HPV检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种HPV检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：人类乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，简称HPV)是一种DNA病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。目前约有170种类型的HPV可被辨别出来。HPV具高度宿主专一性之特性，会感染人类的皮肤及黏膜，而人类皮肤黏膜细胞，于正常情况下的细胞核应是大小一致，若受到HPV感染，其细胞核会变大而且形状不一，导致细胞产生变性，发生癌前变化。其中若反覆感染某些高危险性型别，则可能发展成为侵袭性癌症。HPV的L1蛋白为HPV的主要结构蛋白，L2蛋白为次要结构蛋白，每个病毒含72个由L1、L2组成的壳蛋白单位，而每个壳蛋白单位由5个位于外围的L1蛋白合一个位于中心的L2蛋白构成。Ll蛋白分子量约55KDa，在不同HPV型别中高度保守，是主要的属特异性抗原。HPV的感染普遍流行于全世界，并经研究统计得知目前高达99.7％的子宫颈癌是因感染HPV所造成的。HPV可区分为低危险型包括:6、11、41、42、43、44、54、61等型，以及高危险型包括:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等型，其中感染高危险型的患者，约有三分之一会形成子宫颈癌前病变，如不进行治疗或未被检测发现则可能演变成子宫颈癌。HPV能够入侵不成熟的子宫颈上皮细胞中作用，将体内进行调控及修补DNA受损的功能破坏，目前已知约有40种HPV型会感染肛门及生殖区的皮肤及黏膜，称为生殖器类型病毒。正常的子宫颈被HPV感染后，大部份人能自动清除，但病毒停留于体内超过一年则可能引起细胞异常或轻度癌症病灶，可藉由子宫颈抹片检查适时发现并积极治疗，反之若没有定期追踪检查，病灶则可能癌化进而罹癌。在子宫颈癌形成之前会有一段病变期，一开始子宫颈癌的前期病变为子宫颈上皮内赘生， 其又可分为轻度病变(CIN1)、中度病变(CIN2)及高度病变(CIN3)，若已有CIN的人再感染致癌型HPV，则发展成高度CIN或子宫颈癌的机率会特别高。在高度病变和侵犯性子宫颈癌的子宫颈分泌物检体中，有80％至90％的机率可侦测到HPVDNA的存在，且子宫颈在癌化过程中，一般是从CIN1进展到CIN2、CIN3，再演变成子宫颈癌，但并非所有子宫颈癌都是从CIN1开始，其与感染的HPV型别及宿主个人因素有关。目前市售的HPV检验试剂组与方法包括荧光定量PCR法、核酸杂交捕获法、基因芯片法等，皆尚存在缺点待改良，尤其是可进行检测得知有无但却无法一次性辨识所有分型，在临床上能协助医师诊断的资讯有限。此外，现有技术大部分仍是机器读取得检测结果，无法结合使用影像辨识系统读取并以软体系统分析，以取得检测结果与试剂组的完整信息。技术实现要素：基于此，有必要提供一种能够结合影像辨识系统读取并以相应软件分析的HPV检测试剂盒及检测方法。一种HPV检测试剂盒，包括微载体、检测探针及扩增引物；所述微载体至少有一种，所述微载体具有编码信息，且针对不同HPV亚型的所述微载体的编码信息不同；所述检测探针选自：针对HPV6亚型的序列为SEQIDNo.1的寡核苷酸探针、针对HPV11亚型的序列为SEQIDNo.2的寡核苷酸探针、针对HPV16亚型的序列为SEQIDNo.3的寡核苷酸探针、针对HPV18亚型的序列为SEQIDNo.4的寡核苷酸探针、针对HPV26亚型的序列为SEQIDNo.5的寡核苷酸探针、针对HPV31亚型的序列为SEQIDNo.6的寡核苷酸探针、针对HPV33亚型的序列为SEQIDNo.7的寡核苷酸探针、针对HPV35亚型的序列为SEQIDNo.8的寡核苷酸探针、针对HPV39亚型的序列为SEQIDNo.9的寡核苷酸探针、针对HPV40亚型的序列为SEQIDNo.10的寡核苷酸探针、针对HPV42亚型的序列为SEQIDNo.11的寡核苷酸探针、针对HPV43亚型的序列为SEQIDNo.12的寡核苷酸探针、针对HPV44亚型的序列为SEQIDNo.13的寡核苷酸探针、 