本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法。
背景技术：
目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理或化学的方法都存在着明显的弊端。首先，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域所有环节的应用，其次，化学方法中的酸碱处理虽可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想；最后，抗生素虽然开始使用效果显著，但是长期使用，不仅会增强病原菌的抗药性，而且抑制有益菌群，最终不能有效地控制、消除致病菌。
近年来，微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是蛭弧菌的研究受到人们的青睐。蛭弧菌自1963年被发现以来，因其是一种寄生菌，能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰等革兰氏阴性致病菌且对人和动物无害，而备受关注。
专利申请号为94114314.7，名称为“噬菌蛭弧菌生态制剂的制备方法”的国家发明专利申请提出一种培养基培养在10000ml放水瓶，装液为5000ml使用大肠杆菌培养蛭弧菌5～7天，最终蛭弧菌效价为105～108pfu/ml。其主要缺点是生产规模太小，最大发酵量仅为5000ml，同时，培养基复杂，配制繁琐。
专利申请号为93111749.6，名称为“生物制菌王及其生产方法”的国家发明专利申请提出用高温(70～150℃)或化学药物(氯仿等)将大肠杆菌杀死，制造灭活的宿主菌，接着用其培养蛭弧菌，得到蛭弧菌制剂。然而该方法使用灭活的大肠杆菌，工序复杂，同时生产出来的蛭弧菌裂解能力也较低，同时蛭弧菌的效价未提及，同时生产出来的蛭弧菌微生态制剂未对大肠杆菌进行分离。
专利申请号200810145709.5，名称为“蛭弧菌微生态制剂的生产方法”提供了蛭弧菌微生态制剂的生产方法，主要和传统方法不同的是将宿主大肠杆菌冻干成菌粉使用，工艺复杂，成本高，同时蛭弧菌浓度不高，只有1×107pfu。然而该方法使用大肠杆菌冻干粉作为营养源，工序复杂，同时，蛭弧菌的效价也不高为1×107pfu/ml，同时，未对大肠杆菌进行固液分离。
专利申请号200810202809.7，名称为“双效蛭弧菌的发酵生产方法”的国家发明专利申请提供了一种双效蛭弧菌的发酵生产方法，即先发酵制备宿主菌的混悬液，再加入宿主菌混悬液和蛭弧菌液到配制好的培养液中进行发酵。虽然该生产方法生产出的蛭弧菌含量较高(5×108pfu/ml)，但其宿主菌选用了致病性的嗜水气单胞菌，而且发酵时间较长(72～120h)，会导致生产成本的增加。另外，此技术也可能存在着所得的蛭弧菌裂解活性不高的问题。
专利申请号201010270772.9，名称为“一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用”提供了一种使用革兰氏阳性菌(不含大肠杆菌)发酵生产蛭弧菌的方法，通过发酵过程中多次添加宿主菌株，最终发酵浓度为108～1012pfu/ml，发酵周期为36～48h。该方法主要缺点是在发酵过程中多次添加宿主菌，操作要求高，工序复杂，容易染菌，同时发酵周期较长(36～48h)，产量不高108～1012pfu/ml。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法，包括以下步骤：
1)使用大肠杆菌作为宿主，接入发酵培养基中；
2)接种蛭弧菌菌液至发酵罐中进行培养；
3)在发酵周期中流加大肠杆菌；
4)固液分离去除底部大肠杆菌，取上层澄清液即得蛭弧菌生态制剂。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤1)的发酵培养基为葡萄糖1～20g/ml；胰蛋白胨1～20g/ml；氯化钠1～20g/ml；氯化钙0.1～2g/ml，pH为6.5～8.0之间。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤1)的发酵培养基的CFU为1010～1018/ml之间。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤2)的蛭弧菌菌液PFU为106～108/ml，其培养方法为：双层平板，下层为1.5％琼脂平板，上层平板为葡萄糖1～20g/L；胰蛋白胨1～20g/L；氯化钠1～20g/L；氯化钙0.1～2g/L，琼脂15～20g/L，pH为6.5～8.0之间，取100μl宿主菌液(CFU为105～1010/ml)与100μl蛭弧菌(PFU为103～105/ml)混合加入上层平板进行筛选，挑取噬菌斑，使用大肠杆菌进行扩培，最后制备得蛭弧菌菌液(PFU为106～108/ml)，接种体积为发酵液体积的1～10％之间。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤2)中，发酵罐培养条件为：温度为25～32℃，转速为50～200rpm。