一种酯酶EstK1蛋白及其应用的制作方法

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种酯酶EstK1蛋白及其应用。

背景技术：

酯酶(Esterase；EC 3.1.1.1)属于脂解酶的一种，可催化酯键的水解和合成，广泛存在于动物、植物和微生物中。脂肪酶和酯酶同属于脂解酶类，它们催化酯键合成和水解的机理相同，不同点在于脂肪酶催化水解合成水不溶性的长链甘油酯(碳链长≥10)，酯酶催化水解合成水溶性的短链甘油酯(碳链长<10)。在水相中，酯酶催化水解反应，在有机相中，可催化酯合、转酯、酯交换和氨解等反应的进行。因其良好的底物特异性、立体选择性和区域选择性，酯酶成为一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂和化工等行业。然而，不同于脂肪酶，目前只有极少数的酯酶应用于有机合成中。因此，开发新型且具有优良性状的酯酶，具有重要的工业应用价值。

乙酸酯是一种非常重要的酯类，常作为调味剂或香料广泛应用在食品、化妆品和医药等行业。其中，乙酸肉桂酯属于苯丙素类物质，自然条件下存在于新鲜桂皮中。研究表明，乙酸桂酯具有良好的生物活性，特别是抗氧化性，这可能归因于乙酸桂酯的结构特点。乙酸桂酯已经被用来合成HIV-蛋白酶抑制剂。再者，乙酸桂酯因其良好的甜、香、花香气味，广泛应用在香料行业。天然乙酸肉桂酯可以从植物中提取，但是低的提取率导致生产成本的大大提高；化学合成法是一个高效制备乙酸肉桂酯的方法，但是有毒化学品的使用降低了产品的安全性，并且化学法的低专一性，使得反应过程产生较多的副产物。酶催化的方法被认为是一个理想的替代法，因其温和的反应条件和环境友好型的进程，使得酶催化法越来越受到关注。然而，目前酶催化制备乙酸肉桂酯主要采用脂肪酶催化法，都存在转化率低和反应时间长的问题，这可能与脂肪酶偏好长链脂肪酸的特点有关。酯酶偏好短链脂肪酸，因此使用酯酶催化制备乙酸桂酯，被认为是一个良好的选择。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酯酶EstK1蛋白及其应用，利用该酯酶的转酯活性于非水相中，高效催化乙酸肉桂酯等乙酸酯的合成，从而弥补现有技术的不足。

本发明的酯酶EstK1蛋白，其氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

本发明提供一种编码酯酶EstK1蛋白的estK1基因，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

本发明提供一种携带estK1基因的载体，其包括pET21a(+)、pET28a(+)和pET32a(+)。

本发明提供一种携带上述载体的重组表达载体，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供一种转酯反应，其利用所述酯酶EstK1蛋白非水相生产乙酸肉桂酯。

进一步的，所述转酯反应使用EstK1冻干全细胞进行催化反应。

进一步的，所述转酯反应的酰基供体为乙酸乙烯酯。

进一步的，所述转酯反应的有机溶剂为异辛烷。

进一步的，所述转酯反应的底物肉桂醇和乙酸乙烯酯的摩尔比为1:4。

进一步的，所述转酯反应的反应温度为40℃。

效果较好的，本发明利用所述酯酶EstK1蛋白非水相生产正辛醇乙酯、2-苯乙醇乙酯、香茅醇乙酯或香叶醇乙酯。

有益效果：

上述酯酶可高效催化肉桂醇和乙酸乙烯酯发生转酯反应，生成乙酸肉桂酯。1h乙酸肉桂酯的回收率达到94.1％，2h时，大部分的底物肉桂醇转化完成，桂酸乙酯回收率达到97.1％，大大缩短了乙酸肉桂酯的制备时间。

上述酯酶可催化其他乙酸酯的合成，如正辛醇乙酯，2-苯乙醇乙酯，香茅醇乙酯和香叶醇乙酯，体现了其在乙酸酯类香料制备上的潜能。

附图说明

图1：本发明的酯酶EstK1进化树分析及多重序列比对示意图；

图2：本发明的酯酶EstK1的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1是纯化后的EstK1，泳道2是蛋白Marker，泳道3是表达后菌体破碎液上清，泳道4是表达后菌体破碎液沉淀；

图3：EstK1酶学性质研究；其中，图a是EstK1碳链长度的偏好性，图b是EstK1最适pH，图c是EstK1最适温度，图d是洗涤剂对EstK1酯酶活力的影响；

