重组质粒pMDMcherry、其构建方法和红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法与流程

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种重组质粒pMDMcherry及其构建方法，以及红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法。

背景技术：

斑马鱼是近十几年来发展起来的一种新兴的模式动物。作为一种脊椎动物，它具有许多小鼠所无法达到的优势：斑马鱼体积小，饲养和维持的费用低；繁殖周期短，产卵量大；更为重要的是，斑马鱼胚胎是体外受精，发育过程可被直接连续观察。斑马鱼作为感染性疾病的感染模型越来越受到病原微生物学家的喜爱。

鮰爱德华氏菌为肠杆菌科爱德华氏菌属的细菌。1979年，Hawke首次发现鮰爱德华氏菌感染斑点叉尾鮰，目前已在澳大利亚、泰国、越南、日本、中国等相继发现鮰爱德华氏菌感染鱼类发病，感染对象包括南方大口鲇、斑点叉尾鮰、黄颡鱼、鳗鲶和罗非鱼等，其发病率和死亡率均较高，严重影响水产养殖业的发展。

目前国内对鮰爱德华菌致病机理研究报道较少，而研究细菌致病机理不可避免地要涉及细菌与宿主之间的关系，使用标记基因是监测细菌在宿主内生长、繁殖及其与宿主相互作用关系的有效手段。

技术实现要素：

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组质粒pMDMcherry及其构建方法，以及红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种重组质粒pMDMcherry，其具有如SEQ ID NO:7所示的碱基序列。

本发明还提供了上述重组质粒pMDMcherry的构建方法，包括以下步骤：

(1)、以质粒PRUAL为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，进行PCR扩增，获得序列号为SEQ ID No:3的启动子片段；

(2)、以质粒pLVX-PAmCherry-C1为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，进行PCR扩增，获得序列号为SEQ ID No:6的红色荧光蛋白Mcherry片段；

(3)、以步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段混合作为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:5为引物，进行PCR扩增；

(4)、将步骤(3)的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体连接，转化后进行测序鉴定，得到序列号为SEQ ID No:7的重组质粒pMDMcherry。

在其中一些实施例中，步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段的体积比为1:1。

在其中一些实施例中，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应体系为：5×buffer20ul、dNTPs 8ul、primersense 2ul、antisense 2ul、templet 1ul、Primerstar 1ul、加H₂O至100ul。

在其中一些实施例中，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应程序为：95℃2min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，共30个循环；72℃10min。

在其中一些实施例中，步骤(4)中所述连接反应的反应体系为：10×buffer2ul、templet15ul、templet25ul、templet35ul、T4ligase 0.5ul、加H₂O至20ul。

本发明还提供了一种红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法，包括以下步骤：

(1)、从患病斑马鱼体内分离出鮰爱德华菌：

(2)、制备鮰爱德华菌感受态；

(3)、将上述重组质粒PMDMcherry转入到制备的鮰爱德华菌感受态中，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、红色荧光蛋白(Mcheey fluorescent protein)能够自身催化形成发色结构并在绿光激发下发出红色荧光。作为报告基因，Mcheey是不需要外源底物或辅助因子，就能在活细胞中表达的发光蛋白，Mcheey作为荧光标记分子既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因此可实现在体内实时检测标记菌株的情况，能很好地进行菌体跟踪研究。本发明通过巧妙的引物设计，实现了重组质粒PMDMcherry的制备；

2、本发明通过将构建的重组质粒PMDMcherry转入到制备的鮰爱德华菌感受态中，建立了Mcheey标记的鮰爱德华菌强毒株，便于以后通过荧光显微镜观察鮰爱德华菌侵染宿主的动态过程，实现荧光菌株观察，方法简便直观，为研究鮰爱德华菌与宿主的相互作用关系奠定基础，极大地降低了实验的成本，同时，质量的稳定性也非常高；

3、本发明使用的鮰爱德华菌菌株是在患病斑马鱼体内分离出来的，对斑马鱼具有较高的致病性，以模式动物斑马鱼作为实验动物，进行该菌株的感染实验研究，对于鮰爱德华菌致病机理的了解具有较大的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中构建PMDMcherry质粒的步骤的示意图；

图2为本发明实施例2中显微镜下观察的荧光蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1重组质粒PMDMcherry的构建方法

