一种利用基因对流感病毒进行分型的方法与流程

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种利用基因对流感病毒进行分型的方法。

背景技术：

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，传染性较强，临床上以高热、乏力、头痛、全身酸痛等症状为主，常周期性的引发世界范围内的流行或大流行。流感病毒有三种类型：甲型(A型)流感病毒感染哺乳动物以及鸟类；乙型(B型)流感病毒只感染人类，疾病的产生通常较甲型病毒温和；丙型(C型)流感病毒只感染人类，并不会引起严重的疾病。从传染规模来看，甲型流感常引起爆发流行，甚至是世界大流行，约2～3年发生小流行1次，根据世界上已发生的4次大流行情况分析，一般10～15年发生一次大流行。乙型流感呈爆发或小流行，丙型以散发为主。

流感的临床症状与普通感冒相似，但流感发病迅速，传染性强，而病毒自身对现有药物的耐药性不断增强，疫苗保护作用有限，因此病原体的快速确诊对疾病的预防和早期治疗具有重大意义卫生部颁布的流行性感冒诊断标准指出，鉴别诊断主要依靠病原学、特异核酸检查和血清抗体测定。但是依靠病毒分离培养、血清学诊断以及抗原检测等经典方法费时费力，难以适应疫情爆发时快速诊断的需要。而PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等优点，广泛应用于病原体检测，是目前公认的病原体鉴别诊断的有效方法之一。准确鉴别流感病毒类型，对于监测流感活动及流行动态，并对流感病毒的变异作出预警，对于流感的防控具有重大意义，同时对临床一线医生在诊治过程具有一定的指导意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对现有流感病毒检测所存在的上述不足而提供一种利用基因对流感病毒进行分型的方法，该方法能通过PCR和一代测序对甲型和乙型流感病毒进行基因分型。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来解决:

一种利用基因对流感病毒进行分型的方法,包括如下步骤：

步骤S1、病毒RNA提取；

步骤S2、将病毒RNA逆转录为cDNA；

步骤S3、利用特异性引物进行PCR扩增；

步骤S4、回收PCR扩增产物；

步骤S5、对所述回收产物进行测序；

步骤S6、将测序结果与公共数据库中已知序列进行比较，将未知病毒划分至对应的类别。

在本发明的一个优选实施例中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示。

本发明的方法跟传统的基于血清学检测的方法相比，基于PCR原理的核酸检测方法检测效率更高、更为快速便捷，在突发传染病应急工作中将会发挥巨大作用。

附图说明

图1为本发明模板-PCB产物加量示意图。

图2为本发明模板-拷贝数示意图。

图3和图4为本发明样品类型示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

1、病毒RNA提取

1.1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol 1ml，充分混匀，室温放置10min，保证病毒外壳充分裂解；

1.2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置10min(由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心)；

1.3、12000g室温离心15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)；

1.4、加入500ul异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；

1.5、4℃，10000g离心10min，离心完毕可见管底白色沉淀，即为RNA，用枪小心吸去所有上清；

1.6、加入1ml 75％乙醇，让RNA沉淀悬起来，4℃，7500g离心5min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min；

1.7、加入适量DEPC处理水。

1.8、建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。

2、将病毒RNA逆转录为cDNA

2.1在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

模板RNA：总RNA 1-3μg

引物：Oligo(dT)(50uM) 1μl

dNTP Mix(10mmol/L) 1μl

2.2加RNase free dH2O至10μl，混匀后65℃孵育5min，结束后迅速冰浴。

2.3在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

加RNase free dH2O至20μl轻轻混匀后。

2.4反应混合物42℃30-60min。

2.5在95℃加热5min结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。

3、引物设计

本专利为了提高检测效率，根据流感病毒的基质蛋白(M)基因和血凝素(HA)基因以及神经氨酸酶(NA)分别设计引物进行扩增，这些引物由上海派森诺生物科技有限公司合成，引物序列如下：

4.PCR扩增：对病毒cDNA进行PCR扩增，得到待测的基因片段

扩增体系和程序如下：

在0.2ml离心管中加入以下成分：

轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：

反应完成后，取3ulPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。

5、PCR产物的回收

PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：

5.1在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量。

5.2加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化。

5.3加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

5.4将混合液，转移到DNA制备管12,000×g离心1min。弃滤液。

5.5将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

5.6将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2，12,000×g离心1min。

5.7将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。

5.8将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

6、一代测序

利用基于Sanger双脱氧链终止法的技术进行一代测序，所用测序仪为ABI3730xl。

7、序列比对，划分流感病毒类型

将测序得到的序列在NCBI数据库进行比对，将未知病毒划分至对应的类别。

序列表 ( SEQUENCE LISTING )

<110＞周有 良

胡春凌 王海涛 陈峰

汪朝晖

<120＞丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法

<160> 8

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTTGCTCYTTYTCTATCTT

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TCATCATATCCCANGCCAT

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTTTTTTTTT-ACTAGGGACGGCAAAC

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TTTTTTTTTT-AGAACAACGCCTCCC

<210> 5

<2 11> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

TTTTTTTTTT-AGAACACCAGTAAGAG

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TTTTTTTTTT-AGCTAGTCTAGGGTG

<210>7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

TTTTTTTTTT-GTCTGGTCTAGAGCACA

<210> 8

<2 11> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

TTTTTTTTTT-GGCTCTTACCTACG