图4：EstK1非水相制备乙酸肉桂酯条件的优化；其中，图a是酰基供体对转酯的影响，图b是有机溶剂对转酯的影响，图c是肉桂醇乙酸乙烯酯摩尔比对转酯的影响，图d是温度对转酯的影响；

图5：不同菌体添加量下的乙酸肉桂酯合成时间曲线；

图6：转酯生成乙酸桂酯2h HPLC结果图；

图7：EstK1合成乙酸酯的底物谱。

具体实施方式

本发明用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结合实施例和附图对该发明进行详细的描述，但保护范围并不仅限于此。

本发明通过基因文库构建及特异性筛选的方法，得到一个新型具有良好性状的IV家族酯酶，该酯酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)编码上述酯酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明的酯酶EstK1具有在非水相催化转酯反应的能力，可催化特定的醇类和短链乙酸酯进行转酯反应，生成相应的乙酸酯类香料。

如图1-图7所示，通过以下五个实施例详细说明本发明的酯酶EstK1蛋白及其应用。

实施例1：基因文库的构建及脂解酶序列的分析

在之前的研究中，本实验室筛选得到一株高产酯酶的菌株(OUC_Estk)，并鉴定为溶血不动杆菌。提取该菌的基因组DNA，用Sau3AI限制酶进行不完全酶切，并回收2-7kb的DNA片段。将回收片段连接到用BamHI完全酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化的pBluescript II SK(+)载体上。重组载体导入DH5α感受态细胞，并涂布于含有三丁酸甘油酯的LB氨苄抗性固体平板上。置于37℃培养箱静置培养1-2d后，挑取带有明显透明圈的阳性克隆进行培养，抽提质粒并送去测序。测序结束后，通过ORF预测及BLASTP比对，得到一个具有1071bp大小的脂解酶全长基因。进化树分析(图1a)显示，EstK1属于脂解酶IV家族，催化三联体位置(图1b)分别为Ser(201位)，Asp(299位)，His(325位)。

实施例2：酯酶EstK1的克隆表达及纯化

根据得到的EstK1全长基因，设计该基因的全长引物，上游引物：CGCGGATCCATGTTTGCATTGAATGAATCACTTA(BamHI酶切位点)，下游引物：CCCAAGCTTTTAACTACGTTTATCCCAAAATTTACG(HindIII酶切位点)。酶切后的目的片段分别与同样酶切的pET21a(+)、pET28a(+)、pET32a(+)载体连接，重组质粒最终导入BL21(DE3)中进行诱导表达。诱导表达后，菌体破碎，经酶活检测，发现使用三种载体都可以表达出活性酯酶，因使用pET32a(+)表达的蛋白含量更高，故选择pET32a(+)作为最终的表达载体。将重组蛋白EstK1进行纯化。

上述的酯酶EstK1的凝胶电泳如图2所示，条带1是纯化后的EstK1，条带M是蛋白marker，条带2是破碎液上清，条带3是破碎液沉淀。

实施例3：酯酶EstK1酶学性质研究

(1)酯酶EstK1底物特异性研究

在100mM的pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，使用不同碳链长度的pNP酯(C2，C4，C8，C10，C12，C14，C16)进行检测，看酯酶EstK1对碳链长度的偏好性。如图3a所示，酯酶EstK1显示对C4具有最高的活力，对＞10碳的pNP长链酯活力很低，说明酯酶EstK1是一个酯酶。

(2)最适pH

纯化后的酯酶EstK1，使用不同的pH缓冲液，检测EstK1的最适pH。反应过程以pNPB(C4)为底物，不同pH缓冲液分别为：磷酸钠缓冲液(pH 6，7，8)，Tris-HCl缓冲液(pH 8，9)和Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9，10)。如图3b所示，EstK1的最适pH为8.0，并且EstK1显示出在偏碱性环境下更高的活性，说明EstK1是一个碱性酯酶。

(3)最适温度

该过程以pNPB(C4)为底物，在100mM的pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，检测不同的温度(30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，60℃)对EstK1酶活的影响。如图3c所示，EstK1的最适温度为40℃，并且35℃时的酶活接近40℃时的酶活。

(4)洗涤剂的影响

该过程通过向反应体系中添加0.5％的洗涤剂(Tween 20,Tween 60,Tween 80,Triton X-100,SDS)，研究酶活的变化，其中未添加洗涤剂的作为对照，其酶活定义为100％。如图3d所示，添加Tween 60,Tween 80和Triton X-100后，酯酶酶活都有不同程度的提高，其中Tween 60对酶活的提高最大，酶活提高到119.47％，Tween 20对酶活有稍微的降低作用，而SDS显著抑制了酯酶EstK1的活性。

