H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的活性。这两个基因是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。其病原体AIV为单股负链分节段的RNA病毒，其中血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是两个比较重要的基因节段，Susan等{Baigent,Susan J.,and John W.McCauley.“Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture.”Virus research 79.1(2001):177-185.}的研究表明HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。

荧光定量PCR技术具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点，多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。

当今呼吸道传染病在全球范围内广泛传播与流行，新的病种不断被发现，流行地域不断扩展，流行的频率不断增强，人感染H10N7禽流感病毒输入的危险性日益增高，对国境口岸的卫生安全造成了严重威胁，因此对呼吸道传染病的监测是国境口岸卫生检疫的重要工作。目前，针对H10N7亚型一步法实时荧光定量RT-PCR方法未见报道，因此，本领域技术人员有必要提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的人感染H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的之一提供一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，本发明采用了以下技术方案：

一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，包括：

(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；

(2)引物组和探针组；引物组有引物1至4，分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列，所述引物和探针序列如下：

所述的特异性引物为：

引物1为H10正向引物：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’(SEQ ID No.01所示)；

引物2为H10反向引物：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’(SEQ ID No.02所示)；

引物3为N7正向引物：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’(SEQ ID No.O4所示)；

引物4为N7反向引物：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’(SEQ ID No.O5所示)；

所述的特异性探针为：

探针A为H10探针：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’(SEQ ID No.O3所示)；

探针B为N7探针：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’(SEQ ID No.O6所示)。

所述探针A中的“FAM”和探针B中的“VIC”表示现有技术中所采用的荧光报告基团。

优选的，所述RNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液一、洗涤液二和洗脱液；

所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针A、探针B、逆转录酶、DNA聚合酶、RNase抑制剂；；阳性对照品采用H10N7阳性对照，阴性对照品采用DEPC H₂O。

本发明的目的之二是提供一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，包括如下检测步骤：

S1、标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；

S2、RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用磁珠法进行核酸提取；

S3、RT-PCR扩增反应：

RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶，DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水，RT-PCR质控品，标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对HA和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计,能够区别其他病毒株；

所述的特异性引物为：

H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’(SEQ ID No.01所示)；

H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’(SEQ ID No.02所示)；

N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’(SEQ ID No.O4所示)；

N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’(SEQ ID No.O5所示)；

所述的特异性探针为：

H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’(SEQ ID No.O3所示)；

N7-P：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’(SEQ ID No.O6所示)；

将上述混合好的反应液进行PCR扩增及荧光信号检测；

S4、结果判定：对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有H10N7禽流感病毒。

优选的，步骤S2中所述的RNA提取采用病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul标本，按照试剂盒说明书中的操作步骤提取RNA，最后用60ul洗脱液洗脱RNA。

优选的，步骤S3中所述的RT-PCR反应体系为：RT-PCR反应液10.0μl,引物探针混合液2.75μl，逆转录酶0.2μl，DNA聚合酶0.2μl,RNase抑制剂0.4μl，DEPC H₂O 6.45μl,标本核酸5.0μl。

优选的，步骤S3中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸60s，40个循环。

优选的，所述探针H10-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述探针N7-P的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。

优选的，步骤S3中所述的引物H10-F、引物H10-R、探针H10-P、引物N7-F、引物N7-R和探针N7-P的摩尔比为3：3：3：2：2：2。

优选的，步骤S3中RT-PCR反应体系的特异性正、反向引物和探针的浓度均为10μM，正向引物分别为H10-F、N7-F，反向引物分别为H10-R、N7-R。

本发明的有益效果在于：

本发明试剂盒和检测方法针对H10N7病毒的双靶基因，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，不仅首次公开了针对H10N7禽流感病毒的一步法实时荧光定量RT-PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。

附图说明

图1是H10N7流感病毒荧光定量RT-PCR特异性检测结果示意图。其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数,CT值为达到阈值线所需要的循环数。A：该体系对甲型H10N7流感病毒核酸检测扩增结果；B-G：该检测体系对甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、甲型H9N2流感病毒及空白对照的扩增检测结果。