针对HPV45亚型的序列为SEQIDNo.14的寡核苷酸探针、针对HPV51亚型的序列为SEQIDNo.15的寡核苷酸探针、针对HPV52亚型的序列为SEQIDNo.16的寡核苷酸探针、针对HPV53亚型的序列为SEQIDNo.17的寡核苷酸探针、针对HPV54亚型的序列为SEQIDNo.18的寡核苷酸探针、针对HPV55亚型的序列为SEQIDNo.19的寡核苷酸探针、针对HPV56亚型的序列为SEQIDNo.20的寡核苷酸探针、针对HPV58亚型的序列为SEQIDNo.21的寡核苷酸探针、针对HPV59亚型的序列为SEQIDNo.22的寡核苷酸探针、针对HPV61亚型的序列为SEQIDNo.23的寡核苷酸探针、针对HPV66亚型的序列为SEQIDNo.24的寡核苷酸探针、针对HPV68亚型的序列为SEQIDNo.25的寡核苷酸探针、针对HPV70亚型的序列为SEQIDNo.26的寡核苷酸探针、针对HPV73亚型的序列为SEQIDNo.27的寡核苷酸探针、针对HPV81亚型的序列为SEQIDNo.28的寡核苷酸探针、针对HPV82亚型的序列为SEQIDNo.29的寡核苷酸探针以及针对HPV83亚型的序列为SEQIDNo.30的寡核苷酸探针中的至少一种；且所述检测探针包覆对应的HPV亚型的微载体；所述扩增引物与所述检测探针对应，所述扩增引物包括选自：针对HPV6亚型、HPV11亚型、HPV16亚型、HPV18亚型、HPV26亚型、HPV31亚型、HPV33亚型、HPV35亚型、HPV39亚型、HPV40亚型、HPV42亚型、HPV43亚型、HPV44亚型、HPV45亚型、HPV51亚型、HPV52亚型、HPV53亚型、HPV54亚型、HPV55亚型、HPV56亚型、HPV58亚型、HPV59亚型、HPV61亚型、HPV66亚型、HPV68亚型、HPV70亚型、HPV73亚型、HPV81亚型、HPV82亚型以及HPV83亚型中的至少一种HPV亚型的保守区序列设计的上游引物和下游引物，且所述下游引物的5’端连接有标记物。在其中一个实施例中，所述检测探针包括序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.30的30种寡核苷酸探针，所述上游引物包括序列为SEQIDNo.33～SEQIDNo.50的18种上游引物，所述下游引物包括序列为SEQIDNo.51～SEQIDNo.61的11种下游引物。在其中一个实施例中，所述微载体的表面经羧化作用处理，所述检测探针的5’端连接有氨基，所述微载体与所述检测探针通过活化羧基与氨基反应结合。在其中一个实施例中，所述检测探针还包括序列为SEQIDNo.31的寡核苷酸探针和序列为SEQIDNo.32的寡核苷酸探针中的至少一种。在其中一个实施例中，所述扩增引物还包括序列为SEQIDNo.62的上游引物和序列为SEQIDNo.63的下游引物。在其中一个实施例中，所述扩增引物还包括序列为SEQIDNo.64的上游引物和序列为SEQIDNo.65的下游引物。一种HPV检测方法，使用上述任一实施例所述的HPV检测试剂盒，所述HPV检测方法包括如下步骤：对待测样本使用所述扩增引物进行PCR扩增，得到扩增产物；对所述扩增产物进行变性处理；于多孔板的微孔中加入微载体及变性处理后的扩增产物进行杂交反应，所述微载体的表面包覆有所述检测探针，且对应每种所述HPV亚型，所述微载体的编码信息与所述检测探针一一对应；向所述微孔中加入能够与所述标记物相结合的荧光标记物，使扩增产物5’端的标记物与该荧光标记物反应结合；清洗所述多孔板后，使用影像识别系统辨识所述微载体的编码信息，并检测对应的标记信号，经分析处理得到检测结果。在其中一个实施例中，所述HPV检测方法还包括将HPV阳性标准品和阴性标准品加入至所述微孔中，进行与所述待测样本同样操作的阳性对照实验和阴性对照实验的步骤。在其中一个实施例中，所述标记物为生物素，所述荧光标记物为链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白；所述检测对应的标记信号是使用荧光亮度检测组件检测并量化所述微载体上的荧光信号。在其中一个实施例中，所述影像识别系统为PlexBio100；所述分析处理是使用PlexBio100的软件系统DeXipher进行分析处理。上述HPV检测试剂盒及检测方法具有如下有益效果：(1).可用于检测多达30种亚型的HPV；(2).当HPV检测试剂盒中的微载体、寡核苷酸探针及对应的扩增引物有 多种时，该HPV检测试剂盒可同时检测多种HPV亚型，无需多次检测，可减少所需样本量并可有效提高检测效率；(3).