一种人MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明属于体外核酸检测技术领域，具体为一种人MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

叶酸(folic acid)属于B族维生素，是细胞生长繁殖的必需物质，参与机体的很多重要代谢反应。一旦机体发生叶酸缺陷或者是叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常，DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或者是间接导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人心血管疾病的发生。目前，经证实与叶酸代谢密切相关的基因有5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原成活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸维持在无毒水平。MTHFR和MTRR基因位点突变都会引起相应的酶的活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸，引起新生儿出生缺陷和自发性流产等。MTHFR最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国的发生率约为45.2％和18.6％。MTRR常见的突变位点为66A>G，中国人群的发生率为25.7％。通过对叶酸代谢相关的MTHFR和MTRR的基因位点进行检测，可以判断个人叶酸代谢能力的高低，可以辅助临床医生对孕妇产期新生儿神经管缺陷以及心血管疾病发病风险进行评估，指导叶酸个体化的使用。

目前针对基因多态性的检测方法有很多，如测序法，基因芯片法，高分辨率溶解曲线法等。测序法虽然是基因多态性的检测的金标准，但是操作繁琐，工作量大，且仪器昂贵，不利于推广。基因芯片法技术仪器要求较高，成本昂贵，不利于大规模推广。高分辨率溶解曲线法受仪器温度控制，假阳性高。

技术实现要素：

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物、探针和方法，该方法具有快速、简便、高灵敏度，高特异性，操作简单、检测结果可靠等优点。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物，所述引物为针对MTHFR677检测的特异性引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、针对MTHFR1298检测的特异性引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、针对MTRR66检测的特异性引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、针对内参基因beta globin检测的特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及PCR反应的公用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测探针，采取了以下技术方案：

一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测探针，所述探针为针对MTHFR677C检测的特异性探针SEQ ID NO.8和针对MTHFR677T检测的特异性探针SEQ ID NO.9、针对MTHFR1298A检测的特异性探针SEQ ID NO.12和针对MTHFR1298C检测的特异性探针SEQ ID NO.13、针对MTRR66A检测的特异性探针SEQ ID NO.16和针对MTRR66G检测的特异性探针SEQ ID NO.17、以及针对内参基因beta globin检测的特异性探针SEQ ID NO.5。

本发明还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，采取了以下技术方案：

一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括针对MTHFR677检测的特异性引物和特异性探针、针对MTHFR1298检测的特异性引物和特异性探针、以及针对MTRR66检测的特异性引物和特异性探针。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的PCR扩增反应的公用引物、如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的针对内参基因beta globin检测的特异性引物、以及如SEQ ID NO.5所示的针对内参基因beta globin检测的特异性探针。

在其中一些实施例中，所述SEQ ID NO.1～5的工作终浓度分别为400nmol/L～800nmol/L、400nmol/L～800nmol/L、20～100nmol/L、20～100nmol/L、80～250nmol/L。

在其中一些实施例中，所述特异性引物和特异性探针的工作终浓度分别为20～100nmol/L和80～250nmol/L。

本发明还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，采取了以下技术方案：

(1)以人细胞基因组DNA为模板，以针对MTHFR677检测的特异性和公用引物及探针、针对MTHFR1298检测的特异性和公用引物及探针、针对MTRR66检测的特异性和公用引物及探针作为引物和探针分别进行多重PCR扩增，每一循环实时采集CY5、FAM和VIC荧光信号；

(2)结果判读。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述DNA浓度为10ng～50ng。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述多重PCR扩增的反应体系为：2×PCR缓冲液12.5ul、引物探针组合物1.5ul、样本DNA3ul、ddH₂O 8ul。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述多重PCR扩增的反应程序均为：95℃10分钟启动后，95℃30秒、66℃40秒共10个循环，然后95℃30秒、59℃30秒共30个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物和探针具有高特异性和高灵敏度；

2、本发明提供的人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法是针对人MTHFR最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，以及人MTRR常见的突变位点为66A>G等三个基因多态性位点，采用3个多重PCR反应分别进行定性检测，并采用beta globin作为内参基因，在3个多重PCR反应中均采用HAND引物系统，利用公用引物进行多重PCR反应扩增，即增加多重PCR反应的兼容行，也保证了扩增效率的一致性，减少了扩增效率差异导致的结果偏差；

