本发明涉及一种噻唑类化合物，尤其涉及一种新型噻唑类化合物XQH-3-7及其在抗变形链球菌及抑制其生物膜形成中的应用。该化合物可以抑制口腔中牙周细菌的生长，可用于防治龋齿，属于口腔疾病防治药物制备技术领域。
背景技术：
相比于浮游(planktonic)的生长方式，绝大多数的细菌在自然环境中更倾向于采取生物膜(biofilm)的方式进行生长。所谓的生物膜(也被称之为生物被膜)是指细菌利用自身分泌的大分子胞外基质将自身细胞包裹起来并附着于有生命或无生命物体表面的一类高度组织化的细胞群体。生物膜中存在大分子物质包括蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。人体口腔中也存在着大量的微生物，他们利用口腔中残留的碳水化合物和唾液以生物膜的形式寄居在人体牙齿的表面。正常情况下，口腔中的微生物在牙齿表面处于一种相对稳定的生理平衡状态，一旦这种平衡被打破就会引发龋齿(Selwitz et al.,2007)。
龋齿俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌诱发的可导致牙釉质、牙本质脱矿分解的慢性疾病。该病发病率高、涉猎范围广，尤其是在青少年和儿童中比较常见。龋齿患者对冷热酸甜等刺激变得异常敏感并伴随着疼痛(Fejerskov and Kidd,2009)。严重者会引发牙髓病、根尖病等一系列并发症，甚至失去整个牙齿进而影响身体健康和生活质量。龋齿现已成为严重危害人类身体健康的主要口腔疾病之一(Pitts,2004)。在龋齿的形成过程中，变形链球菌(Streptococcus mutans)起着至关重要的作用。
变形链球菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是人体口腔中主要的致龋齿菌之一。变形链球菌不仅可以通过代谢产生大量的酸性物质腐蚀牙釉质，而且能够通过产生葡聚糖转移酶将口腔内残留的蔗糖转变为葡聚糖。葡聚糖粘附到牙齿后很难被清除，并且能够选择性地吸附口腔中其他细菌，形成菌斑。菌斑中的细菌代谢产生酸性产物长期作用于牙齿会使牙齿脱矿产生齿洞，久而久之便会形成龋齿(Lemos et al.,2013)。
因此，寻找能够抑制变形链球菌浮游细胞和生物膜形成的新型化合物将有助于人们开发新的预防龋病的治疗措施及相关药物。
技术实现要素：
针对现有技术的需求，本发明的目的是提供一种新型噻唑类化合物XQH-3-7及其在抗变形链球菌及抑制其生物膜形成中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7，其特征在于：该化合物化学分子式为C16H17N5O4S2，中文名称为N-(5-硝基噻唑-2-基)-1-(苯基甲硫酰胺)哌啶-4-甲酰胺，英文名称为N-(3-bromophenyl)-4-(2-((5-nitrothiazol-2-yl)amino)-2-oxoethyl)piperazine-1-carboxamide，分子量为391.47，其化学结构如式(1)所示：
上述化合物易溶于二甲基亚砜(DMSO)，难溶于水。
上述化合物XQH-3-7的合成路线见如下反应式：
其中：(a)HOBT，EDCI，三乙胺，室温；(b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液，室温；(d)三光气，无水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，无水四氢呋喃，0℃到室温。根据常用的标准干燥方法干燥所用到的各种溶剂。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株的浮游细胞药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株生物膜的形成药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备口腔变形链球菌(Streptococcus mutans)生物膜抑制剂中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备防治龋齿的靶向药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7作为抑菌添加成分在制备牙膏、漱口水或消毒液中的应用。
测试时用DMSO将化合物XQH-3-7溶解，配成终浓度为1024mg/L的母液贮存。
本发明测定了化合物XQH-3-7对变形链球菌模式菌株和临床菌株的抑制效果。
结果显示，化合物XQH-3-7对浮游状态下的变形链球菌具有很好的抑菌活性和杀菌活性，其对变形链球菌UA159菌株的最小抑菌浓度为4mg/L，最小杀菌浓度为32mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为0.918mg/L。当培养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为96.62％。化合物XQH-3-7对变形链球菌6715-13菌株的最小抑菌浓度为4mg/L，最小杀菌浓度为32mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为0.546mg/L。当培养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链球菌6715-13菌株生物膜的抑制率为96.18％。
其中，所使用的变形链球菌UA159菌株为模式菌株，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的参考基因组编号为NC_004350。本发明所使用的变形链球菌6715-13菌株为临床菌株，分离自患有龋齿病人的口腔当中。其最适的培养基优选脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2)，最适的培养条件优选厌氧，37℃静置培养。
本发明公开的噻唑类化合物XQH-3-7分子量小、结构相对简单，抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够显著抑制变形链球菌浮游细胞和生物膜的形成，具有预防龋病的潜力，有望作为预防龋齿的新型靶向候选药物。
具体实施方式
下面结合本发明提供的一种新型噻唑类化合物XQH-3-7进一步描述其在杀伤、抑制变形链球菌浮游细胞及其生物膜形成过程中的应用。所述内容是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：化合物XQH-3-7的制备
化合物XQH-3-7的合成路线见如下反应式：
其中：(a)HOBT，EDCI，三乙胺，室温；(b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液，室温；(d)三光气，无水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，无水四氢呋喃，0℃到室温。根据常用的标准干燥方法干燥所用到的各种溶剂。
具体反应过程描述如下：
(1)中间体4-叔丁基-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰-1-羧酸(1)的制备。