多元检测以多重筛检技术及结合多元化生医检测系统可增加临床精准度与简便性；(4).影像辨识系统结合软体分析可取得大量且完整的检测结果与试剂组信息。附图说明图1为微载体、检测探针及目的序列结合的示意图；图2为HPV检测方法的实验流程示意图。具体实施方式以下主要结合附图及具体实施例对本发明的HPV检测试剂盒及检测方法作进一步详细的说明。如图1所示，本发明一实施方式的HPV检测试剂盒包括微载体、检测探针及扩增引物。微载体(Microcarrier)上设有用于供影像识别系统辨识的编码信息，并且其表面设有修饰层，如物理修饰层或化学修饰层，优选化学修饰层。其中化学修饰层可以但不限于经由羧化作用处理形成的修饰层。对于经羧化作用处理的微载体可藉EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)活化羧基进行反应，将带有氨基的专一性探针结合于微载体表面，形成探针包覆的微载体。微载体具有磁性，可以用磁性元件将其吸附在反应容器中。微载体容量高，可作为多元载体。当检测样本有多种时，微载体可以针对性的设计为多种。在本实施方式中，微载体至少有一种，且针对不同HPV亚型的微载体的编码信息不同。检测探针包覆在微载体。不同的检测探针对应包覆具有不同编码信息的微载体。检测探针可与微载体通过物理作用或化学作用连接。对于化学作用连接的，可以在检测探针的5’端连接捕获基团。捕获基团与微载体表面的化学修饰 层对应，可以与微载体共价结合。在一实施方式中，捕获基团如可以为氨基等，氨基可以与微载体表面的活化羧基反应结合。在本实施方式的HPV检测试剂盒中，检测探针直接包覆在微载体的表面制成微载体试剂，也即微载体预先包覆有检测探针，且对应每种HPV亚型，检测探针与微载体一一对应，当有多种检测探针时，多种包覆有检测探针的不同微载体混合制成混合制剂。采用直接包覆的方式，无需在检测时进行包覆，从而可以简化检测过程，提高检测效率。如下表1所示，本实施方式的检测探针可以选自：针对HPV6亚型的序列为SEQIDNo.1的寡核苷酸探针、针对HPV11亚型的序列为SEQIDNo.2的寡核苷酸探针、针对HPV16亚型的序列为SEQIDNo.3的寡核苷酸探针、针对HPV18亚型的序列为SEQIDNo.4的寡核苷酸探针、针对HPV26亚型的序列为SEQIDNo.5的寡核苷酸探针、针对HPV31亚型的序列为SEQIDNo.6的寡核苷酸探针、针对HPV33亚型的序列为SEQIDNo.7的寡核苷酸探针、针对HPV35亚型的序列为SEQIDNo.8的寡核苷酸探针、针对HPV39亚型的序列为SEQIDNo.9的寡核苷酸探针、针对HPV40亚型的序列为SEQIDNo.10的寡核苷酸探针、针对HPV42亚型的序列为SEQIDNo.11的寡核苷酸探针、针对HPV43亚型的序列为SEQIDNo.12的寡核苷酸探针、针对HPV44亚型的序列为SEQIDNo.13的寡核苷酸探针、针对HPV45亚型的序列为SEQIDNo.14的寡核苷酸探针、针对HPV51亚型的序列为SEQIDNo.15的寡核苷酸探针、针对HPV52亚型的序列为SEQIDNo.16的寡核苷酸探针、针对HPV53亚型的序列为SEQIDNo.17的寡核苷酸探针、针对HPV54亚型的序列为SEQIDNo.18的寡核苷酸探针、针对HPV55亚型的序列为SEQIDNo.19的寡核苷酸探针、针对HPV56亚型的序列为SEQIDNo.20的寡核苷酸探针、针对HPV58亚型的序列为SEQIDNo.21的寡核苷酸探针、针对HPV59亚型的序列为SEQIDNo.22的寡核苷酸探针、针对HPV61亚型的序列为SEQIDNo.23的寡核苷酸探针、针对HPV66亚型的序列为SEQIDNo.24的寡核苷酸探针、针对HPV68亚型的序列为SEQIDNo.25的寡核苷酸探针、针对HPV70亚型的序列为SEQIDNo.26的寡核苷酸探针、针对HPV73亚型的序列为SEQIDNo.27的寡核苷酸探针、针对HPV81亚型的序列为SEQIDNo.28的寡核苷酸探针、针对HPV82亚型的 序列为SEQIDNo.29的寡核苷酸探针以及针对HPV83亚型的序列为SEQIDNo.30的寡核苷酸探针中的至少一种。优选的，检测探针包括序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.30的30种寡核苷酸探针。