(5)金属离子对酶活的影响

通过添加不同的金属离子进行酶活检测，显示出了不同的效果，如表1所示。其中Fe²⁺显著提高了酯酶活性，添加10mM的Fe²⁺，酯酶酶活提高到234.97％。Zn²⁺对酶活有最大的抑制作用，使酶活降低到31.79％。

表1

(6)有机溶剂对酶活的影响

添加不同的有机溶剂到酶液中，使有机溶剂分别达到25％和50％的终浓度，置于37℃中震荡孵育3h，然后检测剩余酯酶酶活。水溶性有机溶剂，需要稀释到5％进行检测，水不溶性的有机溶剂通过离心去除后，检测酯酶活力。由表2结果可以看出，疏水性的有机溶剂，如烷氢类(环己烷、正己烷和异辛烷)对酯酶EstK1的影响最小。

表2

实施例4：酯酶EstK1非水相制备乙酸肉桂酯

采用非水相催化制备乙酸酯，可简化后续纯化等步骤，具有明显优势。本过程采用EstK1冻干全细胞作为催化剂，在有机相中催化制备乙酸肉桂酯。

(1)酰基供体对转酯的影响

如图4a所示，研究了不同酰基供体(乙酸乙烯酯，乙酸异丙烯酯，乙酸异戊酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯和乙酸丁酯)对转酯效果的影响。其中乙酸乙烯酯作为酰基供体时，转酯活性最高，乙酸异丙烯酯次之，使用其他酰基供体活性较低。这可能是因为使用乙酸乙烯酯和乙酸异丙烯酯做酰基供体时，产物烯醇不稳定，会转变成为醛类，烯醇到醛类的反应属于不可逆的过程，从而促进了转酯反应的高效进行。

(2)有机溶剂对转酯的影响

通过使用不同的疏水性有机溶剂，研究它们对EstK1转酯活性的影响，结果如图4b所示。由结果可以看出，异辛烷作为有机溶剂时，EstK1的转酯效果最强，因此异辛烷被选作最佳的有机溶剂。

(3)肉桂醇乙酸乙烯酯摩尔比对转酯的影响

本过程考察了肉桂醇和乙酸乙烯酯的摩尔比对转酯反应的影响，设置摩尔比为1:1,1:2,1:3,1:4,1:5和1:6，结果如图4c所示。通过结果可以看出，随着摩尔比的升高，转酯效果逐渐明显，但在摩尔比在1:4后，转酯效果间的差异不再明显。考虑到经济原因，将1:4作为最佳的肉桂醇乙酸乙烯酯的摩尔比。

(4)温度对转酯的影响

温度不仅影响酶的活性和稳定性，而且影响介质的粘度和反应平衡等。通过在不同的温度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃)下进行转酯反应，发现不同的温度对转酯反应的影响很大(图4d)。其中在40℃，EstK1的转酯效果最强，因此40℃被选作最佳的反应温度。

(5)不同菌体添加量下的转酯的曲线

本过程中，在最适反应条件下(乙酸乙烯酯做为酰基供体，异辛烷作为有机溶剂，摩尔比1:4，40℃下反应)，考察了在不同菌体添加量下的转酯曲线，实验结果以时间为横坐标，以乙酸桂酯的回收率未纵坐标，结果如图5所示。在菌体添加量为10mg/mL时，1h乙酸肉桂酯的回收率达到94.1％，并且随着时间的延长，回收率逐渐升高。在反应2h后，底物肉桂醇大部分消耗完毕，乙酸肉桂酯的回收率达到97.1％，其中液相结果如图6所示。

实施例5：酯酶EstK1非水相制备其他乙酸酯

为了验证酯酶EstK1制备其他乙酸酯的能力，采用不同的醇类(正丁醇，正戊醇，异戊醇，正辛醇，松油醇，苯酚，3-氯苯酚，2-苯乙醇，肉桂醇，香茅醇，香叶醇和芳樟醇)作为底物，反应相同的时间后，检测产物的生成量，其中肉桂醇作为阳性对照。实验结果表明，酯酶EstK1可利用正辛醇，2-苯乙醇，香茅醇和香叶醇作为底物制备相应的乙酸酯，其中酯酶EstK1对2-苯乙醇的转酯效率最高，结果如图7所示。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。