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤3)中在发酵周期6～16小时内，流加大肠杆菌，所述大肠杆菌CFU为1010～1018/ml之间，流加时间为2～6小时之间，流加总发酵体积1～10％的量，其中，流加大肠杆菌的次数为1次。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤3)中发酵周期为18～24小时。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法中，所述步骤4)中固液分离的方法为将所得的发酵液，在2～15℃温度下静置12～24h，使得大肠杆菌沉降于底部，取上层澄清部分，使用超滤过滤进一步去除大肠杆菌，即得蛭弧菌生态制剂。
本发明的另一方面在于提供上述方法制备的蛭弧菌微生态制剂。
优选地，本发明所述的蛭弧菌微生态制剂的效价为1010～1014pfu/ml。
由上可见，本发明的蛭弧菌微生态制剂的流加式发酵方法，至少有以下优点：
1)本发明的培养蛭弧菌的培养基成分简单，可以在10L、100L、1000L进行规模发酵，有利于工业化放大；
2)发酵周期短(18～24h)，只有一次流加操作，提高了生产效率，并降低操作难度，减少了中间操作过程可能带来的污染问题；
3)蛭弧菌产量高(其效价为1010～1014pfu/ml)，远高于现有技术108～1012pfu/ml的水平，同时在发酵结束时，对大肠杆菌进行固液分离，可以忽略不计蛭弧菌微生态制剂中大肠杆菌的含量，避免了潜在的环境危害。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
发酵罐体积：500L，装液量为400L
培养基成分：葡萄糖1～20g/L；胰蛋白胨20g/L；氯化钠20g/L；氯化钙2g/L，pH为8.0之间；将4L大肠杆菌菌液(CFU为1012/ml)接入发酵罐，使其实大肠杆菌CFU为1010/ml；
使用本发明平板筛得的蛭弧菌进行扩培，得到40L蛭弧菌菌液(PFU为106/ml)，并接种到发酵罐中，
蛭弧菌购买来源中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M208066。培养方法为：双层平板，下层为1.5％琼脂平板，上层平板为葡萄糖1～20g/L；胰蛋白胨1～20g/L；氯化钠1～20g/L；氯化钙0.1～2g/L，琼脂15～20g/L，pH为6.5～8.0之间，取100μl宿主菌液(CFU为105～1010/ml)与100μl蛭弧菌(PFU为103～105/ml)混合加入上层平板进行筛选，挑取噬菌斑，使用大肠杆菌进行扩培，最后制备得蛭弧菌菌液(PFU为106～108/ml)，
发酵条件：25℃，200rpm
流加时间：发酵时间第6h，流加速度20L/h，连续流加2h；
发酵时间：24小时；
产量：蛭弧菌菌液为1014PFU/ml
将发酵液在5℃罐体中沉降12小时，使用泵以0.5m3/h缓慢将上层澄清液转移并使用0.5μm超滤膜进行过滤，制得蛭弧菌微生态制剂，使用无菌LB平板涂布检验大肠杆菌残留，检验结果为大肠杆菌小于3个/m3。
实施例2
发酵罐体积：1000L，装液量为800L
培养基成分：葡萄糖1～20g/L；胰蛋白胨20g/L；氯化钠20g/L；氯化钙2g/L，pH为8.0之间；将8L大肠杆菌菌液(CFU为1014/ml)接入发酵罐，使其实大肠杆菌CFU为1012/ml；
使用本发明平板筛得的蛭弧菌进行扩培，得到16L蛭弧菌菌液(PFU为106/ml)，并接种到发酵罐中，
发酵条件：30℃，100rpm
流加时间：发酵时间第10h，流加速度大肠杆菌发酵液(1012PFU/ml)13L/h，连续流加6h；
发酵时间：22小时；
产量：蛭弧菌菌液为1016PFU/ml
将发酵液在5℃罐体中沉降12小时，使用泵以0.8m3/h缓慢将上层澄清液转移并使用0.8μm超滤膜进行过滤，制得蛭弧菌微生态制剂，使用无菌LB平板涂布检验大肠杆菌残留，检验结果为大肠杆菌小于3个/m3。
实施例3
发酵罐体积：5000L，装液量为4800L
培养基成分：葡萄糖1～20g/L；胰蛋白胨20g/L；氯化钠20g/L；氯化钙2g/L，pH为8.0之间；将48L大肠杆菌菌液(CFU为1020/ml)接入发酵罐，使其实大肠杆菌CFU为1018/ml；
使用本发明平板筛得的蛭弧菌进行扩培，得到48L蛭弧菌菌液(PFU为106/ml)，并接种到发酵罐中，
发酵条件：32℃，50rpm
流加时间：发酵时间第12h，流加速度大肠杆菌发酵液(1014PFU/ml)25L/h，连续流加2h；
发酵时间：18小时；
产量：蛭弧菌菌液为1018PFU/ml
将发酵液在8℃罐体中沉降24小时，使用泵以0.8m3/h将上层澄清液转移并使用1.0μm超滤膜进行过滤，制得蛭弧菌微生态制剂，使用无菌LB平板涂布检验大肠杆菌残留，检验结果为大肠杆菌小于3个/m3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。