逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PCV2Cap蛋白重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法。
背景技术：
：杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒，可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白，制备疫苗。研究发现，在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值，对细胞毒性小，转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因，哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰，表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此，杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体，用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体，具有巨大潜力，日益受到人们的关注。杆状病毒能够进入哺乳动物体内的某些细胞，但是在这些细胞内不能进行复制。研究人员利用这个特点将其改造为一个携带基因的工具，并进行一定的修饰加工，将其改造成定向携带的载体，携带基因、药物到达指定的部位。但是，杆状病毒对机体来说毕竟是一个异类，机体对它有免疫作用，这不利于病毒进入指定部位，为了解决这个问题，就在杆状病毒基因内部引入了补体抑制分子，补体抑制分子的引入能够抑制机体对重组病毒的免疫应答，使杆状病毒重组体在传输过程中经过血清时被消灭的危险。CAGG启动子，它是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒（thecytomegalovirus，CMV)早期增强子（earlyenhancerelement）和鸡β-肌动蛋白（chickenbeta-actin）启动子组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。它不仅比CMV启动子活性高，而且具有广谱的宿主范围，所以加入到载体上能诱导更强蛋白表达。猪圆环病毒(PCV，Porcinecircovirus)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrorne，PMWS）的主要病原，是一种消耗性疾病，够引起机体的免疫抑制，其抗原蛋白主要是Cap蛋白，通过酵母双杂交已经发现其可以与MKRN1、gClqR、Par-4、NAPl、NPMl和Hsp40发生相互作用，gC1qR是C1q球头部的一种免疫受体蛋白，而C1q是补体系统中C1复合物的第一个成分，它在固有免疫中发挥至关重要的作用，参与宿主细胞的防御。有文献报道gClqR的配体-补体因子ClqB也可与Cap蛋白互作由此，推测：Cap、ClqB和gClqR很可能形成一个三元复合物发挥功能。C1QBP是补体系统中一个重要调控蛋白，之前通过免疫共沉淀证明了PCV2Cap蛋白与C1QBP之间可以相互作用。C1QBP高度表达在活化的血小板上，部分参与了激活补体过程。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法。本发明具体通过以下技术方案实现：一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：1)克隆PCV2Cap基因，与杆状病毒表面展示载体连接，CAGG启动子与eGFP的连接，并与表面展示载体相连，获得重组转移载体；2)重组转移载体通过Tn7转座获得重组杆状病毒Bacmid载体；3)重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒DNA做PCR鉴定；4)重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Westernblot分析和共聚焦显微镜分析；5)重组杆状病毒做补体拮抗活性检测。所述的步骤1)中猪PCV2Cap基因的序列为序列表中的SEQIDNO:1；其对应的猪PCV2Cap的氨基酸序列为SEQIDNO:3。所述的步骤1)eGFP基因的序列为序列表中的SEQIDNO:2；其对应的eGFP氨基酸序列为SEQIDNO:4。所述的步骤1)中eGFP基因的表达受CAGG启动子的控制。所述的步骤2)中Bacmid载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组。所述的步骤3)中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。所述的步骤4)中Westernblot分析的步骤为：收集病毒感染的昆虫细胞，用细胞裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合，煮沸10min后吸取上清做SDS-PAGE电泳；将PVDF膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min；蛋白质电泳结束后，利用电转仪将蛋白质转印在PVDF膜上；将转印好的PVDF膜以含50g/L脱脂牛乳室温封闭1h，以洗涤缓冲液清洗3次；用稀释的His标签鼠单克隆抗体4℃下摇床孵育过夜，隔日以适量洗涤液清洗3次；加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温下摇床作用1h后，以适量洗涤液清洗3次；用蒸馏水清洗，取出PVDF膜，稍晾干，暗房进行化学发光反应(ECL)，等量ECL试剂I:II＝1:1，覆盖在PVDF膜上反应1min后，进行X光显影分析。所述的步骤4)中共聚焦显微镜分析的步骤为：在6孔培养板中放入无菌载玻片，细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1×106；细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组病毒在MOI＝10下感染；48h后吸弃培养基，再添加1mL的甲醇：丙酮＝1:1的混合液于―20℃冰箱下固定5min，之后再加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗2次，每次5min；以1mL的20mL/L牛血清白蛋白在37℃下反应30min；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次,每次5min；接下来加入His抗体(1:100)在37℃下反应1h，以标定表面展示的Cap；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，再加入FITC标记的兔抗鼠IgG(1:100)37℃下反应1h；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被FITC染色而呈现绿色荧光。