本发明属于刺苋的鉴定方法，具体涉及一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法。
背景技术：
入侵生物的传播途径主要有3种：一种是有意识引进，即人为引进具有一定经济价值、实用价值的物种，最后演变为入侵种；二是无意识引进，即随着贸易、运输、旅游等活动而传入的物种演变而成的入侵种；三是自然入侵，即通过物种自身的扩散能力或者借助自然条件而实现的入侵。据悉，中国外来入侵植物中约50％是由于检疫人员疏漏，随贸易品、运输工具等方式引进，即无意识引进。但随着贸易全球化，人为活动范围的扩大，进出口贸易量的与日俱增，无疑对检疫工作提出了更高的要求。而检疫工作中面临的业务量大、鉴定专家匮乏也是实际存在的困难。
据调查研究显示，中国外来入侵植物约500种，主要集中在菊科(Compositae)、豆科(Leguminosae)、禾本科(Gramineae)等几个科中，优势属中较为突出的是苋属(Amaranthus)。苋属植物作为粮食、蔬菜、观赏以及染料植物，对生态环境、人类活动等产生积极影响，但该属的刺苋(A.spinosus)、反枝苋(A.retroflexus L.)、长芒苋(A.palmeri S.Watson)等属于杂草，具有感化潜力，特别是刺苋，对生长在其周围植物的萌发和光合速率都会有一定的影响，降低多种作物的生长和产量。
目前植物物种鉴定通常以传统的形态学鉴定为主，若植物以种子、果实等形态出现，或形态学信息不足等都会使鉴定面临困难。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，本发明利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性的片段，解决形态学鉴定的不足。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
步骤1，刺苋DNA提取：
取样本2g，液氮研磨至粉末状，取0.2g研磨后的粉末状样品用试剂盒提取DNA，将提取到的DNA溶解在50μL去离子水中，将得到的DNA样品置于-20℃冰箱保存、备用；
步骤2，特异性引物和探针的设计与合成：
基于叶绿体的PsbA基因，设计选取具有刺苋特异性的引物和探针，所述特异性引物和探针分别为：
F：TAAAGGAGCAATGCCGTTTTCTT，
R：CAGTATTCAGAACTTGCCTTTGA，
P：FAM-TTTTTTTTTTAATTCAAAATGGATTCAAGAT–Eclipse，
步骤3，TaqMan实时荧光PCR：
将步骤2设计选取的引物和探针对步骤1中的DNA样品进行荧光PCR扩增反应，通过荧光PCR扩增后得到Ct值，通过Ct值对样品是否含有刺苋进行判定。
所设计的引物和探针对刺苋具有物种的特异性，能用于刺苋的鉴定。
所述步骤3中实时荧光PCR扩增反应体系如下：10μL Premix Ex Taq，10pmol/μL的上游引物0.4μL，10pmol/μL的下游引物0.4μL，10pmol/μL的探针0.4μl，取上述提取得到DNA液2μL，用去离子水补足体积至20μL，应用荧光定量PCR仪进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；62℃，23sec；40个循环，所述实时荧光PCR均重复三次，取三次结果的平均Ct值，当平均Ct值＞35.0或无Ct值，则判定为阴性，当Ct值≤35.0，则判定为阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
①本发明利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性的片段，有效解决了形态学鉴定不足，也为快速检疫鉴定携带或夹带的植物样本或种子提供有效的解决方案；②本发明实时荧光PCR方法是基于传统PCR法的基础上，设计具有物种特异性的引物和探针，通过特异性引物的扩增，鉴定该物种是否为目标物种，同时结合具有荧光标识的探针实现同步扩增同步检测，提高检测效率。
具体实施方式
本实施例刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
步骤1，采集样品：
供试植物样品包括苋科苋属7种(包含刺苋的7个不同地理种和长芒苋的2个不同地理种)和苋科非苋属8种，以及苋科外植物3种共25个样品见表1，在野外及田间采集相关植物样品，每种样品均采集3株，将采集的样品分别放入塑料样品保鲜袋中，带回实验室后置于-70℃冰箱保存、备用；
表1供试样品
步骤2，样本DNA提取：
将所述步骤1备用的样品中的每株植物取2g叶片，分别用液氮研磨后混匀，得到样品的液氮混合物，取0.2g样品的液氮混合物，采用试剂盒提取DNA，将提取得到的DNA溶解在50μL去离子水中，置于-20℃冰箱保存、备用；
步骤3，特异性引物和探针的设计：
引物和探针的设计是基于叶绿体的PsbA基因，通过Primer 5软件设计选取了具有刺苋特异性的引物和探针ASP-1见表2，本发明所用的TaqMan实时荧光PCR引物和探针由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，
表2引物和探针序列
步骤4，TaqMan实时荧光PCR：
实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara，中国)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取得到DNA液2μL，用去离子水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle 480(Roche，美国)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；58℃-62℃，23sec；40个循环。所述实时荧光PCR均重复三次，取三次结果的平均Ct值，当平均Ct值＞35.0或无Ct值，则判定为阴性，当Ct值≤35.0，则判定为阳性。
作为优选，本实施例步骤2中试剂盒为QIAGE N DNeasy Plant Mini Kit(美国)试剂盒。
作为进一步优选，本实施例荧光定量PCR仪为lightcycle 480。
本实施例在特异性和灵敏度验证实验中，荧光PCR反应都重复三次，表示结果的Ct值表示每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，取三次结果的平均值；SD表示标准差。
本实施例的结果与分析：
1.引物和探针的特异性验证
本实施例中设计的引物和探针ASP-1经特异性验证后显示，引物和探针ASP-1在不同的扩增温度下，有不同的特异性，结果显示62℃时表现的特异性最佳，此时，只有目标物种刺苋得到阳性扩增，见表3，引物和探针组合ASP-1具有较高的刺苋特异性。
表3引物探针特异性验证
注：*为荧光PCR扩增温度；—:Ct值低于检测限。
2.引物和探针灵敏度验证
选取了衢州刺苋作为代表，对其DNA进行2倍梯度稀释，检测引物和探针ASP-1的灵敏度。结果显示如表4，当DNA浓度稀释至0.03ng/μL时，ASP-1得到的Ct值为32.2，当浓度降至0.02ng/μL时，Ct值已经低于检测限。该引物和探针的灵敏度为0.03ng/μL左右。
表4引物和探针灵敏度验证
注：*用Nanodrop 1000(Thermo)实际测得浓度，该DNA抽提自衢州刺苋；
**2倍梯度稀释推算得到的浓度；—:Ct值低于检测限。
3.总结
本发明在叶绿体PsbA基因上设计了适合刺苋鉴定的引物和探针序列，建立了实时荧光PCR检测技术。该方法对刺苋的检测灵敏度可达到0.03ng/μL，足以满足日常鉴定的检测需求。同时该方法，从DNA抽提到获取实时荧光PCR结果，整个过程可在3h内完成，能达到快速鉴定入侵杂草刺苋的目的。荧光PCR方法适用于植物任何生长周期和生长部位，不受实验材料存活状态的影响；同时可对疑似目标植物残体进行快速准确鉴定，弥补了形态学鉴定方法的不足，可作为形态鉴定的辅助方法，可有效的对刺苋植物进行鉴定。
尽管上述实施例已对本发明作出具体描述，但是对于本领域的普通技术人员来说，应该理解为可以在不脱离本发明的精神以及范围之内基于本发明公开的内容进行修改或改进，这些修改和改进都在本发明的精神以及范围之内。