家蚕BmPEPCK‑2基因及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及家蚕BmPEPCK-2基因，还涉及家蚕BmPEPCK-2基因的应用。

背景技术：

家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。但是，家蚕却面临严重的疾病威胁，核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒(BmNPV)，该病的传染力极强并且难以控制。

由于BmNPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者一直希望找出影响家蚕对病毒抗性的关键基因，然后通过分子生物技术来提高家蚕对病毒的抗性。对影响家蚕病毒抗性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗病毒的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕BmPEPCK-2基因，还提供该基因的应用。

本发明中根据家蚕基因组序列设计引物，克隆了家蚕BmPEPCK-1/2基因，其中BmPEPCK-1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，BmPEPCK-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，通过RT-PCR和qPCR对BmPEPCK-1/2的时期组织表达情况进行了检测，证实BmPEPCK-1/2的表达量极低，BmPEPCK-2的表达量低于BmPEPCK-1。BmPEPCK-1/2都被BmNPV病毒诱导下调表达，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表达水平恢复正常而BmPEPCK-2仍然下调表达，暗示BmPEPCK-1/2可能参与了BmNPV病毒和家蚕的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也许不一样。为了研究该基因的功能，通过增量表达的方式来提高BmPEPCK-1/2的的表达量，然后感染病毒，检测病毒增殖是否受到抑制。构建了增量表达BmPEPCK-1/2的瞬时转染载体，分别转染BmE细胞，然后感染BmNPV-GFP病毒，荧光观察和qPCR检测都显示增量表达BmPEPCK-1不影响BmNPV病毒的增殖而增量表达BmPEPCK-2能够显著抑制了BmNPV病毒的增殖。说明BmPEPCK-2基因是一个影响家蚕抗性的关键基因，可以作为家蚕转基因抗病育种的靶标基因。具体应用如下：

所述家蚕BmPEPCK-2基因在培育抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品种中的应用，所述家蚕BmPEPCK-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述家蚕BmPEPCK-2基因在制备抑制家蚕核型多角体病毒增殖的药物中的应用，所述家蚕BmPEPCK-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了影响家蚕抗性的关键基因BmPEPCK的两种拼接形式的全长序列，包括CDS序列和3’UTR序列，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的主要差异在最后一个外显子和3’UTR，BmPEPCK-1/2表达量非常低，克隆非常困难；通过RT-PCR和qPCR技术对该基因的时期组织表达谱进行了检测，检测结果表明该基因的表达量非常低，而且BmPEPCK-2的表达量低于BmPEPCK-1；BmPEPCK-1/2都被BmNPV病毒诱导下调表达，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表达水平恢复正常而BmPEPCK-2仍然下调表达，暗示

BmPEPCK-1/2可能参与了BmNPV病毒和家蚕的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也许不一样。为了研究BmPEPCK-1/2的功能，以它们的CDS序列作为靶标，构建增量表达载体，转染BmE细胞，发现增量表达BmPEPCK-1不影响BmNPV病毒的增殖而增量表达BmPEPCK-2能够显著抑制BmNPV病毒的增殖，因此BmPEPCK-2基因在家蚕转基因抗病育种的研究和应用中具有重要价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为RT-PCR检测BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的时期表达情况(1-11分别为蚁蚕、一龄眠蚕、二龄起蚕、二龄眠蚕、三龄起蚕、三龄眠蚕、四龄起蚕、四龄眠蚕、五岭起蚕、熟蚕、蛹。BmPEPCK-1/2基因扩增38个循环，内参TIF-4A扩增25个循环)。

图2为qPCR技术检测BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的组织表达情况(以5龄3天家蚕幼虫各组织cDNA为模板)。

图3为BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因被BmNPV病毒诱导下调表达(A：家蚕大造品种5龄幼虫感染BmNPV后不同时间点的检测；B：BmE细胞感染BmNPV后不同时间点的检测)。

图4为增量表达BmPEPCK-1基因不能抑制BmNPV增殖(A：转染后48h RT-PCR检测BmPEPCK-1基因表达量；B：感染病毒后72h观察BmNPV病毒荧光；C：感染病毒后48h qPCR检测BmNPV病毒含量)。

图5为增量表达BmPEPCK-2基因能显著抑制BmNPV增殖(A：转染后48h RT-PCR检测BmPEPCK-2基因表达量；B：感染病毒后72h观察BmNPV病毒荧光；C：感染病毒后48h qPCR检测BmNPV病毒含量)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、克隆BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的全长序列