所述的步骤5)中补体拮抗活性检测的方法为：采健康猪前腔静脉血分离血清，血清分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活；将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度；病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明的一个优点在于，利用展示的Cap提高对血清补体的拮抗能力，而且有利于与抗原呈递细胞的结合提高免疫效力的拮抗能力；本发明的另一个优点在于，CAGG启动子的高效转导能力。附图说明从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：图1.重组杆状病毒转移载体结构示意图。图2.WesternBlot分析Cap蛋白表达结果图。图3.共聚焦显微镜分析Cap在细胞中的位置结果图，其中，A代表自然光图片，B代表FITC荧光图片，C代表叠加图片。图4.重组病毒对血清补体灭活的拮抗作用结果图。图5.重组杆状病毒感染Sf9细胞后的eGFP表达情况。具体实施方式以下通过实施例及附图来进一步阐明本发明的表面展示猪Cap重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备。以下实施例只是举例说明来帮助本领域的技术人员进一步理解，但不限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明构思的前提下可进行修改和改进。实施例11.杆状病毒表面展示载体的构建及验证以PCV2病毒DNA提取物为模板，以Cap-F和Cap-R为引物扩增Cap基因（如SEQIDNo：1所示），并加上NheI，SacI酶切位点，然后连到PFBDM带有GP64SP和GP64TM-CTD和VSVG-ED的表面展示载体骨架上得到pSur-VSVG-ED-Cap，再从TRIP-CAGG上将CAGG切下来，连到带有eGFP的载体上得到CAGG-eGFP,最后将CAGG-eGFP酶切连到pSur-VSVG-ED-Cap上得到pSur-VSVG-ED-Cap-CAGG-eGFP。本发明中所用引物序列信息如表1所示：表1引物名称引物序列（5‘-3’）Cap-FGCTAGCATGACGTATCCAAGGAGGCCap-RGAGCTCAGGGTTAAGTGGGGGGTCT2.Tn7转座获得重组杆状病毒质粒CaCl2法制备SW106(AmMultiBac)感受态细胞。当培养至OD600＝0.25，加入终浓度为0.1％的L-阿拉伯糖诱导，继续培养至OD600＝0.5，常规方法制备感受态细胞。加入pSur-VSVG-ED-Cap-CAGG-eGFP转化，32℃振荡培养8h，涂含Kan/Tet/Gm/IPTG/X-Gal的LB平板，32℃恒温培养18～24h至蓝白斑出现，挑取白斑并再次划线确认，白斑再以各基因引物PCR验证。重组杆状病毒质粒BacmidDNA转染sf9细胞(1)在6孔板中每个孔中加入sf9昆虫细胞9×105cells，培养基用2mLGrace’s昆虫完全培养基，含有双抗浓度为0.5×终浓度(50μg/mL青霉素，50μg/mL链霉素)。细胞是培养3～4d的对数生长期细胞，活力大于97％。置28℃培养箱中1h。(2)取2支1.5mLEppendorf管标为A、B，分别加入100μL无抗生素的Grace's昆虫完全培养基培养液，A管中加入5μL的重组Bacmid，混匀；B管中加入6μL脂质体转染试剂(Cellfectin)，混匀(注意脂质体是一个油脂的悬浮物，可能会沉淀，使用前颠倒管子6～8次，将其混均匀)。将A管液体倒入B管，充分混匀，置室温45min，使其形成Cellfectin-DNA混合物。(3)取已经贴壁生长良好的sf9单层细胞，弃旧培养液，用无抗生素的Grace’s昆虫完全培养基培养液洗涤1次。(4)取上述Cellfectin-DNA混合物，加入0.8mL不含抗生素的Grace's昆虫完全培养基，混合均匀。从细胞中吸出弃去清洗用的培养基，将混合均匀的脂质体和重组DNA混合物覆盖细胞，置28℃培养6h。(5)吸出弃去混合物，加入含抗生素的Grace’s昆虫完全培养基培养液继续培养，每天观察细胞形态及其荧光表现。观察到细胞病变作以下判断：①转染早期病变，25％～50％细胞直径增大或胞核充满细胞；②转染中期病变，细胞停止生长、细胞中出现囊泡、出现病毒包涵体或细胞从培养皿脱落；③转染晚期病变，细胞出现裂解。收集细胞，分析表达蛋白的情况。同时收集培养上清作为原毒种，分装，置－20℃贮存，作为下次感染sf9细胞用。重组杆状病毒的PCR鉴定取病毒的细胞培养物2mL，反复冻融3次，12000r/min离心15min，取上清437.5μL，加入12.5μL蛋白酶K(20mg/mL)和50μLSDS液(10％)，37℃水浴30min；等体积酚/氯仿抽提一次，取上清；等体积氯仿复提，取上清；加入1/10体积NaAc(2mol/L)和2倍体积无水乙醇，在－20℃放置2h；在4℃以15000r/min离心15min，取沉淀；70％乙醇洗涤一次，沉淀用30μLTE溶液溶解，即为提取的DNA，置－70℃保存备用。以重组杆状病毒DNA为模板，用通用引物扩增目的基因。重组杆状病毒增殖和终点稀释法测定病毒滴度将重组杆状病毒置入悬浮培养于含有100mL/L胎牛血清的Grace培养基的昆虫细胞sf9。病毒感染昆虫细胞后会自动繁衍出病毒子代并释放至培养基之中，感染3～4d后收集上清液便完成病毒量扩增的过程。悬浮培养昆虫细胞待细胞浓度达1×106cells/mL，以MOI＝1(Multiplicityofinfection，MOI)的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒会在宿主昆虫细胞中复制达到病毒量放大的目的。感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液。病毒浓度是利用终点稀释法(End-pointdilutionmethod)。重组蛋白的Westernblot分析SDS-PAGE电泳：12％分离胶，5％浓缩胶将PVDF膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min。