小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应用。

背景技术：

长久以来抗肿瘤药物是被广泛关注和研究的热点问题之一。目前对肿瘤或癌症的治疗，通常是采用手术治疗结合放疗和化疗的综合疗法。放射线和化疗药导致细胞凋亡，从而杀伤肿瘤细胞。高剂量的放疗和化疗药物可以破坏或消灭癌细胞，但同时也损害正常细胞，使患者免疫功能下降，对人体造成一系列毒副作用。

多肽药物是目前生物医药领域中极具发展前景的崭新领域，以其高效、安全、特异性强等特点逐渐用于癌症的预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物——蛋白质来实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功能的蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。

基于肿瘤的发生发展及治疗预后的机制研究中，除了传统的原癌抗癌基因外，目前关于活性氧（reactive oxidative species，ROS）在肿瘤生物学中的作用是一个热点的研究领域。ROS 在各类细胞中不断的产生和清除，发挥着其正常及病理的功能作用。Nrf2在维持细胞的ROS相对稳态上发挥着重要的作用，ROS 可通过Keap1第151 位半胱氨酸的氧化修饰，改变Keap1的构象从而释放Nrf2，使得Nrf2脱离泛素降解状态，进而入核并结合于下游多个基因的启动子区域的抗氧化反应元件，调节抗氧化靶基因NQO1、GSTs及HMOX1等转录表达，降低ROS的水平。

许多实验研究发现，在肿瘤组织（包括肺癌，肝癌，乳腺癌，卵巢癌等）中Nrf2和Prdx5基因高表达，同时又发现其高表达导致现有的抗肿瘤药物无效。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种小分子多肽Prdx5截短体，具有抗肿瘤功能，满足生物医药使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述小分子多肽Prdx5截短体的表达载体。本发明还有一目的是提供上述小分子多肽Prdx5截短体的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

小分子多肽Prdx5截短体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的小分子多肽Prdx5截短体的编码基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的小分子多肽Prdx5截短体的编码基因的载体。

所述的小分子多肽Prdx5截短体在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明研制开发出靶向作用在Nrf2上的新型小分子多肽Prdx5截短体，该多肽分子量小，穿透性能好；可在原核表达系统中表达，生产成本低；具有很好的稳定性，能在一定范围内耐受酸碱度和温度的变化。

附图说明

图1是Nrf2和Prdx5全长蛋白的相互作用及免疫沉淀结果图；

图2是小分子多肽Prdx5截短体的编码基因载体质粒图；

图3是Prdx5与Nrf2相互作用的结构域图；

图4是干扰小分子多肽Prdx5截短体表达后对细胞转移的影响结果图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

材料：Protein A/G beads，细胞裂解液，Nrf2抗体，Prdx5抗体，IgG。

方法：细胞予预冷的0.01M PBS洗涤2次；加入1mL PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移至1.5mL离心管中，1000g×5min离心收集细胞；加入配置好的500μL细胞裂解液置于轮转仪上4℃轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管。预澄清 加入20μL混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g 离心5min（4℃），将上清液转移至新离心管，弃珠子。取40-60μL上清液作为Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别加入等量（1μg）Normal IgG 或相应抗体, 在DNA混合仪上转动2小时（4℃）。在每个离心管中各加入30μL 混匀的Protein A/G beads 继续转动2小时。然后900g 离心5min（4℃），弃上清。加入1mL洗涤缓冲液洗涤珠子。900g离心5min（4℃），共洗涤3次。最后将40-60μL 2×SDS loading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。连同Input样品一起进行Western blot检测。

结果如图1所示：在组织IP和细胞IP中均存在Nrf2和Prdx5全长蛋白的相互作用。

实施例2

本发明提供一种能抑制Nrf2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽。该小分子多肽由自行设计的基因编码，经聚合酶链反应（PCR）合成后插入表达质粒。将表达载体转入大肠杆菌BL21，在LB培养基中培养，37℃下诱导表达。破菌取上清，应用OMEGA公司的DNA抽提试剂盒获得纯化的目的DNA，命名为Prdx5；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体构建过程如下：

1）表达载体的构建：设计引物，经PCR法连接，通过限制性内切酶Hind III和Kpn I双酶切后，插入p3XFLAG-Myc-CMV质粒，如图2所示。构建的表达载体经酶切鉴定正确。

材料：E.coli BL21/DE3工程菌株为本室冻存；T4 DNA连接酶为Gibco BRL公司产品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物技术公司；Ni离子亲和层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清（FCS）、DMEM培养基、1640培养基为Hyclone 公司产品。

方法：①表达载体的构建

基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下：

上游引物：5’ -CCAAGCTTACCATGTCCAAGACACACCTGCC-3’；

下游引物：5’ -GGGGTACCGAAAGCTGTGAGATGATATTGGGTGCC-3’。

PCR反应体系为：H₂O 22μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PCMV-N-FLAG-PRDX5质粒 1μL，Taq DNA聚合酶25μL。

PCR反应条件为：94℃ 变性4min，55℃退火，72℃引物延伸。

在基因片段两端设计了Kpn I和Hind III两个限制性酶切位点，双酶切连入p3XFLAG-Myc-CMV质粒。

连接体系为：H₂O 10μL，T4连接酶 buffer1μL，T4连接酶2μL，Fragment1μL。

另设对照组，不加fragment，以H₂O补足体积。PCR机中连接过夜。

用连接产物转化JM109感受态菌。转化步骤为：1）100μL感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5μL，静置30分钟； 2）42℃水浴2分钟；3）冰浴5分钟；4）加入不含抗生素的LB培养基，37℃下，150 RPM震荡培养50分钟。5）将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37℃孵箱培养过夜。6）挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37℃摇床震荡培养。

②载体的鉴定：1）用试剂盒提取阳性克隆质粒DNA。2）用Hind III和Kpn I双酶切鉴定质粒DNA，送上海桑尼生物技术公司测序。双酶切体系为：H₂O 14μL，Green buffer 2μL，DNA 2μL，Hind III 1μL，Kpn I 1μL，37℃水浴4小时。2）在大肠杆菌中诱导表达：转化大肠杆菌BL21/DE3，挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养12h。3）纯化：收集转化菌，加入solution I 250 uL，离心机13000R离心10min；加入solution II 250 uL，反复颠倒20次，呈拉丝状后离心机13000R离心10min；加入solution III 350 uL，离心机13000R离心10min；加入DNA washing buffer 750 uL，离心机13000R离心1min；最后应用OMEGA公司的DNA抽提试剂盒获得纯化的目的DNA。

ƒ 截短IP：将Prdx5截短体的表达载体转入肺癌细胞中，进行细胞免疫共沉淀，具体步骤同实施例1。

结果如图3所示：Prdx5截短体与SOX2蛋白之间的相互作用。其中除了Prdx5全长蛋白（wt）能与SOX2蛋白相互作用外，Prdx5截短突变体（2）也能与SOX2蛋白发生相互作用。

实施例3

材料：H1299细胞，无血清培养基，PBS，6孔板，marker笔，直尺，枪头。

方法：①先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5%CO₂培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

②将转染Prdx5截短体的细胞和转染空载标签的细胞分别加入到六孔板中，方法同上。

结果如图4所示，野生型H1299细胞（左）和转染空载的H1299细胞（中）所表现出来的转移情况要明显强于转染Prdx5截短体的H1299细胞（右），说明Prdx5的截短体能抑制肿瘤细胞的转移。

SEQUENCE LISTING

<110> 南通大学

<120> 小分子多肽Prdx5及其载体和应用

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