一种复合微生态制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合微生态制剂及其制备方法，该复合微生态制剂包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌，所述蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1：1～3：1～2.5。本发明相比现有技术的优点在于：该复合微生态制剂是将干酪乳杆菌与芽孢杆菌混合培养，充分发挥了菌株间的协同作用，对乳酸菌的有氧代谢提供了保护，提高了设备的利用率。
【专利说明】一种复合微生态制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种微生态制剂，尤其涉及的是一种复合微生态制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近几年来，随着抗生素和化学药物等添加剂在畜禽养殖业中的广泛使用，人们己经逐渐意识到抗生素和化学药物所带来的种种负面效应，例如抗生素导致动物正常菌群失调，大量耐药性菌株产生；同时药物残留等毒副作用，给动物、人类以及环境带来了严重危害，并且降低了畜禽产品在市场上的竞争力，因此，许多国家相继禁止或限制抗生素等在饲料中的应用。鉴于抗生素的种种不利影响，国内外的研究人员一直致力于开发一些通过调整动物胃肠道平衡和功能，以达到促进生长和维持动物健康水平等目的的新型添加剂，动物微生态制剂因其具有促生长、无毒、无副作用、无残留等特点而引起了各国的广泛关注和重视，使用的种类越来越多，应用范围也十分广泛，其应用于动物生产的良好效果己被大量试验和生产实践所证实。
[0003]微生态制剂是在微生态学理论的指导下，调整微生态失调，保持微生态平衡提高宿主健康水平或促进有益菌生长及其代谢产物产生的一类制剂。根据定义，微生态制剂包括了益生菌、益生元和合生元三个概念。近年来，国内外研制出多种益生菌制剂，其指导思想是用人或动物正常生理菌群的成员，经过选种和人工繁殖，通过各种途径制成活菌制剂，然后再以投入方式使其回到原环境，发挥自然的生理作用。益生菌在使用中具有促进有益菌增殖、抑制病原菌、增强机体免疫力等多种作用，因此在短时间内已得到广泛应用。
[0004]芽孢杆菌是一种好氧、无害、能产生芽孢、耐酸碱、耐高温和挤压的细菌，在肠道酸性环境中具有高度的稳定性；它能够促进有益菌的生长，拮抗肠道内的有害菌，增强机体免疫力，提高抗病能力；另外，`它还能分泌较强活性的蛋白酶及淀粉酶，可明显提高动物生长速度，促进饲料营养物质的消化，但它不能定值于肠道中，属于肠道过路菌。目前报道较多的芽孢杆菌菌种有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌及东洋芽孢杆菌等有益菌种类
[0005]乳酸菌是一种可以分解糖类产生乳酸的革兰氏阳性菌，厌氧或者兼性厌氧生长。在动物体内通过生物拮抗作用降低PH值，阻止和抑制致病菌的侵入和定值；降解氨、吲哚、粪臭素等有害物质，维持肠道中正常的生态平衡；增强体液免疫和细胞免疫；可用于哺乳和断乳期动物的饲料中。目前应用的乳酸菌主要是来源于乳酸杆菌属、乳酸链球菌属和双歧杆菌属的近30种微生物，我国农业部允许用作饲料添加剂的乳酸菌有:干酪乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌以及乳链球菌。
[0006]乳酸菌是一大类能从发酵碳水化合物产酸的细菌，为肠道中的正常微生物，为厌氧菌或兼性厌氧菌。在生长过程中，乳酸菌不形成芽孢，抗性较差，因而在饲料制粒及制剂储藏过程中容易失活。为提高抗性，保存较长时间，在生产过程中可以将其微胶囊化，但提高了生产成本，因此在饲料工业中应用受到了一些限制。[0007]现有技术中干酪乳杆菌与芽孢杆菌的混合培养，由于干酪乳杆菌是兼性厌氧菌，且其生长所需的营养物质比芽孢杆菌复杂，如果直接混合培养，各菌株未能吸收到较好的营养，菌株活性也不是很好，进而得到的复合微生态制剂的效果并不显著。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种复合微生态制剂及其制备方法，以提供一种干酪乳杆菌与芽孢杆菌的混合培养方法和一种新的高活性微生态制剂。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0010]一种复合微生态制剂，所述复合微生态制剂包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌，所述蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:1~3:1 ~2.5。
[0011]优选地，所述蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:3:2。
[0012]优选地，所述蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是从动物消化道盲肠内容物中筛选获得的，尤其是从鸡盲肠内容物中筛选获得的，也可用普通蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌替代。
[0013]一种制备上述复合微生态制剂的方法，包括以下步骤:
[0014](I)取指数生长后期至稳定期后期的干酪乳杆菌，接种到MRS培养基中，厌氧静置培养24±2小时，获得干酪乳杆菌培养液；
