一种化学转化制备抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷的方法与流程

本发明涉及生物杀病原菌活性物质，尤其是涉及一种化学转化制备抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷的方法。

背景技术：

齐墩果酸（Oleanolic acid）是一种天然存在的五环三萜类化合物，广泛分布于植物界，有1260余种植物中含有齐墩果酸，植物以其为苷元，通过苷元上羟基、醛基、当归酰基，以及糖基等生化修饰，形成了丰富多彩的齐墩果烷型皂苷。这些皂苷常分布于植物表皮细胞中，或多或少地起着防治外界病虫害的浸染作用，因此皂苷又有植物防御素（phytoanticipins）之称。

由于植物界皂苷结构之复杂，也决定了其抗菌活性的多样性。Stuardo等报道了奎藜（Chenopodium quinoa）竟存在87种三萜类皂甙，多数类型没有抗真菌活性,某些类型经碱热解后，5 mg/mL浓度100%抑制葡萄灰霉病菌（Botryis cinerea）分生孢子萌发； Pistelli等报道Astragalus verrucosus中含I-VI种皂甙，仅II有抗葡萄灰霉病活性，并且其乙酰化能增强其活性；Townsend等报道燕麦(Avena sativa)根含有4种三萜皂甙，以A-1含量高、抗稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）活性强，燕麦是谷类作物中少见含有皂甙的植物等。番茄叶斑真菌番茄壳针孢（Septoria lycopersici）能产生水解α番茄苷脱除葡萄糖成为β2番茄素苷的酶，减弱番茄植体内皂甙对该病原菌感染的抑制活性；燕麦禾顶囊壳菌（Gaeumannomyces graminis var avenae）能分泌一种胞外酶---燕麦素酶来脱除燕麦体内的抗菌三萜皂甙燕麦素的致毒活性，达到成功浸染燕麦的目的；而哈茨木霉菌等对皂甙物质尤为敏感，虽然该菌能感染植物的根，但不能对植物致病，主要原因是该真菌对皂甙有低或无效的脱毒能力。由此可见：无论是体外化学修饰，还是病原与寄主植物的相互作用的体内生物酶对皂甙分子中侧链糖基的转移均有可能改变皂甙抗真菌的活性。

有两类植物所含齐墩果烷型皂苷已经引起学者们的研究兴趣。一是山茶科植物，如油茶（Camellia oleifera Abel)在我国种植面积有5000多万亩，榨取茶油的茶饼粕年产约40万吨，其中有10%的混合茶皂素含量即年产高达4万吨的茶皂素，止于2013年，已有93种茶皂苷被鉴定。二是无患子（Sapindus mukorossi），其果皮含有高达其干重30%的皂苷，已经报道的无患子果皮皂苷有31种之多。Azhar等报道了2种在C3连的三糖基链常春藤皂苷；Huang等报道了5种在C3位连的三糖基链末端上连有1-2个乙酰基常春藤皂苷，2个在C3和C28位连接糖链的末端糖基上接有乙酰基的常春藤皂苷,以及1个C3位连的单糖基链和2个C3位连的三糖基链常春藤皂苷；Murgu等报道了3个在C3位和C28同时连接糖链的常春藤皂苷，4个在C3位连的三糖基链常春藤皂苷，2个在C3连的二糖基链常春藤皂苷和1个在C28位连的二糖基链常春藤皂苷；Sharma等报道了1个在C3连的三糖基链常春藤皂苷；Li等报道了具有双糖基链双乙酰基的常春藤皂苷；Zhang等报道了1种C3位连的五糖基链的常春藤皂苷和1种C3位连的六糖基链的常春藤皂苷。虽然无患子果实中含有皂苷种类较多，但所含皂苷的齐墩果烷型三萜皂苷元相对单一即为常春藤型皂苷元，主要差别在于糖链上（位置C3或C28位，种类Ara, Rha, Xyl，Glu，连接顺序，以及末端糖基上是否存在乙酰基）。正是由于这些糖链及其糖链上修饰基团的差别，不同结构的皂苷显示出十分悬殊的抗菌活性差异。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种化学转化制备抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷的方法，所制备的抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷具有杀菌活性强、环保低毒、病原不易产生抗药性、且可形成受药面防护膜等作用。

本发明的目的是这样实现的：

一种化学转化制备抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷的方法，特征是：

A、无患子果实材料：11月前后，采摘和拾取的成熟未霉烂的无患子果实，去果壳和果核，取中果皮冷藏或室温风干后保存备用；

B、粗皂苷提取：将上述保存备用的无患子的中果皮按1：5～8（w/v)的比例加60%～80%乙醇水溶液浸泡12～24 h，60～90℃水浴浸提3～10 h，滤布热过滤，残渣再反复浸提2～3次，合并滤液，滤液冷却，减压回收乙醇溶剂，浓缩获得粗皂苷提取液；