3、本发明提供的检测方法采用闭管检测，避免样本交叉污染，检测快速、简便、结果可靠，适用于大规模推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中MTHFR677C/C纯合图；

图2为本发明实施例2中MTHFR677C/T杂合图；

图3为本发明实施例2中MTHFR677T/T纯合图；

图4为本发明实施例2中MTHFR1298A/A纯合图；

图5为本发明实施例2中MTHFR1298A/C杂合图；

图6为本发明实施例2中MTHFR1298C/C纯合图；

图7为本发明实施例2中MTRR66A/A纯合图；

图8为本发明实施例2中MTRR66A/G杂合图；

图9为本发明实施例2中MTRR66G/G纯合图；

图10为本发明实施例2中MTHFR677C/C纯合图；

图11为本发明实施例2中MTHFR677C/T杂合图；

图12为本发明实施例2中MTHFR677T/T纯合图；

图13为本发明实施例2中MTHFR1298A/A纯合图；

图14为本发明实施例2中MTHFR1298A/C杂合图；

图15为本发明实施例2中MTHFR1298C/C纯合图；

图16为本发明实施例2中MTRR66A/A纯合图；

图17为本发明实施例2中MTRR66A/G杂合图；

图18为本发明实施例2中MTRR66G/G纯合图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

以下实施例中，所使用的核苷酸序列以及修饰特征见表1。

表1、SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19核苷酸序列以及修饰特征

实施例1人MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒

本实施例所述的试剂盒包括以下成分：

公用引物与探针：公用引物UP1(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)和UP2(SEQ ID NO.2所示核苷酸序列)、beta globin特异性上游引物globinF(SEQ ID NO.3所示核苷酸序列)、beta globin特异性下游引物globinR(SEQ ID NO.4所示核苷酸序列)、beta globin特异性探针globin probe(SEQ ID NO.5所示核苷酸序列)；

特异性引物和探针：

用于MTHFR677C>T基因多态性定性检测的MTHFR677特异性上游引物MTHFR677F(SEQ ID NO.6所示核苷酸序列)、MTHFR677下游引物MTHFR677R(SEQ ID NO.7所示核苷酸序列)、MTHFR677C特异性探针MTHFR677Cprobe(SEQ ID NO.8所示核苷酸序列)、MTHFR677T特异性探针MTHFR677Tprobe(SEQ ID NO.9所示核苷酸序列)；

用于MTHFR1298A>C基因多态性进行定性检测的MTHFR1298特异性上游引物MTHFR1298F(SEQ ID NO.10所示核苷酸序列)、MTHFR1298下游引物MTHFR1298R(SEQ ID NO.11所示核苷酸序列)、MTHFR1298A特异性探针MTHFR1298A probe(SEQ ID NO.12所示核苷酸序列)、MTHFR1298C特异性探针MTHFR1298C probe(SEQ ID NO.13所示核苷酸序列)；

用于MTRR66A>G基因多态性进行定性检测MTRR66特异性上游引物MTRR66F(SEQ ID NO.14所示核苷酸序列)、MTRR66下游引物MTRR66R(SEQ ID NO.15所示核苷酸序列)、MTRR66A特异性探针MTRR66A probe(SEQ ID NO.16所示核苷酸序列)、MTRR66G特异性探针MTRR66G probe(SEQ ID NO.17所示核苷酸序列)；

对照品1：

包括MTHFR677C、MTHFR1298A、MTRR66A、beta globin在内的基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.18所示；

对照品2：

包括MTHFR677T、MTHFR1298C、MTRR66G、beta globin在内的基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.19所示。

利用本发明的人MTHFR和MTRR基因多态性检测的试剂盒进行检测，涉及三组PCR反应，其分别为：

PCR反应1：包括公用和特异性引物与探针组合，其含有下列引物与探针干粉或溶液：UP1、UP2、globinF、globinR、globin probe、MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677Cprobe、MTHFR677Tprobe，设计浓度为20倍工作浓度。