[0015](2)取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，分别接种到LB培养基中，震荡培养12±2小时，所述枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌优选从动物消化道盲肠内容物中筛选获得，因为从消化道盲肠中筛选的枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中可形成内生芽胞，它在肠道短时间定植后，可以消耗大量的氧气，维持肠道厌氧环境，增强肠道对厌氧菌的定植，抑制病原微生物同时促进乳酸菌等有益微生物的生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌的生长，同时，消化道中的枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率；另外，消化道盲肠中的蜡样芽孢杆菌不仅能产生内生孢子，而且芽孢能耐高温，能够耐受胃液、肠液的消化和胆汁的影响，具有较强的肠道定植力，能够在肠道内维持一定数量级的活菌数；本发明中，枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌也可用任何市售菌种代替；
[0016](3)先将步骤(2)的震荡培养后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例I~4:1~4进行不同比例的复合配比，测定不同配比下芽孢杆菌混合液产淀粉酶和蛋白酶的含量，筛选出产淀粉酶和蛋白酶含量高的最佳复合比例，筛选的最佳复合比例为1:1~3，将震荡后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:1~3混合，获得混合液，将混合液接种到LB液体培养基中，37 ± 1°C下220rpm继续震荡培养14± 2h，获得芽孢杆菌培养液；
[0017](4)先将步骤(1)的干酪乳杆菌培养液与步骤(3)的芽孢杆菌培养液进行不同比例的复合配比，所述复合配比的比例范围为:蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例1:1~3:1~4，测定不同复合配比下混合菌液产淀粉酶和蛋白酶的含量，筛选出产淀粉酶和蛋白酶含量高的最佳复合比例，所述最佳复合比例为:蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例1:1~3:1~2.5 ;将干酪乳杆菌培养液与芽孢杆菌培养液按最佳复合比例进行混合，混合后的培养液中蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:1~3:1~2.5，即为所述复合微生态制剂。
[0018]优选地，所述步骤(3)中，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:3混合，所述步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:3:2。
[0019]优选地，所述步骤(3)中，混合液的接种量为每IOOmL的LB液体培养基接种ImL混合液。
[0020]本发明的原理是:本发明首先确定了干酪乳杆菌的产细菌素较高时的生长时间是24~48h，混合芽孢杆菌产酶量较高的生长时间是14~16h，然后将干酪乳杆菌在厌氧条件下培养24h后，再将好氧条件下培养14h的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合液与干酪乳杆菌按比例混合，继续培养10±2h，得到复合效果较好的微生态制剂，再通过不同比例的复合配比，筛选出三种细菌的最佳复合比例，得到产淀粉酶和产蛋白酶含量高的复合菌株。
[0021]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种复合微生态制剂及其制备方法，所述复合微生态制剂的制备方法为液态混合发酵培养，弥补了固态发酵培养的缺陷，实现了多菌株同时共发酵培养，制备简单，成本低；发酵的菌液直接用于动物喂饲，达到有益菌的有效组合，使各种有益菌的优良性能得到充分发挥；所述微生态制剂可直接用来喂饲雏鸡，对鸡的生产性能、免疫性能、肠道pH、肠道微生物等方面都有改善，有利于促进鸡的生长，提高免疫力，增加饲料的消化率；另外，所述复合微生态制剂在体外抑菌试验中，对肠道致病菌具有较好的抑菌活性，在体内的动物喂饲实验中，在不添加任何抗生素药物的情况下，显著提高了白羽肉鸡的平均日增重和免疫性能，改善了白羽肉鸡肠道的菌群环境，促进了白羽肉鸡的生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为干酪乳杆菌生长曲线图 ；
[0023]图2为枯草芽孢杆菌生长曲线图；
[0024]图3为蜡样芽胞杆菌生长曲线图；
[0025]图4为蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌不同复合配比下产蛋白酶活性；
[0026]图5为蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌不同复合配比下产淀粉酶活性；
[0027]图6为蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌不同复合配比下产蛋白酶活性；
[0028]图7为蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌不同复合配比下产淀粉酶活性；
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图1~7对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0030]实施例1[0031]1、培养基配制
