一株具杀根结线虫能力的香蕉内生链霉菌及其研制的生物育苗基质的制作方法

本发明属于农业微生物领域，涉及一株具杀根结线虫能力的香蕉内生链霉菌及其研制的生物育苗基质。

背景技术：

香蕉是热带、亚热带地区特有的大型草本果树。根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物根系定居性内寄生物，是当前我国主要的农作物病原线虫之一，其常造成作物产量损失达10％～30％，严重时达70％以上，对世界上重要的经济作物每年造成的损失高达数百亿美元。在我国绝大部分省区均有分布，可侵染数百种作物，其中蔬菜果树受害最为严重。在生产环节中，二级苗生产技术尤为重要。一般来说，香蕉假植过程已从原始的土壤栽培转变为如今的腐熟椰糠基质栽培，无论是土壤还是椰糠，一旦与土壤接触都易携带病虫害.对香蕉组培苗生长不利。尤其枯萎病和土壤线虫，一旦感染后移栽大田，对后期生长极为不利。控制育苗基质中有害线虫的数量因工程量大，操作繁琐，不易实现。因此培育能够抵抗根结线虫的香蕉苗变得尤为重要。将具有促生和杀线功能的内生菌与常规香蕉育苗基质相结合，生产出定殖功能菌的香蕉育苗基质，将提高香蕉苗对根结线虫的抵抗力。目前，国内生产上多采用基质与土隔绝，育苗期间施用化学杀线剂来防治根结线虫，但化学杀线剂持效时间短，施用多次对香蕉和土壤易产生不良影响，因而本专利的研究变得尤为重要。CN101463332A中公开了一株抗生链霉菌西安保藏变种的亚种(Streptomyces antibioticus subspecies xi’an)，该菌株的发酵产物可抑制广谱真菌、原虫，大田实验能防治作物真菌病害和根结线虫。但该链霉菌与本发明请求保护的链霉菌(Streptomyces capoamus)NAU-SA-1从分类学上并不属于相同种。

植物内生促生放线菌是指定殖于植物根内，并能促进植物生长的一类放线菌的总称。能依靠直接产生信号物质，或者提高植物抗性、加速土壤养分元素循环等方式促进植物生长、提高防病虫能力、增加作物的产量。因而成为许多学者研究的热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株具杀死香蕉根结线虫能力的香蕉内生链霉菌(Streptomyces capoamus)NAU-SA-1。

本发明的另一目的是提供一种含有该菌株的功能型香蕉育苗生物基质及其应用。

本发明的又一目的是提供该功能型香蕉育苗生物基质的制备方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株链霉菌(Streptomyces capoamus)NAU-SA-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年1月26日，保藏编号为CGMCC NO.10441。菌株NAU-SA-1在高氏一号平板上的菌落呈淡黄色，干燥，不透明，表面呈致密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，边缘不整齐，不易挑起(说明书附图1)。菌株16S rDNA序列构建的系统发育树表明，菌株NAU-SA-1位于Streptomyces capoamus分支上，与链霉菌Streptomyces capoamus strain Y24-25相似性达99％以上，与公开的抗生链霉菌Streptomyces antibioticus相似性为77％，结合生理生化试验将NAU-SA-1暂归入卡胞链霉菌。

本发明所述的链霉菌NAU-SA-1在制备香蕉育苗生物基质中的应用。

一种功能型香蕉育苗生物基质，由普通育苗基质中添加本发明所述的链霉菌NAU-SA-1发酵液得到。

其中，所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥90％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)≥2％，水分≤50％，pH值5.5～6.5，Ec≤1ms/cm。

所述的功能型香蕉育苗生物基质中链霉菌NAU-SA-1活菌数优选≥6.0×10⁵CFU/g基质干重。

所述的链霉菌NAU-SA-1发酵液通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO.10441的链霉菌NAU-SA-1接种到高氏一号培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH7.2～7.4，发酵温度范围30℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成孢子，发酵时间为7d，使发酵液中含菌或孢子量≥3×10⁷个/ml；其中所用高氏一号培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：可溶性淀粉20g，K₂HPO₄ 0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，定容至1000ml，pH值7.2～7.4，121℃灭菌20min。