进一步优选的，检测探针还包括序列为SEQIDNo.31的寡核苷酸探针和序列为SEQIDNo.32的寡核苷酸探针中的至少一种。表1检测探针的序列设计(依次对应序列表中SEQIDNo.1～SEQIDNo.32)HPV亚型序列HPV-Type065'-ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCT-3'HPV-Type115'-ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCA-3'HPV-Type165'-GCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACT-3'HPV-Type185'-CTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTA-3'HPV-Type265'-ATTATCTGCAGCATCTGCATCCACTCCATT-3'HPV-Type315'-AATTGCAAACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGT-3'HPV-Type335'-ATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC-3'HPV-Type355'-CTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA-3'HPV-Type395'-CTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTACATATGATCCTTCT-3'HPV-Type405'-CACACAGTCCCCCACACCAACCCCATATAATAAC-3'HPV-Type425'-CACTGCAACATCTGGTGATACATATACAGCTGCT-3'HPV-Type435'-GACCCTACTGAGCCCAGTACACATGACAATGCA-3'HPV-Type445'-GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTACATAT-3'HPV-Type455'-ACAAAATCCTGAGCCAAGTACACATGACCCTACT-3'HPV-Type515'-CACTGCTGCGGTTTCCCCAACATTTACTCCAAGT-3'HPV-Type525'-GAGGTTAAAAAGGAAAGCACATCTAAACATGAA-3'HPV-Type535'-AACCTCACAGTCTATGTCTACATATCATTCAAAGC-3'HPV-Type545'-ACAGCATCCACGCAGGATAGCTTTAATAATTCT-3'HPV-Type555'-GCTACAACTCAGTCTCCATCTACAACATATAATAGTACA-3'HPV-Type565'-GCTACAGAACAGTTAAGTAAATATGATGCACGA-3'HPV-Type585'-CACTGAAGGAACTAAGGAAGGTACATCTAAACATGAT-3'HPV-Type595'-CTACTACTTCTTCTATTCCTAATGTATACACACCTACC-3'HPV-Type615'-GCTACATCCCCCCCTGTATCTGAATATAAAGCCA-3'HPV-Type665'-AGCTAAAAGCACATTAACTAAATATGATGCCCGT-3'HPV-Type685'-ACTACTACTGAATCAGCTGTACCAAATATTTATGATCCTA-3'HPV-Type705'-GCCTGCACCGAAACGGCCATACCTGCTGT-3'HPV-Type735'-GTGTAGGTACACAGGCTAGTAGCTCTACTACAACG-3'HPV-Type815'-ACTATTTGCACAGCTACATCTGCTGCTGC-3'HPV-Type825'-GCTGTTACACCATCTGTTGCTCAAACAATTACT-3'HPV-Type835'-GCTGCTACACAGGCTAATGAATACACAGCCTCT-3'HPV-CTL35'-GAATTATTTTTGATGGCGTTAACTC-3'HPV-ACTB5'-CATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3'注：HPV-CTL3及HPV-ACTB用于确认预先包覆的过程是否正确，HPV-CTL3及HPV-ACTB探针分别对应包覆具有相应编码信息的微载体，其中HPV-CTL3用于确认PCR试剂是否可正常反应，HPV-ACTB用确认待测样本的处理是否正确。