首先根据家蚕基因组序列设计特异引物，BmPEPCK-1全长的正向引物：5'-atgctgcattttaaaaccacccccgaaga-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物5'-gactcgtttaattttatatctttggt-3'(SEQ ID NO.2)；BmPEPCK-2全长的正向引物：5'-atgctgcattttaaggccatcccc-3'(SEQ ID NO.3)，反向引物5'-catgtgggataaataactaggaagag-3'(SEQ ID NO.4)。然后以家蚕大造5龄3天的全蚕cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸1min40秒，共33个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明我们成功克隆了BmPEPCK-1/2基因的全长序列，其中BmPEPCK-1基因全长如SEQ ID NO.5所示，BmPEPCK-2基因全长如SEQ ID NO.6所示。结果显示，BmPEPCK-1基因全长序列为1952bp，包括1914bp的CDS序列和38bp的3’UTR；BmPEPCK-2基因全长序列为1962bp，包括1926bp的CDS序列和36bp的3’UTR。生物信息学分析显示BmPEPCK-1和BmPEPCK-22都由13个外显子组成，都包含一个PEPCK结构域，这两种拼接形式的主要区别在于它们的第13外显子以及3’UTR不同。

经分析发现该基因在家蚕基因组数据库(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中没有该基因的EST序列，说明该基因表达量非常低，克隆很困难。

实施例2、BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的时期组织表达谱检测

以蚁蚕、一龄眠蚕、二龄起蚕、二龄眠蚕、三龄起蚕、三龄眠蚕、四龄起蚕、四龄眠蚕、五岭起蚕、熟蚕、蛹的cDNA作为模板，以BmPEPCK-1基因的特异引物PEPCK-1qRT(F：5'-tcaaagaggaggtaggcga-3'(SEQ ID NO.7)，R：5'-gactcgtttaattttatatctttggt-3'(SEQ ID NO.8))和BmPEPCK-2基因的特异引物PEPCK-2qRT(F：5'-tcaaagaggaggtaggcgaa-3'(SEQ ID NO.9)，R：5'-catgtgggataaataactaggaagag-3'(SEQ ID NO.10))进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共38个循环，最后72℃延伸10分钟；以家蚕看家基因TIF-4A作为内参，以其特异引物TIF-4AqRT(F：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(SEQ ID NO.11)，R：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(SEQ ID NO.12))进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25个循环，最后72℃延伸10分钟，结果如图1所示。

以家蚕5龄3天幼虫的头、脂肪体、中肠、丝腺、皮、血、马氏管、气管、卵巢以及精巢等组织的cDNA作为模板，用BmPEPCK-1基因的特异引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特异引物PEPCK-2qRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果如图2所示。

RT-PCR和qPCR的结果证明BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的表达量确实非常低，且BmPEPCK-2的表达量低于BmPEPCK-1，同时也说明我们能克隆得到该基因的全长序列确实非常不容易。

实施例3、BmNPV感染后BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的表达量检测

以半致死剂量的BmNPV病毒经口添食感染家蚕大造品种的5龄幼虫，在感染后6h、12h和24h提取感染和未感染家蚕的中肠RNA，反转成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特异引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特异引物PEPCK-2qRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，结果如图3中A所示。结果显示BmNPV感染诱导家蚕BmPEPCK-1和BmPEPCK-2下调表达，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表达水平恢复正常而BmPEPCK-2仍然下调表达。

将BmE细胞感染BmNPV病毒，在感染后0h、3h、6h、12h和24h提取RNA并反转成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特异引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特异引物PEPCK-2qRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，结果如图3中B所示。结果同样显示BmNPV感染诱导BmE细胞BmPEPCK-1/2下调表达，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表达水平恢复正常而BmPEPCK-2仍然下调表达。

上述检测结果显示BmNPV病毒诱导BmPEPCK-1/2下调表达，而且诱导模式有一定的差异，暗示BmPEPCK-1/2可能参与了BmNPV病毒和家蚕的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也许有所不同。

实施例4、构建增量表达载体1180-hr3-A4P-BmPEPCK-1-SV40和1180-hr3-A4P-BmPEPCK-2-SV40

为了研究该基因的功能，通过增量表达方式来提高BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的表达量，然后再观察病毒增殖是否有变化，从而证明该基因的功能。