本发明所述的功能型香蕉育苗生物基质的制备方法，包含以下步骤：

(1)制备链霉菌NAU-SA-1发酵液，使发酵液中含菌或芽孢量≥3×10⁷个/ml；

(2)将步骤(1)制备的链霉菌NAU-SA-1发酵液加入普通育苗基质中，发酵液的接入量为5％(v/w)。

所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥90％，总养分(N+P2O5+K2O)≥2％，水分≤50％，pH值5.5～6.5，Ec≤1ms/cm。

所得产品中有益活菌数≥6.0×10⁵CFU/g(基质干重，下同)，有机质≥90％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)≥2％，水分≤50％，pH值5.5～6.5，Ec≤1ms/cm。

本发明所述的功能型香蕉育苗生物基质在防治香蕉根结线虫和/或促进香蕉生长中的应用。

有益效果：

接种链霉菌NAU-SA-1菌液于普通育苗基质后，由于基质的良好通透性和优质保水性，普通基质与链霉菌NAU-SA-1结合后，能够大幅度促进链霉菌菌株的存活能力，袋装香蕉苗定植于基质后，链霉菌能够更好地定殖到根系中，所育种苗的后期生长效果，显著优于基质中不添加链霉菌的生长效果。

使用该产品，对香蕉苗期的促生效果好，能够得到优质的种苗，同时功能菌能够在种苗根内大量定殖。本产品中包含的活性微生物，既具促生的高效又兼一定根结线虫防控的功效，技术优势和功能优势明显。该基质能够显著促进所育种苗后期栽培过程中的生长，同时能够增强所育种苗防控根结线虫的作用。

附图说明

图1 NAU-SA-1在高氏一号平板上的菌落形态

图2基于菌株NAU-SA-1的16S rRNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图3功能菌接种对香蕉的育苗效果图

图4生物基质育香蕉苗功能菌根内定殖情况

图5功能型香蕉苗对爪哇根结线虫的防治效果

图6功能菌接种对香蕉苗的促生效果图

图7功能型香蕉苗对植食性线虫的防治效果

生物材料保藏信息

NAU-SA-1，分类命名为上升岛链霉菌Streptomyces capoamus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年1月26日，保藏编号为CGMCC NO.10441。

具体实施方案

实施例1菌株的分离及鉴定

取香蕉根部洗净，切成长约3cm小段，称取10g根样，5％NaClO消毒8min，无菌水洗3次，75％乙醇消毒5min，无菌水洗3次，于盛有10ml无菌水的研钵内研磨，取研磨液梯度稀释后涂布。培养箱中黑暗培养3-4d，后挑取单菌落，经平板纯化后，共挑选150株，分别测定各菌株发酵液对根结线虫的抑杀效果。获得一株杀线效果优秀的菌株NAU-SA-1，保存留待进一步研究。

菌株NAU-SA-1在高氏一号平板上的菌落呈淡黄色，干燥，不透明，表面呈致密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，边缘不整齐，不易挑起。(图1)。

菌株16S rDNA序列构建的系统发育树见图2。菌株NAU-SA-1位于Streptomyces capoamus分支上,与链霉菌Streptomyces capoamus strain p14C01和Streptomyces capoamus strain Y24-25相似性在99％以上,结合生理生化试验将NAU-SA-1鉴定为链霉菌。

实施例2功能菌菌液的生产

将菌株NAU-SA-1(CGMCC NO.10441)接种至高氏一号培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH7.2～7.4，发酵温度范围30℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成孢子，发酵时间为7d，使发酵液中含菌或孢子量≥3×10⁷个/ml；其中所用高氏一号培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：可溶性淀粉20g，K₂HPO₄ 0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄0.01g，定容至1000ml，pH值7.2～7.4，121℃灭菌20min。