扩增引物用于PCR扩增待测样本的目的DNA序列。扩增引物与检测探针对应。扩增引物包括上游引物和下游引物，且上游引物与下游引物的序列均针对不同的HPV亚型的保守区序列设计。下游引物的5’端连接有标记物。如下表2所示，在一实施方式中，上游引物的序列选自SEQIDNo.33～SEQIDNo.50中的至少一种，下游引物的序列选自SEQIDNo.51～SEQIDNo.61中的至少一种，且上游引物与下游引物成对设置。优选的，针对包括有30种寡核苷酸探针的检测探针，上游引物优选包括序列为SEQIDNo.33～SEQIDNo.50的18种上游引物，下游引物优选包括序列为SEQIDNo.51～SEQIDNo.61的11种下游引物。进一步优选的，扩增引物还包括序列为SEQIDNo.62的上游引物和序列为SEQIDNo.63的下游引物。针对多种HPV亚型的多种扩增引物可以混合在一起制成PCR试剂。标记物用于与荧光蛋白结合，标记物可以采用单不限于生物素(Biotin)、链霉亲和素等，若为生物素，则可选用链霉亲和素标记的荧光蛋白作为荧光标记物，如链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白等，其可高度特异性地和生物素结合使检测标记物发出荧光。表2引物的序列设计(依次对应序列表中SEQIDNo.33～SEQIDNo.63)注：引物对RF与RR是使用参考基因(人类β-actin基因)设计出的引物对，用以确认待测样本的采样、DNA萃取品质以及实验过程中是否存在处理问题，若使用者没采集到待测样本或是用错方法抽取待测样本的DNA，于PCR反应时就无法将ACTB放大。进一步，在本实施方式中，该扩增引物还包括标准引物。标准引物的序列如下表3所示。表3标准引物的序列设计(依次对应序列表中SEQIDNo.64～SEQIDNo.65)标准引物序列IF5'-CATTTAATGTTGATGAAAGC-3'IR5'-ATATCCTGATCTTCCAGATAAC-3'注：标准引物对IF与IR为内部质控(control)引物对，针对人类细胞株DNA萃取物(细胞株:HEK293，浓度:5ng/μl，为模拟正常人类细胞萃取后的DNA浓度范围内)设计，与前述HPV-CTL3对应，可以用于确认试验流程与材料的使用是否正确以及PCR反应过程是否正常执行。引物IR的5’端也连接有标记物，可使产物在进行核酸杂交后能与荧光蛋白试剂反应显色，从而可用于指示标记物与荧光蛋白是否正常反应。在一优选的实施方式中，该HPV检测试剂盒包括微载体试剂和PCR试剂，其中，微载体试剂中含有32种包覆有检测探针的微载体，对应的检测探针的序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.32；PCR试剂含有如SEQIDNo.33～SEQIDNo.65所示的33种引物序列。PCR试剂含有多种扩增引物以及PCR反应所需所有其他常规物质。可理解，在其他实施例中，针对能够检测出的HPV亚型的数量，微载体试剂和PCR试剂可以具体设计。进一步，在本实施方式中，人类乳头瘤病毒检测试剂盒还可以包括本领域技术人员常用的样本采集液、清洗试剂、杂交缓冲试剂、人类乳头瘤病毒阳性DNA标准品、人类乳头瘤病毒阴性DNA标准品及链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白(SA-PE)试剂中的至少一种。其中，阳性DNA标准品是人类细胞株DNA萃取物(细胞株:HEK293，浓度:5ng/μl，为模拟正常人类细胞萃取后的DNA浓度范围内)与含有HPV16亚型及18亚型的质粒的混合溶液；阴性DNA标准品是人类细胞株DNA萃取物(细胞株:HEK293，浓度:5ng/μl，为模拟正常人类细胞萃取后的DNA浓度范围内)，因而，在检测时，不论阳性DNA标准品还是阴性DNA标准品均会出现ACTB与CTL3阳性信号，但其中阳性DNA标准品会额外产生HPV16及18亚型的信号。