以BmPEPCK-1基因的CDS序列作为靶标，设计增量表达引物，上游引物为PEPCK-1oe-F：5'-ggatccatgctgcattttaaaaccacccccgaaga-3'(SEQ ID NO.13)，下游引物为PEPCK-1oe-R：5'-gcggccgcttaggcttgtatgttcttcctcaac-3'(SEQ ID NO.14)，以克隆的BmPEPCK-1基因的全长序列质粒为模板进行PCR扩增；以BmPEPCK-2基因的CDS序列作为靶标，设计增量表达引物，上游引物为PEPCK-2oe-F：5'-ggatccatgctgcattttaaggccatcccc-3'(SEQ ID NO.15)，下游引物为PEPCK-2oe-R：5'-gcggccgcctaatttaaagcttggccttgtatg-3'(SEQ ID NO.16)，以克隆的BmPEPCK-2基因的全长序列质粒为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸1min40秒，共29个循环，最后72℃延伸10分钟；对扩增出的目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。

将上一步测序验证成功的质粒用BamH I和Not I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得BmPEPCK-1酶切片段和BmPEPCK-2酶切片段；同时用BamH I和Not I双酶切已经包含Hr3增强子、家蚕肌动蛋白Actin 4启动子(A4P)和SV40终止信号序列的1180载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得1180-hr3-A4P-SV40酶切片段，将BmPEPCK-1和BmPEPCK-2分别和1180-hr3-A4P-SV40酶切片段进行连接转化，使BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因分别替换pb-HEAG载体的hycu-ep32基因序列(pb-HEAG载体见蒋亮博士毕业论文《基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制研究》，2013)。筛选阳性克隆，得到1180-hr3-A4P-BmPEPCK-1-SV40载体(PEPCK-1OE)和1180-hr3-A4P-BmPEPCK-2-SV40载体(PEPCK-2OE)。

实施例5、检测增量表达BmPEPCK-1/2对BmNPV增殖的影响

将PEPCK-1OE、PEPCK-2OE和对照1180空载的质粒分别转染进BmE细胞，在转染后48h后提取RNA并反转录成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特异引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特异引物PEPCK-2qRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，结果如图4中A和图5中A所示。结果显示BmPEPCK-1和BmPEPCK-2都增量表达成功。

在转染后48h感染带有绿色荧光标记的BmNPV-GFP病毒，在感染病毒后48h提取DNA，以BmNPV病毒GP41基因的特异引物GP41qRT(F：5'-cgtagtagtagtaatcgccgc-3'(SEQ ID NO.17)，R：5'-agtcgagtcgcgtcgcttt-3'(SEQ ID NO.18))进行qPCR检测，以家蚕看家基因BmGAPDH作为内参，其特异检测引物为BmGAPDHqRT(F：5’-ccgcgtccctgttgctaat-3’(SEQ ID NO.19)，R：5’-ctgcctccttgaccttttgc-3’(SEQ ID NO.20))，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果如图4中C和图5中C所示。qPCR检测结果显示转染PEPCK-1OE的细胞不能显著降低BmNPV病毒含量，而转染PEPCK-2OE的细胞能够显著抑制病毒增殖，其BmNPV含量仅为对照的5％。

在感染病毒后72h观察荧光，结果如图4中B和图5中B所示。结果发现转染PEPCK-1OE的细胞中病毒荧光没有明显减少，而转染PEPCK-2OE的细胞中几乎看不见病毒荧光，表明增量表达BmPEPCK-2显著抑制了BmNPV的增殖。

上述结果表明，增量表达BmPEPCK-1不能抑制BmNPV病毒的增殖但增量表达BmPEPCK-2能够显著抑制病毒的增殖，表明BmPEPCK基因的这两种拼接形式具有不同的生物学功能，BmPEPCK-2基因是一个影响家蚕抗性的关键基因，可以作为家蚕转基因抗病育种的靶标基因，用于今后的分子育种工作中。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 西南大学；

<120> 家蚕BmPEPCK-2基因及其应用

<160> 20

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1正向引物

<400> 1

atgctgcatt ttaaaaccac ccccgaaga 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1反向引物

<400> 2

gactcgttta attttatatc tttggt 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2正向引物

<400> 3

atgctgcatt ttaaggccat cccc 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2反向引物