实施例3功能微生物在香蕉根中的定殖效果

将生根无菌袋装香蕉苗转接到装有生根培养基组培瓶中，所有操作均为无菌条件，接种5％的菌株NAU-SA-1菌液于香蕉根围培养基中，根中NAU-SA-1的定殖情况统计采用表面消毒后涂布计数：香蕉根洗净后称重，5％NaClO消毒8min，无菌水洗3次，75％乙醇消毒5min，无菌水洗3次，无菌研钵研磨根样，取研磨液涂布。所用高氏一号培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：可溶性淀粉20g，K₂HPO₄ 0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，琼脂粉20-30g，定容至1000ml，pH值7.2-7.4，121℃灭菌20min。功能菌NAU-SA-1菌株数量以每克根重计算。

试验处理如下：1)CK：不接种NAU-SA-1菌液；2)SA：添加5％NAU-SA-1菌液。每个处理10个重复。50天后稀释涂布计数各处理中功能菌NAU-SA-1在根内的定殖数量。结果表明，相比于不接菌CK，添加功能菌NAU-SA-1菌液后对香蕉苗具有明显促生效果(见图3)，且能够在根中很好地定殖，定殖结果如图4所示。

实施例4功能型生物基质研发

4.1功能型香蕉苗对爪哇根结线虫的防治效果

育苗基质高温灭菌以杀死全部线虫，接种5％NAU-SA-1菌液于普通育苗基质，研制成生物育苗基质，袋装香蕉苗移栽育苗杯生物育苗基质中进行育苗。

试验处理如下：1)CK：普通育苗基质(不接种NAU-SA-1菌液)育香蕉苗；2)SA：接种5％NAU-SA-1菌液于普通育苗基质，研制成生物育苗基质育香蕉苗。移栽50天后接种纯爪哇根结线虫，每个处理10个重复。50天后统计根中侵染的爪哇根结线虫数量，采用根表面消毒后浅盘法收集计数：香蕉根洗净后5％NaClO消毒3min，自来水冲洗干净，用浅盘法分离根中线虫。线虫数量以每10克根重计算。结果表明，接种NAU-SA-1菌液生物育苗基质所育香蕉苗根中侵染的爪哇根结线虫数量较CK显著减少86％，具有明显的杀线效果(如图5所示)。

4.2功能型育苗基质所育香蕉苗的盆栽试验

将功能型基质以及普通基质所育的香蕉苗进行盆栽试验，共设2个处理：1)CK：普通基质所育香蕉苗；2)SA：5％NAU-SA-1接菌量生物基质所育香蕉苗。每个处理10盆，每盆5公斤土，每盆施入1％的普通有机肥与土拌匀作为基肥，于定植60d时测定各处理株高、茎粗、叶面积、SPAD值、根中线虫数量、土壤中植食性线虫数量。

结果表明，活性生物基质中的功能菌起到了最主要的促生效果，同时其发酵产生的一些促生物质同样起到了一定的促生作用。定植60天后，与CK相比，SA处理的株高、茎粗、叶面积都显著增加，只有SPAD值是减少的(见表1)。盆栽试验结果表明，活性生物基质所育种苗，由于根内已经定殖有大量的功能菌，在盆栽试验中链霉菌能够更好的发挥其功能。显著减少侵染香蕉根部的有害线虫和土壤中的植食性线虫(如图7所示)。功能菌5％添加量研制成的活性生物基质所育种苗对后根结线虫有较好的防效。

综上所述，功能菌5％添加量研制成的活性生物基质，在功能菌定殖情况、对爪哇根结线虫防效以及后期盆栽效果方面均显著优于普通育苗基质的效果，且达到显著性差异。

表1接种NAU-SA-1菌液对香蕉的育苗效果

以上实施例中使用的普通的育苗基质均为海南万钟公司组培分公司提供的香蕉育苗基质，其中含有机质≥90％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)≥2％，水分≤50％，pH值5.5～6.5，Ec≤1ms/cm。