逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法与流程

文档序号:12097559阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法,通过以下步骤完成:

1) 克隆PCV2 Cap基因,与杆状病毒表面展示载体连接,CAGG启动子与eGFP的连接,并与表面展示载体相连,获得重组转移载体;

2) 重组转移载体通过Tn7 转座获得重组杆状病毒Bacmid 载体;

3) 重组Bacmid 用脂质体方法转染昆虫细胞,收集培养物上清,获得重组杆状病毒,观察细胞病变并提取病毒DNA 做PCR 鉴定;

4) 重组杆状病毒感染昆虫细胞,收集细胞做Western blot 分析和共聚焦显微镜分析;

5) 重组杆状病毒做补体拮抗活性检测。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤1) 中猪PCV2 Cap基因的序列为序列表中的SEQ ID NO:1;其对应的猪PCV2 Cap的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤1) eGFP基因的序列为序列表中的SEQ ID NO:2;其对应的eGFP氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤1) 中eGFP基因的表达受CAGG启动子的控制。

5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤2) 中Bacmid 载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组;所述的步骤3) 中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。

6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤4) 中Western blot 分析的步骤为:收集病毒感染的昆虫细胞,用细胞裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合,煮沸10min 后吸取上清做SDS-PAGE 电泳;将PVDF 膜浸泡在100%甲醇中,10s 后,移至蒸馏水洗涤5min,最后置转印缓冲液中,混匀10min ;蛋白质电泳结束后,利用电转仪将蛋白质转印在PVDF 膜上;将转印好的PVDF 膜以含50g/L 脱脂牛乳室温封闭1h,以洗涤缓冲液清洗3 次;用稀释的His 标签鼠单克隆抗体4℃下摇床孵育过夜,隔日以适量洗涤液清洗3 次;加入稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG 抗体,室温下摇床作用1h 后,以适量洗涤液清洗3 次;用蒸馏水清洗,取出PVDF 膜,稍晾干,暗房进行化学发光反应(ECL),等量ECL 试剂I:II = 1:1,覆盖在PVDF 膜上反应1min 后,进行X 光显影分析。

7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤4) 中共聚焦显微镜分析的步骤为:在6孔培养板中放入无菌载玻片,细胞先接种于无菌之载玻片上,细胞接入量为每孔加入1×106;细胞吸附1h后,吸弃培养基,加入重组病毒在MOI=10下感染;48h后吸弃培养基,再添加1mL 的甲醇:丙酮= 1:1的混合液于―20℃冰箱下固定5min,之后再加入1mL PBS 缓冲液摇床转速50r/min 清洗2次,每次5min ;以1mL 的20mL/L 牛血清白蛋白在37℃下反应30min ;加入1mL PBS 缓冲液摇床转速50r/min 清洗3 次, 每次5min ;接下来加入His 抗体(1:100) 在37℃下反应1h,以标定表面展示的Cap;加入1mL PBS 缓冲液摇床转速50r/min 清洗3 次后,再加入FITC标记的兔抗鼠IgG(1:100)37℃下反应1h ;加入1mL PBS 缓冲液摇床转速50r/min 清洗3 次后,在共聚焦显微镜下观察,展示蛋白的细胞膜会被FITC 染色而呈现绿色荧光;

所述的步骤5) 中补体拮抗活性检测的方法为:采健康猪前腔静脉血分离血清,血清分为两份:一份经过56℃灭活30min,另一份不灭活;将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min,然后利用终点稀释法测定其病毒滴度;病毒存活率为未灭活处理组/ 灭活处理组。

8.一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体,其特征在于,其是由权利要求1-7项中任意一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体在制备动物疫苗中的运用。

10.根据权利要求9所述的运用,其特征在于,所述动物为猪。

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