<400> 4

catgtgggat aaataactag gaagag 26

<210> 5

<211> 1952

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1基因序列

<400> 5

atgctgcatt ttaaaaccac ccccgaagac tacgtgagga agacggcaca atgtgctcaa 60

gtggcgattg gatgcagccg cgctgcccac caaactgctc tgcgagggtc gacgaagcct 120

tccccacagc tggccactct tactccaaag gtccgcgcgt tcgtggagcg cagcgctgct 180

ctgtgccagc cggagcacgt gcacgtgtgc gacggctccg agacagaggc gagggcgctg 240

ctacagctga tgcagcagca gaccaccctc aaacgactgc cccaatacga taactgttgg 300

ttggcccgga cagacccggc agacgttgcc cgggttgaat cccgcacgtt catatgctcc 360

gatcgggaga gcgacgtggt cccctcggct cgcgccggcc agaagtccgc cctggggaac 420

tacatctccc ccccggatta cgagaaggcc gtgtccgaca gattccctgg ttgtatgaaa 480

ggacgcacaa tgtacgtgat accattctcg atgggtcctg tgggatctcc tctctcgaag 540

atcggcgtag aaatcacgga ttcgccttac gtggtttatt ctatgcgagt catgactaga 600

attggagcga aggttctaga aattctacgt caagacgagc agttcgttcg ttgtcttcac 660

gcagtcggct ccggtggcac tccgggttgg ccctgcgacc ctaagaacac catcatactc 720

cacaagccgg ctgagaacga gatcgtaagc tacggcagtg gatacggcgg caatagtttg 780

ttgggcaaga agtgcttcgc tctacgtctg ggatcagtga tcgctcgtcg cgaaggatgg 840

ctggccgaac atatgcttat cgtcggcata accaaccctc aaggtaagaa gcgctacatc 900

gctgccgctt ttccttcagc ttgcgggaaa acgaaccttg ccatgatgac gccaacactg 960

cccgggtaca aagtagagtg cgtgggggac gacatagcct ggatgaagtt cgacaaggac 1020

ggcgtactcc gggccattaa cccggaaaac gggttctttg gagttgcacc aggtacgtca 1080

gccgctacga atccgatagc aatggcgacg gtgttcaaaa acaccgtgtt cactaacgtg 1140

gcggaaacac ctgagggtgg ggtgtggtgg gaaggcatgg gaccagctcc ggagcgcctc 1200

gtcgactgga aaggtcaacc ctgggacccc agcaagaaaa ctccggctgc acatccaaat 1260

tccagattct gcaccccggc agagcagtgt cccatgatag acggtgagtg ggagagctcg 1320

gagggtgtgc cgatatccgc catcctgctg ggcggcagac ggccggccgg cgtaccgctc 1380

gtagtcgagt cgcgggactg gcagcacggc gtgttcatgg gagcttccat gaggtccgag 1440

gccacggccg ccgccgaaca cagcggtaaa atggtgatgc acgatccgtt tgcgatgcgt 1500

ccgttcttcg gctacaactt cggcgactac ctgaagcact ggctgtcgat gccgcagcct 1560

ggacgaaaca tgcccaagat cttccacgtc aactggttcc gtaaagatga acagggtaag 1620

ttcctctggc ccggtttcgg cgagaactct cgggtcttag actggatctt gcgtcgctgc 1680

gacggggagc cctgccacgc cgagactcca ctggggtaca taccgagagc cggtgctctg 1740

aatacggaaa acctaagcgc tgtcgacatg aacgagctgt tcagcatacc taaagacttt 1800

tggctgcagg agtctgacgc catcgagaag tacttcaaag aggaggtagg cgaagatcta 1860

cccaacgaaa tgtgggacga attgaacaag ttgaggaaga acatacaagc ctaagcttta 1920

aattagacca aagatataaa attaaacgag tc 1952

<210> 6

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2基因序列

<400> 6

atgctgcatt ttaaggccat ccccgaagac tacgtgagga agacggcaca atgtgctcaa 60

gtggcgattg gatgcagccg cgccgcccac caaactgctc tgcgagggtc gacgaagcct 120

tccccacagc tgaccactct cactccaaag gttcgcgcgt tcgtggagcg cagcgctgct 180

ctgtgccagc cggagcacgt gcacgtgtgc gacggctccg agacagaggc gagggccctg 240

ctacagctga tgcagcagca gaccaccctc aaacgactgc ccaaatacga taactgttgg 300

ttggcccgga cagacccggc agacgttgcc cgggttgaat cccgcacgtt catatgctcc 360

gatcgggaga gcgacgtggt cccctcggct cgcgccggcc agaagtccgc cctggggaac 420

tacatctccc ccccggatta cgagaaggcc gtgtccgaca gattccctgg ttgcatgaga 480

ggtcgcacaa tgtacgtgat accgttctcg atgggccctg tgggatctcc tctctcgaag 540

