一种肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别方法与流程

本发明属于食品生物的技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别方法。

背景技术：

肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesensteroides)是一种植物附生菌，常见于传统发酵乳制品和泡菜中。因其能发酵产生乳酸及双乙酰类物质，被认为对这些传统食品的风味有重要贡献。2012年卫生部将肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides)列入可用于食品的菌种目录(卫生部公告2012年第8号)，关于肠膜明串珠菌的发酵特性及其特殊生理活性的研究逐步深入。目前肠膜明串珠菌肠膜亚种在食品领域已被广泛应用于风味剂；并且因其特殊的生理活性，未来有望成为新型微生态制剂。随着研究的不断开展，未来会有越来越多的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌株被应用于食品领域及益生菌制剂中。

在这种形势下，对于这些高度相似(都是肠膜明串珠菌肠膜亚种)却又有不同的发酵特性或益生特性的菌株的甄别是一个亟待解决的难题。然而，目前对于肠膜明串珠菌肠膜亚种的鉴定和甄别尚缺少十分高效的技术手段。传统的生化鉴定方法难以实现同亚种下不同菌株的甄别；经典的分子生物学方法基于16S rDNA序列进行鉴定，但这种方法只能实现种水平的鉴定，对于亚种水平的鉴定无能为力。有研究者以某些看家基因，如gyrB的序列作为鉴定依据，但同样只适用于种水平的鉴定。目前对于肠膜明串珠菌肠膜亚种中不同菌株(高度相似，其基因组水平的相似性可达90％以上)的甄别只能依赖全基因组测序，该过程耗时且成本高。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前肠膜明串珠菌肠膜亚种中不同菌株的甄别困难、过程耗时且成本高的问题，提供一种肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别方法。

本发明提供了一种肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取待测的肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的基因组DNA；

(2)以菌株样品的基因组DNA为模板，使用SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果实现待测的肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别。

本发明通过对扩增片段的检测即可实现对肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别，所扩增区域在不同菌株之间表现出高度变异性，每个菌株所扩增出的片段是不同的，每个特定的菌株与其扩增出的片段序列之间是一一对应的。该方法为肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株之间的甄别提供了一种高效的分子生物学方法，保障具有优良特性的肠膜明串珠菌专利菌株在食品中的应用。

进一步的，步骤(2)中使用的引物是根据GH70糖基转移酶编码基因设计得到的。

本发明甄别方法中使用的引物是根据GH70糖基转移酶编码基因中高度保守的GH70结构域编码区设计成的，该引物对其高度变异的区域进行扩增，对其高度变异的区域进行扩增，得出不同的特异性扩增片段。

进一步的，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为：2ng/μl DNA模板2μl、0.5μmol/L引物1μl、0.2mmol/L dNTP 2μl、1.5mmol/L的MgSO₄1μl、10×PCR反应缓冲液2μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.5μl，加水至20μl。

进一步的，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸120s，35个循环；72℃延伸10min。

进一步的，步骤(3)中，取PCR扩增产物5μL在1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，使用EB染色，电泳结果在紫外凝胶成像系统上拍照。

进一步的，该方法还包括以下步骤：对PCR扩增产物进行双向测序，获得整个扩增片段的序列。通过对扩增所得的片段进行测序及随后的序列比对分析来实现肠膜明串珠菌在肠膜亚种水平上的鉴定及甄别。

进一步的，双向测序所用的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，将两条引物测序结果进行拼接后，获得整个扩增片段的序列。

进一步的，对扩增片段的序列进行BLAST分析，将待测的肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株甄别出来。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明.