[0032]YPD培养基:包括10g/L的酵母粉，20g/L的蛋白胨B和20g/L的D~无水葡萄糖，115°C下灭菌15分钟；
[0033]MRS培养基:包括10.0g/L的蛋白胨，8.0g/L的牛肉粉，4.0g/L的酵母粉，20.0g/L的葡萄糖，2.0g/L的磷酸氢二钾，2.0g/L的柠檬酸氢二胺，5.0g/L的乙酸钠，0.2g/L的硫酸镁，0.04g/L的硫酸锰和1.0g/L的吐温~80，25 °C下调节pH值至5.7±0.2，118°C下灭菌15分钟；
[0034]LB培养基:包括10.0g/L的胰蛋白胨，5.0g/L的酵母浸粉和10.0g/L氯化钠，25°C下调节pH值至7.0±0.1，121°C下灭菌15分钟。
[0035]以上培养基中加入2g/L的琼脂，配制成固体培养基。
[0036]2、制备方法
[0037](I)干酪乳杆菌的培养
[0038]无菌条件下，取干酪乳杆菌冻干菌种，在MRS固体培养基上涂布，37 °C下静置厌氧培养20h，挑取单菌落，在MRS固体培养基上进一步划线纯化，37°C培养20h后，挑取单菌落，接种到IOOmL的MRS液体培养基中，37°C下厌氧静置培养，分别于26h，0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h,在吸光度600nm下测定OD值，得到干酪乳杆菌的的生长曲线，所述生长曲线如图1所示，从图1中可以看出，干酪乳杆菌在24~48h时处于指数生长后期至稳定期后期，取指数生长后期至稳定期后期的干酪乳杆菌菌液，接种到MRS培养基中，37°C厌氧静置培养24h，获得干酪乳杆菌培养液；
[0039](2)芽孢杆菌的筛选
[0040]无菌条件下，取0.5g鸡盲肠内容物，加入4.5mL的无菌生理盐水，充分震荡摇匀后，放80°C水浴lOmin，取10(^1^菌液，加入营养肉汤液体培养基中，371:振荡培养24h后进行倍比稀释，倍比稀释的稀释度为1(Τ4、1(Τ5和1(Τ6，分别取0.1mL倍比稀释后的菌液，涂布于YH)平板上，观察菌落形态，再挑取单菌落，接种到生化发酵管中培养18~24h并观察，根据生化鉴定管中的反应和菌落形态，参照第八版伯杰氏细菌鉴定手册，筛选出枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；
[0041]将筛选出的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分别接种到50mL的LB液体培养基中，37±1 °C 下，220rpm 震荡培养，分别于 0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h，在吸光度600nm下测定OD值，得到两株芽孢杆菌
的的生长曲线，结果如图1和图2所示，从图中可以看出，枯草芽孢杆菌的指数生长后期至稳定期后期的培养时间为12~20h，蜡样芽孢杆菌的指数生长后期至稳定期后期的培养时间为12~24h ；
[0042]取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，分别接种到LB培养基中，37 ± I °C下220rpm震荡培养12±2h ;
[0043](3)将步骤(2)的震荡培养后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例I~4:1~4进行不同比例的复合配比，获得不同配比的混合液，分别取不同配比的混合液接种到LB液体培养基中培养，每IOOmL的LB液体培养基接种ImL菌液，测出两种芽孢杆菌不同比例混合下产淀粉酶、蛋白酶含量，其中蛋白酶的测定采用考马斯亮蓝法，淀粉酶的测定采用碘-淀粉比色法，结果如图4和图5所示，从图中可以看出，产淀粉酶、蛋白酶含量较多的最佳复合比例为1:1~3 ;
[0044]根据上述获得的最佳复合比例，将步骤(2)的震荡后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:1混合，获得混合液，取1%体积比的混合液接种到LB液体培养基中，37±1°C下220rpm继续震荡培养14 ±2h，获得芽孢杆菌培养液；
[0045](4)将步骤(1)的干酪乳杆菌培养液与步骤(3)的芽孢杆菌培养液进行不同比例的复合配比，所述复合配比的比例范围为:蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例1:1~3:1~4，测定不同复合配比下混合菌液产淀粉酶和蛋白酶的含量，筛选出产淀粉酶和蛋白酶含量高的最佳复合比例，结果如图6和图7所示，从图中可以看出，所述最佳复合比例为:蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例1:1~3:1 ~2.5 ;
[0046]根据上述最佳复合比例，将步骤(1)干酪乳杆菌培养液与步骤(3)的芽孢杆菌培养液按最佳复合比例进行混合，混合后的培养液中蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:1:1，即为所述复合微生态制剂。
[0047]实施例2
[0048]本实施例中，培养基配制与实施例1相同，制备方法包括以下步骤:
[0049](I)干酪乳杆菌的培养
[0050]无菌条件下，取干酪乳杆菌冻干菌种，在MRS固体培养基上涂布，37 °C下静置厌氧培养20h，挑取单菌落，在MRS固体培养基上进一步划线纯化，37°C培养20h后，挑取单菌落，接种到IOOmL的MRS液体培养基中，厌氧条件下静置培养24h，此时干酪乳杆菌进入指数生长后期或稳定期后期，取培`养后的菌液，接种到MRS培养基中，37°C厌氧静置培养24h，获得干酪乳杆菌培养液；