attggtgtag aaatcacgga ttcgccttac gtggtttttt ctatgcgagt catgactaga 600

attggagcga aggttctaga tattctacgt caagacgagc agtttgttca ttgtcttcac 660

gcagtcggat ccggtggcac tccgggctgg ccctgcgacc ctcagaacat cgtcgtactc 720

cacaagccgg ctaacaacga gatagtaagc tacggcagtg gatatggcgg caacagtttg 780

ttgggcaaga agtgcttcgc tctacgtctg ggatcagtga tcgcccgtcg cgaaggatgg 840

ctggctgaac atatgcttat cgtcggcata accaaccctc aaggtaaaaa gcgctacatc 900

gctgctgctt ttccttcagc ttgcgggaag acgaatctcg caatgatgac gccaacactg 960

cccgggtaca aagtagagtg cgtgggggac gacatagcct ggatgaagtt cgacaaggac 1020

ggcgtactgc gggccatcaa ctctgaaaac gggttctttg gaattgcacc aggtacgtca 1080

gccgctacga atccgatagc aatggcgacg gtgttcaaaa acaccgtgtt cactaacgtg 1140

gcggaaacac ctgagggtgg ggtgtggtgg gaaggcatgg gaccagctcc ggagcgcctc 1200

gtcgactgga aaggtcaacc ctgggacccc agcaagaaaa ctccggctgc acatccaaat 1260

tccagattct gcaccccggc agagcagtgt cccatgatag acggtgagtg ggagagctcg 1320

gagggtgtgc cgatatccgc catcctgctg ggcggcagac ggccggccgg cgtaccgctc 1380

gtagtcgagt cgcgggactg gcagcacggc gtgttcatgg gagcttccat gaggtccgag 1440

gccacggccg ccgccgaaca cagcggtaaa atggtgatgc acgatccgtt tgcgatgcgt 1500

ccgttcttcg gctataactt cggcgactac ctgaagcact ggctgtcgat gccgcagccg 1560

ggacgcaaga tgcccaagat cttccatgtc aactggttcc gtaaagacga acagggtaag 1620

ttcctctggc ccggtttcgg cgagaactct cgggtcttag actggatctt acgtcgctgc 1680

gatggggagc cctgccacgc cgagactcca ctggggtaca taccgagagc cggtgctctg 1740

aatacggaaa acctaagcgc tgtcgacatg aacaagctgt tcagcatacc taaagacttt 1800

tggctgcagg aggctgacgc catcgagaag tacttcaaag aggaggtagg cgaagatcta 1860

cccaacgaaa tgtgggacga actgaacaag ttgaggaaaa acatacaagg ccaagcttta 1920

aattagacct ctctctctct tcctagttat ttatcccaca tg 1962

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物PEPCK-1qRT上游引物

<400> 7

tcaaagagga ggtaggcga 19

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物PEPCK-1qRT下游引物

<400> 8

gactcgttta attttatatc tttggt 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物PEPCK-2qRT上游引物

<400> 9

tcaaagagga ggtaggcgaa 20

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物PEPCK-2qRT下游引物

<400> 10

catgtgggat aaataactag gaagag 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物TIF-4AqRT上游引物

<400> 11

gaatggaccc tgggacactt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物TIF-4AqRT上游引物

<400> 12

ctgactgggc ttgagcgata 20

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-1oe-F

<400> 13

ggatccatgc tgcattttaa aaccaccccc gaaga 35

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物PEPCK-1oe-R

<400> 14

gcggccgctt aggcttgtat gttcttcctc aac 33

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-2oe-F

<400> 15

ggatccatgc tgcattttaa ggccatcccc 30

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-2oe-F

<400> 16

gcggccgcct aatttaaagc ttggccttgt atg 33

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物GP41qRT上游引物

<400> 17

cgtagtagta gtaatcgccg c 21

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异引物GP41qRT下游引物

<400> 18

agtcgagtcg cgtcgcttt 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDHqRT上游引物

<400> 19

ccgcgtccct gttgctaat 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDHqRT下游引物

<400> 20

ctgcctcctt gaccttttgc 20