本实施例的重组质粒PMDMcherry的构建方法，包括以下步骤：

(1)制备启动子片段：

以质粒PRUAL为模板，ppS(SEQ ID No:1)、ppA(SEQ ID No:2)为上下游引物，按照常规方法进行PCR反应，PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit(天根生化科技(北京)有限公司)进行胶回收，获得启动子片段，序列号为SEQ ID No:3。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2：

ppS：5'CGCCTAGGATACGCACACCGTGGAAAC3'(SEQ ID No:1)

ppA：5'CCTTGCTCACCATTTTTTCTTCCTCCA3'(SEQ ID No:2)

表1PCR扩增体系

表2PCR扩增程序

(2)制备MCHEEY片段：

以质粒PLVX-PAMCHERRY-C1VECTOR(TaKaRa公司)为模板，MCS(SEQ ID No:4)、MCA(SEQ ID No:5)作为上下游引物，按照常规方法进行PCR反应，PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit进行胶回收，得到MCHEEY片段，序列号为SEQ ID No:6。PCR反应体系见上表1，PCR反应条件见上表2。

MCS：5'AGGAAGAAAAAATGGTGAGCAAGGGCGA3'(SEQ ID No:4)

MCA：5'GCGTTCGAATTACTACTTGTACAGCT3'(SEQ ID No:5)

(3)启动子与MCHEEY连接

由于设计时引物ppA和MCS有一段重复序列，因而它们的PCR扩增启动子片段和MCHEEY片段也有一段重复序列，这样便于用PCR方法连接启动子和MCHEEY片段。以回收的启动子和MCHEEY片段1：1混合作为模板，ppS(SEQ ID No:1)、MCA(SEQ ID No:5)作为上下游引物进行PCR，PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit进行胶回收。PCR反应体系见上表1，PCR反应条件见上表2。

(5)PCR产物的T/A连接、转化与鉴定：

将步骤(4)纯化的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体(购买自TaKaRa公司)进行连接，16℃连接过夜。连接体系见表3。常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板(含氨苄青霉素50μg/mL)上，37℃孵箱培养16h，挑取阳性克隆，扩增培养，经PCR鉴定的重组质粒PMDMcherry进行测序鉴定。通过上述方法构建得到的重组质粒PMDMcherry的图谱如图1所示，重组质粒PMDMcherry的序列为SEQ ID NO:7所示。

表3连接体系

实施例2红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的制备方法

本实施例的红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用常规操作方法，从患病斑马鱼体内分离出鮰爱德华菌强毒株；

(2)制备鮰爱德华菌感受态

方法如下：

(a)接种鮰爱德华菌到BHI液体培养基中，28℃，280rpm摇床培养过夜；

(b)按1:500的量转接到含500ml BHI液体培养基中，280rpm，2.5-3.5h，培养至OD600为0.6；

(c)立刻置冰水浴中骤冷：可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器，放在摇床上快速旋转摇动，尽快使培养物温度降下来；

(d)随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，4000rpm，30min；

(e)弃上清后，用预冷的灭菌双蒸水洗：先加少量水悬浮菌体，菌体悬浮后再把水加至500mL，4000rpm，20min，弃上清；

(f)再用10％的预冷甘油500mL洗1次，4000rpm，20min；将两个离心管中的细菌混合，10％的预冷甘油100mL洗1次，4000rpm，20min；

(g)最后一次倒尽甘油后(尽量去干净)，加1mL甘油悬浮细胞，每80μl分装到1.5mL EP管(EP管要-80℃预冷)，-80℃保存备用。

(3)载体PMDMcherry的获取、连接与转化：

提取测序鉴定正确菌株的质粒PMDMcherry(即实施例1得到的重组质粒)，使用电转法转入到制备的鮰爱德华菌感受态中。电转化方法如下：

(A)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

(B)取1μl纯化后的重组质粒PMDMcherry(200ng)于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

(C)将80ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

(D)打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

(E)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；

(F)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1ml的BHI液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

(G)37℃，220－250rpm复苏1小时。

(H)取200μl转化产物涂布于含氨苄青霉素的BHI琼脂平板(含氨苄青霉素50μg/mL)，放于28℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

(4)荧光菌株观察。

构建好的菌株用无菌水稀释后涂到载玻片上，使用荧光显微镜，在20×10的放大倍数下观察，能稳定高效的表达红色荧光蛋白，如图2。

将实施例1构建得到了PMDMcherry重组载体导入到鮰爱德华菌强毒株中，在荧光显微镜下观察,菌体呈现红色荧光，说明成功转入。稳定性试验表明，PMDMCHEEY传至25代,质粒稳定率可达100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。