[0051](2)芽孢杆菌的培养
[0052]无菌条件下,取0.5g鸡盲肠内容物,加入4.5mL的无菌生理盐水，充分震荡摇匀后，放80°C水浴lOmin，取100μ L菌液，加入营养肉汤液体培养基中，37°C振荡培养24h后进行倍比稀释，倍比稀释的稀释度为1(Τ4、1(Τ5和1(Τ6，分别取0.1mL倍比稀释后的菌液，涂布于YH)平板上，观察菌落形态，再挑取单菌落，接种到生化发酵管中培养18~24h并观察，根据生化鉴定管中的反应和菌落形态，参照第八版伯杰氏细菌鉴定手册，筛选出枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；
[0053]将筛选出的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分别接种到50mL的LB液体培养基中，37土 1°C下220rpm震荡培养，取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，再分别接种到LB液体培养基中，37 ± I °C下220rpm震荡培养12h ；
[0054](3)将步骤(2)的震荡培养后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:3混合，获得混合液，取1%体积比的混合液接种到LB液体培养基中继续培养，获得芽孢杆菌培养液；
[0055](4)将步骤(1)干酪乳杆菌培养液与步骤(3 )的芽孢杆菌培养液混合，混合后的培养液中蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:3:2，即为所述复合微生态制剂。
[0056]实施例3[0057]本实施例中，步骤(3)的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的细菌浓度比例为1:3 ;步骤(4)的混合后的培养液中，蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为I:3:2.5，其余步骤及培养基配制同实施例2。
[0058]将实施例1~3制备获得的复合微生态制剂分别喂饲I日龄白羽肉鸡雏鸡，将雏鸡分成四组，每组15只，在I~42天内测定平均日增重，并测定白羽肉鸡在42d时的免疫器官指数，空白对照组中，将微生态制剂用水代替，阳性对照为乳酸菌，芽孢杆菌，酵母锌，酵母硒复合配制的复合微生态制剂，测定结果如下表1所示:
[0059]表1:复合微生态制剂对白羽肉鸡平均日增重及免疫器官指数的影响分析
【权利要求】
1.一种复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌，所述蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:1 ~3:1 ~2.5。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生态制剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:3:2。
3.根据权利要求1所述的一种复合微生态制剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是从消化道盲肠内容物中筛选获得的。
4.根据权利要求3所述的一种复合微生态制剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是从鸡盲肠内容物中筛选获得的。
5.一种制备如权利要求1所述复合微生态制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取指数生长后期至稳定期后期的干酪乳杆菌，接种到MRS培养基中，厌氧静置培养24±2小时，获得干酪乳杆菌培养液； (2)取指数生长后期至稳定期后期的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，分别接种到LB培养基中，震荡培养12±2小时； (3)将步骤(2)的震荡培养后的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:1~3混合，获得混合液，将混合液接种到LB液体培养基中继续培养，震荡培养14±2小时；，获得芽孢杆菌培养液； (4)将步骤(1)的干酪乳杆菌培养液与步骤(3)的芽孢杆菌培养液混合，混合后的培养液中蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:1~3:1~2.5，即为所述复合微生态制剂。
6.根 据权利要求5所述的一种制备复合微生态制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按细菌浓度比例1:3混合，所述步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌的细菌浓度比例为1:3:2。
7.根据权利要求5所述的一种制备复合微生态制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合液的接种量为每IOOmL的LB液体培养基接种ImL混合液。
【文档编号】C12N1/20GK103865854SQ201410103781
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】祁克宗, 谢玲玲, 涂健, 汪雪雁, 薛秀恒, 付瑞燕, 张明 申请人:安徽农业大学