将1-Boc-4-哌啶甲酸(1eq)溶解于N,N二甲基甲酰胺，再分别加入HOBt(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，滴加三乙胺(1.2eq)。滴加完毕，再加入5-硝基2-氨基噻唑(1.2eq)，在常温下反应过夜，向反应液中加200ml的蒸馏水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×200ml)，合并有机相用饱和NaCl洗两次(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，然后用旋转蒸发仪蒸发浓缩得粗品。粗品经硅胶色谱柱柱纯化分离(二氯甲烷:甲醇＝v:v，200:1)得到黄色固体，产率75％。
(2)中间体2-(4-氨基-1-基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺(2)的制备
将乙酰氯慢慢滴入无水乙醇中(v:v,4:5)，生成HCl和乙酸乙酯，再将上一步中间体溶于其中,在常温下搅拌15分钟，用TLC检测反应完全，蒸干溶剂，得黄色固体，粗产品产率100％，未经处理直接进行下一步。
(3)N-(5-硝基噻唑-2-基-)-1-(苯基甲酰巯基)哌啶-4-酰(XQH-3-7)的制备
在0℃将中间体3(1eq)和三乙胺(1.2eq)溶解于无水四氢呋喃中，再逐滴滴加苯基异硫氰酸酯(1.2eq)，搅拌3h，用TLC检测反应，蒸出四氢呋喃，向反应液中加50ml的蒸馏水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×50ml)，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗两次(2×50ml)，无水硫酸镁干燥30分钟，然后经真空蒸发浓缩得粗品。粗品经硅胶色谱柱(200-300目)纯化分离，(二氯甲烷:甲醇＝v:v,50:1)作为洗脱剂，得到类白色固体，产率61％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ13.19(s,1H),9.31(s,1H),8.64(s,1H),7.29(d,J＝6.0Hz,4H),7.10(d,J＝2.6Hz,1H),4.72(d,J＝13.3Hz,2H),3.20(t,J＝11.7Hz,2H),2.92(t,J＝12.9Hz,1H),1.94(d,J＝11.2Hz,2H),1.74-1.60(m,2H).ppm；ESI-MS:390.1[M-H].
实施例2：变形链球菌的准备
(1)培养变形链球菌的培养基为脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(品牌OXOID，货号CM1135)，培养基主要成分为Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2。如需配置成固体，需要添加琼脂粉15g/L。115℃灭菌30min，冷却后待用。
(2)培养变形链球菌生物膜的培养基为脑心浸液-蔗糖培养基，即在脑心浸液培养基中添加终浓度为1％的蔗糖。蔗糖需事先配成20％贮存液并用0.22μm的无菌滤器过滤除菌。
(3)用无菌接种环将变形链球菌模式菌株UA159和分离自龋齿病人口腔中的变形链球菌菌株6715-13在含有脑心浸液琼脂固体培养基的平板上进行划线，倒置于37℃的厌氧培养箱中培养直至出现明显的单菌落。
(4)用无菌的接种铲刮取变形链球菌UA159和6715-13菌株，分别转接到装有脑心浸液液体培养基的试管中，在37℃的厌氧培养箱中静置，培养至液体浑浊。
(5)用紫外可见分光光度计检测变形链球菌在600nm下的吸光度值(OD600nm)。
(6)用分析天平精确称量化合物XQH-3-7，加入DMSO将其溶解，然后用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌，配成终浓度为1024mg/L的贮存液，存放于-20℃待用。
实施例3：化合物XQH-3-7对变形链球菌浮游细胞的活性检测
(1)按照实施例2中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-7，将培养制对数期的变形链球菌UA159和6715-13菌液(OD600nm＝0.8～1.0)用脑心浸液培养基稀释至终浓度为5×105cfu/ml待用。
(2)采用微量肉汤稀释法检测化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游细胞的最小抑菌浓度。即将倍比稀释后不同浓度的化合物XQH-3-7溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔为加药液的实验组，第12孔为不加药作为生长对照组，每个孔中变形链球菌菌液终浓度为5×105cfu/ml，此时，第1孔至第12孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0μg/ml。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度定位最小抑菌浓度(MIC)。
(3)将小孔内的菌液均匀涂布到脑心浸液琼脂固体培养基上后，在37℃厌氧培养箱中倒置培养24小时，以没有细菌生产的最低浓度定位最小杀菌浓度(MBC)。
(4)用酶标仪检测每个小孔内在600nm下的吸光度值，计算每个药物浓度条件下细胞的抑制率，计算公式为抑制率＝(1-实验组/生长对照组)×100％，所得数据使用SPSS统计软件计算半数最大抑制浓度(IC50)，实验结果如表1所示。
表1.化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游细胞的活性检测
MIC：最小抑菌浓度；MBC：最小杀菌浓度；IC50：半数最大抑制浓度
从表1我们可以看出，化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游细胞具有很好的抑菌活性和杀伤活性。化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159浮游细胞的活性要明显好于变形链球菌6715-13。
实施例4：化合物XQH-3-7对变形链球菌生物膜的抑制活性
(1)按照实施例2和3中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-7，用脑心浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变形链球菌稀释至终浓度为5×105cfu/ml待用。
(2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液150μl，并以加入化合物XQH-3-7的孔(终浓度4mg/L)作为实验组，以不加化合物XQH-3-7的孔作为对照组。放于37℃厌氧培养箱中静置培养40小时。
(3)将每个孔中的浮游细胞移走，并用大量的水冲洗未吸附的细胞。
(4)向每个孔中加入0.1％的结晶紫溶液200μl，在室温的条件下静置5min进行染色，然后移除结晶紫溶液，并用大量水冲洗掉除去未吸附的结晶紫。
(5)向每个孔中加入33％的乙酸溶液200μl溶解吸附的结晶紫，然后使用酶标仪检测590nm下的吸光度值，计算生物膜的抑制率，计算公式同实施例1。
结果显示，当培养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为96.62％，对变形链球菌6715-13菌株生物膜的抑制率为96.18％。