此外，如图2所示，本实施方式还提供了一种HPV检测方法，该HPV检测方式使用上述HPV检测试剂盒，包括如下步骤：步骤S110，对待测样本使用扩增引物进行PCR扩增，得到扩增产物。步骤S120，对扩增产物进行变性处理。变形后可以将DNA双链解开成单链，以进行后续杂交。优选的，如可以在95℃下对扩增产物进行处理5分钟，得到变性后的扩增产物。步骤S130，于多孔板的微孔中加入微载体及变性处理后的扩增产物进行杂交反应，微载体的表面包覆有检测探针，且对应每种HPV亚型，微载体的编码信息与检测探针一一对应。多孔板可以采用诸如96微孔板等。杂交反应优选震荡反应，如在40～60℃下，以500～2000rpm震荡反应20分钟。在本实施方式中，在加入微载体及变形处理后的扩增产物之前，还包括开启震荡加热器以对震荡加热器进行预热的步骤，如可以将震荡加热器的温度设定为杂交反应所需的温度，并保温。进一步，在本实施方式中，还包括将HPV阳性标准品和阴性标准品加入至微孔中，进行与待测样本同样操作的阳性对照实验和阴性对照实验的步骤。杂交反应后，可以对多孔板进行清洗，以除去多余的杂质溶液，保证后续反应的稳定性。清洗时，使用磁性元件吸附微载体，将微载体吸附在多孔板的孔底。步骤S140，向微孔中加入能够与标记物相结合的荧光标记物，使扩增产物5’端的标记物与该荧光标记物反应结合。反应条件可以选用但不限于在30～50℃下，以500～2000rpm震荡反应10分钟在一实施方式中，标记物优选生物素，相应的，荧光标记物可以使用链霉亲和素标记的荧光蛋白，如链霉亲和素标记的藻红荧光蛋白(SA-PE)等。进一步，在本实施方式中，在对多孔板进行清洗后，并在加入荧光标记物之前，优选还包括开启震荡加热器以对震荡加热器进行预热的步骤，如将震荡加热器温度设定为反应所需的温度，并保温。步骤S150，清洗多孔板后，使用影像识别系统辨识微载体的编码信息，并检测对应的标记信号，经分析处理得到检测结果。检测对应的标记信号是使用荧光亮度检测组件检测并量化微载体上的荧光信号。优选的，在本实施方式中影像识别系统选用PlexBio100；分析处理优选使用PlexBio100的软件系统DeXipher进行分析处理。上述HPV检测试剂盒及检测方法具有如下有益效果：(1).可用于检测多达30种亚型的HPV；(2).当HPV检测试剂盒中的微载体、寡核苷酸探针及对应的扩增引物有多种时，该HPV检测试剂盒可同时检测多种HPV亚型，无需多次检测，可减少所需样本量并可有效提高检测效率；(3).多元检测以多重筛检技术及结合多元化生医检测系统可增加临床精准度与简便性；(4).影像辨识系统结合软体分析可取得大量且完整的检测结果与试剂组信息。以下为具体实施例部分实施例1实施例1的HPV检测试剂盒中微载体试剂中含有32种包覆有检测探针的微载体，对应的检测探针的序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.32；PCR试剂含有如SEQIDNo.33～SEQIDNo.65所示的33种引物序列，该HPV检测试剂盒可同时检测30种常见的HPV亚型，包括HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、66、68、70、73、81、82及83亚型。可理解，在其他实施例中，该HPV检测试剂盒也不限于用于能够同时检测30种HPV亚型，如也可以只用于检测其中的一种HPV亚型，或者其中的两种、3种……29种HPV亚型等，相应的微载体试剂盒中PCR试剂针对能够最多检测的HPV亚型的数量及类型进行设计即可。该检测方法包括如下步骤：将待测样本使用PCR试剂(PCR试剂为冻干状态，PCR试剂含所有反应所需常规物质)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR体系如下：加入250μlddH2O于PCR试剂中，各取10μl的PCR试剂与10μl的待测样本DNA，进行PCR反应。PCR反应条件如下表4所示：表4开启震荡加温器并将温度设为40～60℃，进行预热。将所得PCR产物于杂交反应前先进行DNA变性处理，使双链DNA分离，反应条件为95℃处理5分钟。于96微孔板中加入微载体试剂与杂交缓冲试剂6×SSPE，分别加入变性处理后的PCR扩增产物以及HPVDNA阳性标准品与阴性标准品，反应条件为温育40～60℃、500～2000rpm震荡反应20分钟。