蛋白质电泳结束后，利用Westernblot将蛋白质转印在以甲醇浸润过的PVDF膜上，在350mA转印2.5h。将转印好的PVDF膜以含50g/L脱脂牛乳1×PBS液封闭，以阻断非特异抗原抗体的反应。室温下作用1h，以洗涤缓冲液(1.0g/LTween20inPBSBuffer)10min/次清洗3次。下面加抗体孵育。每个反应分别加入经1×PBSBuffer(含1.0g/L脱脂牛乳)适当稀释的一抗4℃下摇床感作过夜，隔日以适量洗涤液10min/次清洗3次。洗去非特异的结合。接着加入经1×PBS液(含1.0g/L脱脂牛乳)适当稀释的二抗，如HRP标记兔抗猪抗体，于室温下摇床作用1h后，以适量洗涤液10min/次清洗3次。最后用蒸馏水清洗，取出PVDF膜，稍晾干，暗房进行化学发光反应(ECL)，等量ECL试剂I:II＝1:1，覆盖在PVDF膜上反应1min后，进行X光显影分析。共聚焦显微镜分析重组蛋白在sf9细胞膜上的表现(1)在6孔培养板中放入无菌载玻片，细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量每孔加入1×106。(2)细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组病毒在MOI＝10下感染。(3)2d后吸弃培养基，再添加1mL之methanol/acetone(1:1)甲醇丙酮于―20℃冰箱下固定5min，之后再加入1mLPBS(phosphate-bufferedsaline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。(4)接着以1mL的20mL/LBSA(bovineserumalbumin)在37℃下反应30min。(5)之后再加入1mLPBS(phosphate-bufferedsaline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。(6)接下来加入His抗体(1:100)在37℃下反应1h，以标定表达的圆环病毒囊膜蛋白。(7)以1mL之PBS清洗3次后，再加入FITC标记的兔抗鼠IgG(1:100Sigma)37℃下反应1h。(8)最后再以1mL之PBS清洗3次。在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被FITC染色而呈现绿色荧光。抑制补体活性检测采取健康猪血清分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活。将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度。病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。上述检测的结果如下：1)重组杆状病毒载体的构建及观察重组杆状病毒载体pSur-VSVG-ED-Cap-CAGG-eGFP。(图1)是穿梭载体，在特定的大肠埃希菌SW106Bac内能复制，也能进入sf9细胞中复制产生重组病毒，同时表达外源基因蛋白。用专用的脂质体Cellfectin将0.8μg的pSur-VSVG-ED-Cap-CAGG-eGFP转染昆虫sf9细胞。转染即开始观察转染细胞的CPE变化：细胞直径明显增大，细胞内因出现囊泡及病毒包涵体而颗粒增多，部分细胞裂解、死亡。说明在转染过程中，重组BacmidpSur-VSVG-ED-Cap-CAGG-eGFP通过脂质体介导，已经与杆状病毒DNA在昆虫细胞内发生同源重组，产生了具有感染活性的重组杆状病毒。2)Westernblot分析为了证明Cap的表达，进行Westernblot分析。一抗为His单克隆抗体，二抗为A549标记的兔抗猪IgG。结果可见补体抑制剂蛋白展示在昆虫细胞表面(图2)。3)共聚焦显微镜分析重组蛋白在sf9细胞膜上的表现为了证明Cap基因展示在昆虫细胞的细胞膜上，进行共聚焦显微镜分析。一抗为His单克隆抗体，二抗为A549标记的兔抗猪IgG。结果见图4，可以看到补体抑制剂蛋白展示在昆虫细胞表面(图3)。4)重组病毒经动物血清补体灭活后的病毒滴度为了检测不同重组病毒对血清补体的拮抗作用，采取健康猪血清各分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活。将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度。病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。结果表明，展示PCV2Cap蛋白的重组病毒在猪血清中存活能力最强(图4)。和BV-vsvg-ED-pFc的比较基于以上同样的方法，将猪IgG1Fc片段替换PCV2Cap片段制备得到BV-vsvg-ED-pFc，分别对二者进行了间接免疫荧光实验和重组病毒的滴度，通过终点稀释法测定重组杆状病毒的滴度分别为（如下表2所示）以0.1MOI感染Sf9细胞获得P2代病毒，观察荧光（如图5所示）。表2重组病毒的滴度Virustitletiter(Pfu/mL)BV-vsvg-ED5.13×108BV-vsvg-ED-pFc5.34×108BV-vsvg-ED-Cap5.89×108由以上试验可知，相比pFc片段，Cap能够更好的帮助杆状病毒逃逸哺乳动物血清清除。序列表<110>陕西诺威利华生物科技有限公司；中国兽医药品监察所<120>逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法<130>1<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>699<212>DNA<213>porcinecircovirus<400>1atgacgtatccaaggaggcgttaccggagaagaagacaccgccctcgcagccatcttggc60cagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgttaccgctggagaagg120aaaaatggcatcttcaacacccgcctatcccgcaccttcggatatactatcaagcgaacc180acagtcagaacgccctcctgggcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttctt240cccccaggagggggcttaaacccccgctctgtgccctttgaatactacagaataagaaag300gttaaggttgaattctggccctgctccccgatcacccagggtgacaggggagtgggctcc360agtgctgttattttagatgataactttgtaacaaaggccacagccctcacctatgacccc420tatgtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgctac480tttacccccaaacctgtcctagattccactattgattacttccaaccaaacaacaaaaga540aaccagctgtggctgagactacaaactgctggaaatgtagaccacgtaggcctcggcact600gcgttcgaaaacagtatatacgaccaggaatacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaa660ttcagagaatttaatcttaaagaccccccacttaaccat699<210>2<211>724<212>DNA<213>eGFP基因<400>2gaattcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgag60ctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgcc120acctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctgg180cccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccac240atgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcacc300atcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgac360accctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctg420gggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcag480aagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcag540ctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgac600aaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcac660atggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtac720aagt724<210>3<211>233<212>PRT<213>porcinecircovirus<400>3MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgProArg151015SerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuValHisPro202530ArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePheAsnThrArg354045LeuSerArgThrPheGlyTyrThrIleLysArgThrThrValArgThr505560ProSerTrpAlaValAspMetMetArgPheAsnIleAsnAspPheLeu65707580ProProGlyGlyGlyLeuAsnProArgSerValProPheGluTyrTyr859095ArgIleArgLysValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThr100105110GlnGlyAspArgGlyValGlySerSerAlaValIleLeuAspAspAsn115120125PheValThrLysAlaThrAlaLeuThrTyrAspProTyrValAsnTyr130135140SerSerArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyrHisSerArgTyr145150155160PheThrProLysProValLeuAspSerThrIleAspTyrPheGlnPro165170175AsnAsnLysArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrAlaGlyAsn180185190ValAspHisValGlyLeuGlyThrAlaPheGluAsnSerIleTyrAsp195200205GlnGluTyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPhe210215220AsnLeuLysAspProProLeuAsnHis225230<210>4<211>241<212>PRT<213>eGFP氨基酸序列<400>4GluPheMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValPro151015IleLeuValGluLeuAspGlyAspValAsnGlyHisLysPheSerVal202530SerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLys354045PheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuVal505560ThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHis65707580MetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrVal859095GlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArg100105110AlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeu115120125LysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeu130135140GluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGln14515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