酵母提取物 5-8g/L、NaCl 3-5g/L、KH2PO4 0.1-0.2g/L、MgSO4.7H2O 0.05-0.1g/L、MnSO4.7H2O 0.25-0.5g/L、琼脂15-20g/L,pH7.5-8.0;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、KH2PO4、NaCl、MgSO4.7H2O、琼脂溶解于1000 mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.5-8.0,得固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通多粘芽孢杆菌制成菌液,涂布于固体培养基平板上,置于37℃-40℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一优势菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入液体培养基中,置于38℃-40℃,160-180r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在固体培养基平板上划线,38-40℃避光培养2-3天;在固体培养基平板上生长得到菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到液体培养基中,37℃-40℃,180-200r/min振荡培养1-3天,最后测定各菌株所产生的如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质含量;

7)筛选得到产生生物活性物质含量最高的多粘芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)多粘芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)筛选得到、置于冰箱4℃储存的多粘芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨8-10g/L、牛肉膏3-5g/L、氯化钠3-5g/L、葡萄糖10-12g/L、KH2PO4 0.2-0.3g/L、MgSO4.7H2O 0.2-0.35g/L、NaCl 0.2-0.3g/L、CaSO4.2H2O 0.2-0.25g/L、CaCO3 5.0-6.5g/L,营养液pH 7.0-8.0,摇瓶转速150-170r/min,在37-40℃温度下培养25h-30h,获得液体发酵种子;

(3)多粘芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量10-12%;扩大培养基配方为:玉米粉20-25g/L、豆粉8-12g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钠1.0-1.5g/L、Na2HP04 0.15-0.25g/L;发酵温度28-35℃,发酵pH7-8,搅拌速度为160-200r/min,发酵时间20-25h;当发酵罐的多粘芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的多粘芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成多粘芽孢杆菌菌体干粉。

11.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由巨大芽孢杆菌菌株制备巨大芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)巨大芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O 0.025-0.035g/L,补充成分:对硫磷0.15-0.20g/L,pH7.5-8.0,;将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、对硫磷、琼脂溶解于1000 mL 蒸馏水中,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时为7.5-8.0,得含有对硫磷的固体培养基平板,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通巨大芽孢杆菌制成菌液,涂布于含有对硫磷的固体培养基平板上,置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有对硫磷的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中,置于28℃-30℃,180-200r/min振荡条件下,培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在对硫磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,30-32℃避光培养2-3天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解对硫磷的菌株;

6)将步骤5)得到能够降解对硫磷的菌株,分别转接到活化培养基上进行活化,然后将活化的菌液按2-5%的接种量,转接到有对硫磷液体培养基中,37℃-40℃,200-220r/min振荡培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定各菌株对对硫磷的降解率;

7)筛选得到对硫磷的降解率最高的巨大芽孢杆菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)巨大芽孢杆菌菌种活化:将步骤7)获得的、置于冰箱4℃储存的巨大芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:蛋白胨10-15g/L、牛肉膏3-5g/L、NaCl6.5-8.5g/L,葡萄糖2.5-3g/L,营养液pH7.0-7.2,摇瓶转速为190-210r/min,在37-40℃下培养22-28h,获得液体发酵种子;

(3)巨大芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5-9%;扩大培养的培养基配方为:玉米粉15-18g/L、豆粉25-30g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO4 0.05-0.15g/L、氯化钙5.5-6.5.0g/L、硫酸铵2.0-2.5g/L;发酵温度36-40℃,发酵pH值在7-8,发酵罐搅拌速度为200-250r/min,发酵时间25-32h;当发酵罐中的巨大芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的巨大芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成巨大芽孢杆菌菌体干粉。

12.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:由荧光假单胞菌菌株制备荧光假单胞菌菌体干粉的具体步骤如下:

(1)荧光假单胞菌菌株的筛选与培养条件优化:

1)筛选培养基配方及制备:按以下培养基配方:胰蛋白胨 10-12g/L、K2SO4 10-12g/L、MgCl2 1.4-1.6g/L、Fe2(SO4)3 0.5-1g/L、甘油 10 mL、琼脂15~20g/L、蒸馏水1 L,补充成分:青霉素0.05-0.10g/L;将胰蛋白胨、K2SO4、MgCl2、Fe2(SO4)3、琼脂溶解于1000 mL 蒸馏水中,然后加入10 mL甘油,加热煮溶,并在121℃高压蒸汽灭菌15min,得基础培养基,待基础培养基冷却至45℃~50℃时,加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分,与尚处于融溶状态的基础培养基混合,倾注到灭菌平板上,培养基厚度至少高5mm,培养基的最终pH在温度为25℃时,为7.0-7.2,得含有青霉素的固体培养基,置于黑暗处,于3℃~6℃保存;

2)接种与纯化:将安瓿管保存的普通荧光假单胞菌制成菌液,涂布于含有青霉素的固体培养基平板上,置于25℃-28℃条件下遮光培养2-5天,得到不同菌落;

3)将步骤2)分离得到的菌落,在含有青霉素的固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复3-5次,直至得到单一菌落;

4)将步骤3)的单一菌落依次接入含有青霉素的液体培养基中,置于25℃-28℃,150-180r/min振荡条件下,遮光培养1-3天,得到单一菌落培养液;

5)将步骤4)得到的培养液,在青霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,25-28℃避光培养2-5天;在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解青霉素的菌株;

6)将步骤5)得到菌株,分别转接到活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1%-3%的接种量,转接到含有青霉素液体培养基中,在25℃-28℃,160-180r/min振荡暗培养1-3天,最后用高效液相色谱法测定菌株对青霉素的降解率;

7)筛选得到对青霉素降解率最高的荧光假单胞菌菌株,作为纯化菌株采用试管斜面保存,置于冰箱4℃储存;

(2)荧光假单胞菌菌种活化:将步骤7)获得的置于冰箱4℃储存的荧光假单胞菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中活化,活化培养基配方为:牛肉膏2.55-3.0g/L、蛋白胨1.65-2.2g/L、氯化钠0.18g-0.2g/L、酵母膏5.25-6.0g/L、Fe2(SO4)3 1-1.5g/L,培养液pH7.0-7.5,摇瓶转速为180r/min,在28.5-31℃温度下培养18-22h,获得液体发酵种子;

(3)荧光假单胞菌扩大培养、脱水干燥:将步骤(2)获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵,进行扩大培养,接种量5.5~8.5%;所述扩大培养的培养基配方为:麦芽糖20-35g/L、玉米粉12-15g/L、酵母膏4.5-4.62g/L、硫酸铵5.2-5.8g/L、K2HPO4 0.55-0.85g/L、MgSO4.7H2O 0.035-0.055g/L、FeSO4.7H2O 1.095-1.20g/L、CaCl2 0.075-1.0g/L、NaCl 0.15-0.25g/L;发酵温度27℃~29℃,发酵罐搅拌速度140~180r/min,通气量8~12%,发酵时间24~48h;当发酵罐中的荧光假单胞菌含量达到≧1010个/ml时,将发酵好的荧光假单胞菌菌液经干燥脱水制备成荧光假单胞菌菌体干粉。

13.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:在有机污染物无害化处理中,应用于对畜禽粪便进行堆肥发酵、对农业废弃有机物、工业加工有机原料、有机垃圾、有机污泥的无害化处理。

14.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:在农业种植领域,改良土壤、生物防治、降低农业境污染、增加作物产量及提高作物产品品质中的应用。

15.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂,其特征在于:作为农业环境修复剂,在降解农药与处理重金属污染中的应用。

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