PCR反应2：包括公用和特异性引物与探针组合，其含有下列引物与探针干粉或溶液：UP1、UP2、globinF、globinR、globin probe、MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A probe、MTHFR1298C probe，设计浓度为20倍工作浓度。

PCR反应3：包括公用和特异性引物与探针组合，其含有下列引物与探针干粉或溶液：UP1、UP2、globinF、globinR、globin probe、MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A probe、MTRR66G probe，设计浓度为20倍工作浓度。

实施例2人MTHFR和MTRR基因多态性检测方法

使用实施例1的试剂盒进行检测，包括以下步骤:

1、DNA的准备

随机抽取30人在知情同意下按照医疗常规抽取外周血，提取DNA。本发明试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA。取适量EDTA-K2或枸橼酸钠抗凝的人外周全血并提取人基因组DNA。所提取的DNA样本须满足以下要求。

1.1本发明试剂盒样本来源为人外周全血基因组DNA，DNA浓度在10～50ng/μL，纯度A260/A280在1.8～2.0之间。

1.2样本保存：DNA样本在室温(18～28℃)放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一周，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存；冷冻保存的样本，不宜过多次数反复冻融。

1.3样本运输：DNA样本在运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻。

2、对照品准备

对照品1、对照品2浓度控制为10ng/ml；然后进行100倍稀释；稀释后的对照品1、对照品2按1：1体积混合，作为对照品3；ddH₂O替代DNA模板作为阴性对照。

3、多重PCR扩增：总体系均为25ul，反应体系如下：

对照品反应：PCR反应1～3均采用对照品3，取3ul对照品3替代样本DNA；

阴性对照采用ddH₂O替代样本DNA。

4、PCR反应条件

采用Applied Biosystems ViiA 7^TM Real-Time PCR System实时荧光PCR仪进行PCR反应。95℃10分钟启动后，95℃30秒、66℃40秒共10个循环，然后95℃30秒、59℃30秒共30个循环。PCR反应在多通道实时荧光PCR仪上进行，每一循环实时采集CY5、FAM和VIC荧光信号。

5、结果分析

实验结果满足数据分析通用要求，其基因多态性定性分析结果需要按照MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G等3个基因多态性进行定性分析的依据进行分析。PCR反应1至PCR反应3结果分析的通用要求：A.阴性对照品CY5、FAM、VIC通道Ct值均应大于35。B.样品以及对照品1、对照品2、对照品3等CY通道均应大于或等于28。其MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G等3个基因多态性进行定性分析的依据，见表2。

表2MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G基因型定性分析

MTHFR和MTRR基因多态性结果见说明图(图1～图9)。

30例MTHFR和MTRR基因多态性检测结果，见表3。

表3 30例MTHFR和MTRR基因多态性检测结果(例数)

6、结果验证

设计PCR引物，对上述样本DNA，扩增MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G区域序列，其PCR引物以及测序引物见表4。

表4MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G区域PCR引物、测

序引物

30例样本MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G基因多态性检测结果，MTHFR和MTRR基因多态性测序结果结果分析说明图，见图10～18。经过测序验证，其结果与本发明试剂盒检测结果一致率为100％。

本发明通过上述引物与探针组合，以及检测方法可以实现MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G等3个基因多态性进行定性检测。

本发明提出的引物与探针组合中，内参基因和目的基因多态性检测探针采用CY5、FAM、VIC标记，当然可以选用其它合适荧光标记。对于内参基因，显然选择其他内参基因并不影响MTHFR和MTRR基因多态性检测。

本发明提出的引物与探针组合，其工作浓度依据相应的PCR缓冲液以及PCR循环参数进行优化，其它合适的PCR缓冲液以及PCR循环参数同样可以获得理想的检测结果。

本发明所提出的人MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒及其应用可在多通道定量PCR仪的实验室稳定实施，检测时间为2～3小时，3个独立的PCR反应均闭管操作，避免了PCR产物的污染风险。

本发明已参照其特定的实施操作进行描述。但是可以作出各种修改和变换，其不背离本发明的范围。

综上所述，本发明所提出的人MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒及其应用，采用闭管操作，可避免样本交叉污染以及PCR产物污染，而且检测速度快，准确，简便，适用于大规模推广应用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。