C、粗皂苷定向水解转化：对粗皂苷提取液用化学转化剂进行水解转化，得到活性齐墩果烷三糖基皂苷；

D、活性齐墩果烷三糖基皂苷的去杂：将活性齐墩果烷三糖基皂苷灌注于D101大孔树脂柱中直至穿透点，让D101大孔树脂柱吸附1～3h，用3～5倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，除去酸或碱或盐，再用3倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，获得成品：抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷。

步骤C中的定向水解转化为酸转化，化学转化剂为2 M盐酸溶液，即：在粗皂苷提取液中缓慢加入0.5～14mL的2 M盐酸溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节得到混合皂苷水溶液中盐酸的终浓度为0.05～0.7M，在60～90℃下水解12～24 h。

或，步骤C中的定向水解转化为碱转化，化学转化剂为2 M氢氧化钠溶液，即：在粗皂苷提取液中缓慢加入1～10mL的2 M氢氧化钠溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节混合皂苷水溶液中氢氧化钠的终浓度为0.1～1 M，在60～90℃下水解12～24 h。

或，步骤C中的定向水解转化为先酸后碱转化，化学转化剂为2 M盐酸溶液和2 M氢氧化钠溶液，即：在粗皂苷提取液中缓慢加入0.5～14mL的2 M盐酸溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节混合皂苷水溶液中盐酸的终浓度为0.05～0.7M，60～90℃下水解12～24 h后，再用2 M氢氧化钠溶液调节混合皂苷水溶液中氢氧化钠的终浓度为0.1～1 M，60～90℃下水解12～24 h。

或，步骤C中的定向水解转化为先碱后酸转化，化学转化剂为2 M氢氧化钠溶液和2 M盐酸溶液，即：在粗皂苷提取液中缓慢加入1～10mL的2 M氢氧化钠溶液得到混合皂苷水溶液，并用水调节混合皂苷水溶液中氢氧化钠终浓度为0.1～1 M，在60～90℃下水解12～24 h后，再用2 M盐酸溶液调节混合皂苷水溶液中盐酸终浓度为0.05～0.7M，60～90℃下水解12～24 h。

通过对步骤C中的粗皂苷提取液的化学转化，使粗皂苷提取液中的抗病原真菌活性皂苷的含量增加到原料的2.0～3.5倍，抗病原真菌活性EC50降低了50～140 mg/L。

申请人研究了无患子齐墩果烷型皂苷抗病原菌的构效关系，发现其抗菌活性有无、强弱与齐墩果烷母核上的侧链如糖基链、及糖基上的乙酰基存在着关系，并且分离鉴定出一种强抗稻瘟病菌活性齐墩果烷型皂苷即：3-O-ɑ-D-木糖-(1→3）-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖常春藤皂苷。

本发明所用的原料来源于无患子、油茶等含齐墩果烷皂苷的植物，尤其是含齐墩果烷型常春藤皂苷的无患子果实。无患子齐墩果烷型皂苷主要属于常春藤皂苷，C3位连的三糖基链末端上常连有1-2个乙酰基常春藤皂苷，C17位羧基上或连有二糖基链常春藤皂苷。通过将C3位三糖基链末端上连有的乙酰基、C17位羧基上糖基脱除，可大大提高无患子总皂苷中的抗真菌活性皂苷（C3位只连有1个三糖基，C17位只连有1个羧基）含量（详见图1）。

本发明具有如下优点：

1、通过对无患子的粗皂苷提取液的化学转化，无患子的粗皂苷提取液中抗病原真菌活性皂苷（常春藤-3-三糖基链皂苷）含量增加到原料的2.0～3.5倍，抗病原真菌活性EC50降低了50～140 mg/L；

2、对水稻稻瘟病等具有高效抗病活性。试验证明：该齐墩果烷型皂苷能有效地抑杀水稻稻瘟病菌丝生长、限制孢子萌发、阻断附着胞黑色素积累，从而达到防治稻瘟病的效果；另外该齐墩果烷型皂苷对辣椒枯萎病、小麦赤霉病也有较好效果，对白地霉有一定作用；