本发明的有益效果为：本发明的方法能对肠膜明串珠菌肠膜亚种实现菌株水平的鉴定和甄别，通过对单个基因片段的扩增及测序来实现这些高度相似的菌株之间的甄别；可用于对食品及益生菌制剂中的肠膜明串珠菌菌株的快速、简便的鉴定及甄别，从而防止一些具有优良特性的专利菌株被盗用，保障新的菌种资源在食品及益生菌制剂领域的应用。

附图说明

图1为本发明肠膜明串珠菌肠膜亚种甄别方法中的基因gtf1的示意图；

图2为本发明使用的引物对已知的肠膜明串珠菌肠膜亚种的数字PCR扩增图；

图3为本发明基于使用的引物数字扩增所得片段构建的进化树；

图4为本发明基于基因组序列构建的进化树；

图5为本发明待测菌株亚种不同菌株的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1

用于肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株甄别方法中的引物设计及其验证：

对已有的肠膜明串珠菌基因组序列(各菌株及其基因组序列提取码见附表1)进行比较分析，鉴定出一个普遍存在的GH70糖基转移酶编码基因，将其命名为gtf1。gtf1基因上包含两段编码GH70结构域的高度保守的碱基序列，在这两段高度保守的序列之间，有一段高度变异的序列，该段序列在不同菌株中表现出高度多态性(polymorphism)。

表1肠膜明串珠菌全基因组信息

gtf1基因及其编码产物的示意图如附图1所示，我们通过在高度保守的GH70编码区域设计引物实现对中央高度变异的区域进行扩增，通过扩增产物的序列测定实现对菌株的鉴定。

根据表1中所示的各基因组序列信息，对各菌株中GH70编码区DNA序列进行比对分析，在此基础上设计具有一定简并度的通用引物。

上游引物：5'-AAAATYAMASAATGGTC-3'(SEQ ID No.1)

下游引物：5'-AAGTAACGYAAHTKRCC-3'(SEQ ID No.2)

使用上述引物，以数字PCR(in silico PCR)扩增的方法对肠膜明串珠菌肠膜亚种菌株进行数字扩增，结果如附图2所示，菌株DSM20484没有得到特异性条带，为阴性对照组；菌株KM20是与肠膜明串珠菌相近的菌种柠檬明串珠菌的标准菌株，菌株KM20研究得比较成熟，这里用作对照；各菌株扩增出来的片段长度如表2所示。对数字扩增所得的片段进行比对分析，构建进化树(如附图3所示)，所得结果与基于基因组序列的进化关系相似，基于基因组序列的进化树如附图4所示。上述结果显示，四株肠膜明串珠菌肠膜亚种能和相近菌株区分开来。因此，利用该对引物对肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株进行甄别是可行的。

表2

实施例2

甄别高度相似的肠膜明串珠菌菌株的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以本实验室的肠膜明串珠菌BD1710和BD3749(均已被鉴定为肠膜明串珠菌肠膜亚种)为待测菌，对待测试菌株进行基因组DNA抽提，所得DNA作为模板进行PCR扩增。

(2)以从上述菌株提取的待测基因组DNA为模板，PCR扩增反应体系如下：2ng/μl DNA模板2μl、0.5μmol/L引物1μl、0.2mmol/L dNTP 2μl、1.5mmol/L的MgSO₄1μl、10×PCR反应缓冲液2μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.5μl。

(3)PCR扩增的反应参数：95℃预变性10min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸15min，4℃保存。

(4)琼脂糖凝胶电泳：将得到的PCR扩增产物5μl于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，电泳结果在紫外凝胶成像系统上拍照。所得结果见附图5。从图5可以看出，本发明所提供的特异性检测引物能扩增出肠膜明串珠菌，对待试的两株肠膜明串珠菌均能扩增出特异性条带。对于待测的两个菌株，由于其gtf1基因中央可变区系列差异足够大，扩增出的片段大小有明显差异，从图5所示的电泳结果即可进行区分。

实施例3

对某些菌株，其扩增产物长度相似或者在长度上的差别不足以提供准确的鉴定，还需要对扩增所得片段进行测序分析。

对实施例2中步骤(3)中得到的PCR扩增产物进行DNA测序，分别以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行双向测序，所得结果进行拼接。拼接完成的序列进行BLAST比对分析，结果显示，两株待测菌扩增所得的片段仅在33％覆盖率的序列上有68％的相似度(即33％Coverage，68％Identity)，如此大的差异足以实现这两个待测菌株之间的甄别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种肠膜明串珠菌肠膜亚种不同菌株的甄别方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaatyamas aatggtc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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