1.如图1所示的质粒pPIC9K-A,其中Agkisacutacin A链基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如图2所示的质粒pUCZ-B,其中Agkisacutacin B链基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种转化体,含有权利要求1或权利要求2所述质粒之一或其组合。
4.根据权利要求3所述的转化体,其特征在于,表达重组异源二聚体蛇毒蛋白,所述异源二聚体蛇毒蛋白由A链、B链两条肽链组成,其中,A链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,B链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的转化体,其特征在于,为毕赤酵母菌株。
6.根据权利要求5所述的转化体,其特征在于,其保藏编号为CCTCC No.M2016358,分类命名为巴斯德毕赤酵母GS115。
7.权利要求1或2所述质粒、权利要求3-6任一项所述转化体在制备血栓治疗药物中的用途。
8.一种大量表达重组异源二聚体蛇毒蛋白的方法,其特征在于,包含以下几个步骤:
Batch阶段:取权利要求4-6任一项所述的转化体二级种接入含pH4.0~6.0的基础盐培养基中,添加甘油至4%,扩增菌体,溶解氧含量DO急剧上升时,batch阶段结束;
转化期:持续补充含有10-15ml/L PTM1的50%甘油溶液,流速为10-15ml/h/L,这个过程维持至湿重在190-200g/L;
甲醇诱导阶段:当湿重达到190-200g/L时,停止甘油流加,按恒定甲醇流速限制性流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液;搅拌速度800-1200rpm,总共发酵70-90小时,湿重达400-600g/L;
蛋白纯化:发酵结束后,调节发酵液pH至8.0,经过高速离心、过柱,纯化得到重组异源二聚体蛇毒蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,整个过程温度为28-34℃。
10.根据权利要求8-9任一项所述方法制备的重组蛋白。