本发明属于基因工程
技术领域：
，特别涉及一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法。
背景技术：
：糖尿病是人体营养代谢障碍导致的内分泌疾病，以持续高血糖为其基本生化特征，因胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用，以及胰岛素供给不足，使蛋白质、脂肪和单糖转化失调，导致患者的水、电解质代写紊乱的全身性疾病。分为ⅰ型糖尿病和ⅱ型糖尿病。ⅱ型糖尿病是最常见的一类，多发于成年人。目前，区别于之前完全使用药物治疗的单一方式，2015年，采用药物和保健复合治疗的糖尿病患者人数比2012年增加了一倍，2015年的中国糖尿病保健品市场比2012年增加了3倍多。垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitaryadenylatecyclaseactivitingpoly-peptidepacap）是miyata等于1989年在寻找新的下丘脑促激素时从羊下丘脑发现的神经肽，因其对大鼠垂体细胞腺苷酸环化酶（ac）的高激活作用而得名，包括pacap38和pacap27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与pacap38的n末端1～27个氨基酸残基完全相同。此两种多肽广泛分布于许多动物的下丘脑、中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织内肝脏、肾脏、胰腺、呼吸系统和消化系统等组织或系统中，其中肾上腺含量最高，并具有多种生物活性。垂体腺苷酸环化酶激活肽（pacap）及其受体在这些组织或系统中，通过ca2+、na+、腺苷酸环化酶或磷酸肌醇等作用通路，pacap发挥神经递质/调质、更发挥着神经营养因子等生物学功能。pacap不仅是一种新的下丘脑促垂体激素，还是一种新的神经递质和神经调质，pacap通过作用于pacap受体，激活腺苷酸环化酶，进而引起初细胞内camp水平的增高。此外，它在某些类型细胞的旁分泌和自分泌调节中也发挥作用。近年来有研究表明，pacap能够通过促进胰岛素分泌，刺激胰岛β细胞增生、阻止胰岛β细胞凋亡、抑制胰高血糖素的释放、抑制胃肠蠕动和胃液分泌、延迟胃排空、产生饱胀感和食欲下降等多重途径来控制血糖。但是，pacap自身稳定性差，造成体内半衰期短。技术实现要素：为了克服现有pacap天然结构稳定性差存在的体内半衰期短的不足，本发明提供一种步骤合理、易于操作的具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法，该方法通过点突变获得一种pacap类似物，以达到与pacap类似的辅助降血糖功能。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：（1）、基因设计与合成全合成点突变后的pacap类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点；其中，上述类似物基因序列如下：5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；（2）、酶切将步骤（1）中合成得到的pacap类似物基因和pgex-6p-1载体分别采用bamhⅰ和ecorⅰ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用2～4h；（3）、连接将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用promeg公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；（4）、转化将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌xl1-blue，挑取单克隆并测序；（5）、原核表达将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌bl21（de3），挑取菌落，接种体积为10mllb液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500mllb液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80l发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待od600≈0.4～0.6，向其中加入iptg至终浓度为0.2～0.4mm，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s；再用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的sds溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心30～60s，取上清液，即得pacap多肽类似物的原核表达粗产物；（6）、凝胶过滤将步骤（5）中得到的pacap多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得pacap多肽类似物的原核表达产物。本发明先是根据pacap基因以及对基因中重要位点的分析，设计出既具有降糖活性，又能延长半衰期的pacap类似物，采用全合成的方法获得该种类似物的基因，通过扩增克隆入表达载体进行原核表达，获得了pacap多肽类似物。本发明采用基因合成的方法，免去了基因突变的可能性，为后续步骤提供了前提；其所采用了pgex-6p-1载体，因为pgex载体带有一个tac起动子，可作诱导表达用，可以适用于任何大肠杆菌，可以用温和的洗脱条件从亲和介质上洗脱下来，最大限度地减少对抗活性的损伤；其所采用bl21菌种，用于高效表达克隆。本发明采用原核表达的方法获取pacap多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的pacap多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用，可用于后期加工利用，其具有广阔的市场前景。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法，其经过下列工艺步骤：（1）、基因设计与合成全合成点突变后的pacap类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点；其中，上述类似物基因序列如下：5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；（2）、酶切将步骤（1）中合成得到的pacap类似物基因和pgex-6p-1载体分别采用bamhⅰ和ecorⅰ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用3h；（3）、连接将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用promeg公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；（4）、转化将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌xl1-blue，挑取单克隆并测序；（5）、原核表达将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌bl21（de3），挑取菌落，接种体积为10mllb液体培养基，37℃振荡培养10h；将10ml菌液加入到500mllb液体培养基中，37℃振荡培养10h；将500ml菌液接种至60l发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待od600≈0.5，向其中加入iptg至终浓度为0.3mm，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心45s；再用发酵液体积15%的、浓度为1%的sds溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心45s，取上清液，即得pacap多肽类似物的原核表达粗产物；（6）、凝胶过滤将步骤（5）中得到的pacap多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得pacap多肽类似物的原核表达产物。本实施例采用原核表达的方法获取pacap多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的pacap多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用，可用于后期加工利用，其具有广阔的市场前景。实施例2一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：（1）、基因设计与合成全合成点突变后的pacap类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点；其中，上述类似物基因序列如下：5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；（2）、酶切将步骤（1）中合成得到的pacap类似物基因和pgex-6p-1载体分别采用bamhⅰ和ecorⅰ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用4h；（3）、连接将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用promeg公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；（4）、转化将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌xl1-blue，挑取单克隆并测序；（5）、原核表达将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌bl21（de3），挑取菌落，接种体积为10mllb液体培养基，37℃振荡培养12h；将10ml菌液加入到500mllb液体培养基中，37℃振荡培养12h；将500ml菌液接种至80l发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待od600≈0.6，向其中加入iptg至终浓度为0.4mm，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心60s；再用发酵液体积20%的、浓度为1%的sds溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心60s，取上清液，即得pacap多肽类似物的原核表达粗产物；（6）、凝胶过滤将步骤（5）中得到的pacap多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得pacap多肽类似物的原核表达产物。本实施采用原核表达的方法获取pacap多肽类似物的原核表达产物，技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的pacap多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用。实施例3一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：（1）、基因设计与合成全合成点突变后的pacap类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点；其中，上述类似物基因序列如下：5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；（2）、酶切将步骤（1）中合成得到的pacap类似物基因和pgex-6p-1载体分别采用bamhⅰ和ecorⅰ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用2h；（3）、连接将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用promeg公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；（4）、转化将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌xl1-blue，挑取单克隆并测序；（5）、原核表达将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌bl21（de3），挑取菌落，接种体积为10mllb液体培养基，37℃振荡培养8h；将10ml菌液加入到500mllb液体培养基中，37℃振荡培养8h；将500ml菌液接种至50l发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待od600≈0.4，向其中加入iptg至终浓度为0.2mm，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30s；再用发酵液体积10%的、浓度为1%的sds溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心30s，取上清液，即得pacap多肽类似物的原核表达粗产物；（6）、凝胶过滤将步骤（5）中得到的pacap多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得pacap多肽类似物的原核表达产物。本实施采用原核表达的方法获取pacap多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的pacap多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用。本发明利用实施例1获得的pacap多肽类似物对糖尿病小鼠血糖的影响作用进行测定，其具体结果如下：组别n实验前实验后正常对照组103.72±1.213.69±0.90糖尿病对照组1025.72±5.1123.25±3.32实验组1025.44±5.6118.05±3.27#试验结果表明，本发明所得多肽类似物对实验性糖尿病小鼠具有显著的降糖作用。#与实验前相比p<0.01。当前第1页12