3、环保、低毒。抗病原齐墩果烷型皂苷属于天然皂苷，仅含碳、氢、氧三种元素，因此环境相容性好；它们被用于农田环境，对人和禽畜不构成任何风险；

4、不易受病原突变而产生抗药性。某些作物含防御性物质皂苷能被某种病原产生的酶系降解而成功侵染，这是被病原侵染作物与病原长期互作进化的结果，而水稻等作物本身不产生皂苷物质，使用本外源的齐墩果烷型皂苷防治其病害，不存在长期互作的基础，因此水稻病害对该抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷难以产生抗药性；

5、该抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷具有强的起泡性，单纯使用皂苷稀醇水剂也有较好的植物表面粘附性，且该制剂具有抗紫外和可见光解能力，可较长时间驻留在被施的作物表面形成一层膜，在物理上也可起到防止病原粘附、渗透等侵染作用。

附图说明

图1为本发明的化学转化反应式；

图2为无患子果皮化学转化制备抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图作进一步详细说明本发明，但应理解本发明的范围并非仅限于这些实施例的范围。

实施例1：

1、无患子粗皂苷提取：无患子果实去果壳和果核，中果皮室温风干，称取10kg，加入70%乙醇水溶液50kg浸泡20 h,70℃水浴浸提5 h,抽滤，减压回收乙醇溶剂并浓缩获得约6kg粗皂苷提取液（备用）；

2、酸转化粗皂苷提取液：在5kg粗皂苷提取液中缓慢加入10mL的2 M盐酸溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节得到混合皂苷水溶液中盐酸的终浓度为0.1M，在80℃下水解18 h，得到活性齐墩果烷三糖基皂苷；

3、脱酸浓缩活性齐墩果烷型皂苷：将活性齐墩果烷三糖基皂苷灌注于D101大孔树脂柱中直至穿透点，让D101大孔树脂柱吸附3h，用4倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，去酸至中性，再用3倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩获得成品：抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷浸膏；

4、活性齐墩果烷型皂苷的抗病原体外活性：按提取质量稀释为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的浓度梯度，以菌丝生长速率法测定提取物对水稻稻瘟病菌、辣椒枯萎病菌、白地霉菌等菌丝体生长的抑制率。其结果如下表1：

实施例2：

1、无患子粗皂苷提取：无患子果实,去果壳和果核，中果皮室温风干，称取20kg，加入80%乙醇水溶液160kg浸泡24 h，90℃水浴浸提10 h,抽滤,减压回收乙醇溶剂并浓缩获得约8kg粗皂苷提取液（备用）；

2、碱转化粗皂苷提取液：在5kg粗皂苷提取液中缓慢加入10mL的2 M氢氧化钠溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节混合皂苷水溶液中氢氧化钠的终浓度为0.5 M，在90℃下水解24 h，得到活性齐墩果烷三糖基皂苷；

3、脱碱浓缩活性齐墩果烷型皂苷：将活性齐墩果烷三糖基皂苷灌注于D101大孔树脂柱中直至穿透点，让D101大孔树脂柱吸附5h，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，除去酸或碱或盐，再用3倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，获得成品：抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷浸膏；

4、活性齐墩果烷型皂苷的抗病原体外活性：按提取质量稀释为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的浓度梯度，以菌丝生长速率法测定提取物对水稻稻瘟病菌、辣椒枯萎病菌、白地霉菌等菌丝体生长的抑制率。其结果如下表2：

实施例3：

1、无患子粗皂苷提取：无患子果实,去果壳和果核，中果皮室温风干，称取6kg，加入60%乙醇水溶液30kg浸泡12h，60℃浸提3h,抽滤，减压回收乙醇溶剂并浓缩获得约4kg粗皂苷提取液（备用）；

2、先酸后碱转化粗皂苷提取液：在4kg粗皂苷提取液中缓慢加入0.5mL的2 M盐酸溶液，得到混合皂苷水溶液，并用水调节混合皂苷水溶液中盐酸的终浓度为0.1M，60℃下水解12 h后，再用2 M氢氧化钠溶液调节混合皂苷水溶液中氢氧化钠的终浓度为0.5 M，60℃下水解12 h，得到活性齐墩果烷三糖基皂苷；

3、脱盐碱浓缩活性齐墩果烷三糖基皂苷：将活性齐墩果烷三糖基皂苷灌注于D101大孔树脂柱中直至穿透点，让D101大孔树脂柱吸附1h，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，除去酸或碱或盐，再用3倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，获得成品：抗病原菌活性齐墩果烷型皂苷浸膏；

4、活性齐墩果烷型皂苷的抗病原体外活性：按提取质量稀释为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的浓度梯度，以菌丝生长速率法测定提取物对水稻稻瘟病菌、辣椒枯萎病菌、白地霉菌等菌丝体生长的抑制率。其结果如下表3：