清洗96微孔板。改变震荡加温器反应条件，设为30～50℃，进行预热。于96微孔板中加入链霉亲和素标记之藻红荧光蛋白试剂(SA-PE)进行反应，反应条件为温育30～50℃、500～2000rpm震荡10分钟。清洗96微孔板。将操作完成的96微孔板放入影像辨识系统PlexBio100辨识微载体，并用荧光亮度检测元件分析并量化微载体上的荧光信号，最后经由PlexBio100的软件系统DeXipher进行分析计算后，输出检验试剂组信息与对应的检测结果。实施例1的检测结果如表5所示。表5HPVBeads6111616263133353940424344455152535455565859616668707381828367475270230100200004700000001032000000112366320140341820000004530000001441000000162070118103511701230000005752107056169570320001892663730130001000000000012021000000026010100641201463200000004904200333000000311965071543032140300000052030522271300100033380113005414064500000232000002020000003513506800072150000037004810002659000100397882182203096905000000043151022331220010004039710000000719200000190161101741200100042000140290540058510000000000425500000043000164800706004691059000000020850000004403101403700000023592000000020000000045960119040024590500718800200042553360009005101409701031854200179000643801000011000000052004000064300000332170900022000200053000005001000027007532000020750000005469006101180302602000001401500033000000055130016002001300000001100497308213949021000566186100013003400000012500506600058000005896038330153000000025000000428431023000005904002601194802201000278250204714665269000000615582899000375800000000209002697436040000662710003000030500000011000108443000006800030000000000000140000320674000000707235000005373000000108700123222904031000073395970013002401700001128140004000032050008141700010023000010000420021020660001236008256535700000107003800400700000000034520630400600001000000048000001570002503333注：表5中的数值是平均荧光强度(MeanFluorescenceIntensity,MFI)，以表达检测样本所检测的型别。表5所呈现的是30种待测样本，说明本发明的检测 试剂盒的确可检测30种HPV亚型。该HPV检测试剂盒及检测方法可一次性对样本进行检测，从而可以减少所需的样本量，并有效提高检测效率。该检测试剂盒及检测方法可结合多元检测以多重筛检技术及结合多元化生医检测系统，从而可以增加临床精准度与简便性。并可结合影像辨识系统及相应的软体分析，可取得大量且完整的检测结果，检测效率进一步提高。可理解，在其他实施例中，各步骤的操作参数不限于上面具体的数值，操作参数的数值以前述数值范围为准。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3