图2是H10N7流感病毒荧光定量RT-PCR H10基因检测灵敏度结果示意图。其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/ml浓度甲型H10N7流感病毒进行扩增检测的结果。

图3是H10N7流感病毒双重荧光定量RT-PCR N7基因检测灵敏度结果示意图。其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数。图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/ml浓度甲型H10N7流感病毒进行扩增检测的结果。

图4是H10N7流感病毒双重荧光定量RT-PCR临床样本检测结果示意图。其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数。图中A、B、C表示甲型H10N7流感病毒核酸的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，包括：

(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；

(2)引物组和探针组；引物组有引物1至4，分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列，所述引物和探针序列如下：

所述的特异性引物为：

引物1：H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’SEQ ID No.01；

引物2：H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’SEQ ID No.02；

引物3：N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’SEQ ID No.O4；

引物4：N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’SEQ ID No.O5；

所述的特异性探针为：

探针A：H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’SEQ ID No.O3；

探针B：N7-P：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’SEQ ID No.O6。

其中，

(1)所述RNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液一、洗涤液二和洗脱液；

(2)所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针A、探针B、逆转录酶、DNA聚合酶、RNase抑制剂；

(3)阳性对照品：H10N7阳性对照；

(4)阴性对照品：DEPC H₂O。

实施例2

一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法

一、实验步骤

1.材料、试剂、仪器

人感染H10N7禽流感病毒实时荧光PCR检测引物探针委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，病毒RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，荧光定量PCR仪为ABI7500。

2.标本准备

阳性标本为人感染H10N7禽流感病毒滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。

3.RNA的提取

使用病毒RNA提取试剂盒(磁珠法)提取标本RNA。取待检唾液样本200μl，依次加入20μl蛋白酶混合液，200μl裂解液，56℃孵育10min，再将离心管置于磁力架上，吸弃上清；用600μl洗涤液洗去杂质，弃上清，重复洗涤两次；再用80％的酒精洗去杂质，弃上清；最后用60μl洗脱液洗脱得到的RNA即为所要提取的RNA。

4.靶基因的扩增

4.1引物和探针的设计

根据H10N7序列设计特异性引物和探针，特异性引物和探针是针对HA基因和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株，分别为两对特异性引物和两条特异性探针，特异性引物和探针为：

H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’SEQ ID No.O1；

H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’SEQ ID No.O2；

H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’SEQ ID No.O3；

N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’SEQ ID No.O4；

N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’SEQ ID No.O5；

N7-P：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’SEQ ID No.O6。

4.2阳性对照

本方法中的阳性对照为HA基因和NA基因的两个合成基因片段，连接到pUC57质粒载体上，用DEPC水进行10⁶倍稀释后，最终作为本方法中的阳性对照。

4.3RT-PCR反应平台：

RT-PCR反应体系为：RT-PCR反应液10.0μl,10μM的引物、探针混合液2.75μl，逆转录酶0.2μl，DNA聚合酶0.2μl，RNase抑制剂0.4μl，DEPC H₂O 6.45μl,标本核酸5.0μl。其中，引物H10-F、引物H10-R、探针H10-P、引物N7-F、引物N7-R和探针N7-P的摩尔比为3：3：3：2：2：2。

RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸60s，40个循环。

二、实验结果

1.特异性试验结果：如图1所示，依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对禽流感H10N7病毒具有较好的特异性，禽流感H10N7型患者的唾液拭子显示阳性反应，对流感病毒H1N1，H3N2，H5N1，H7N9，H9N2以及空白对照流感病毒等均无交叉反应。

2.灵敏性试验结果：对禽流感H10N7型病毒毒株，采用MDCK细胞进行病毒效价测定(100TCID50/ml)，将其稀释至1000、100、10、5、0TCID50。病毒RNA用德国QIAGEN公司的试剂盒说明书提取，用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测，如图2(FAM荧光通道)和图3(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/ml浓度甲型H10N7流感病毒进行扩增检测的结果，结果表明荧光RT-PCR方法检测敏感性达到5TCID50。

3.临床样本的检测结果：从禽流感H10N7型疑似患者的10份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明H10N7病毒双重荧光RT-PCR方法进行检测，结果如图4所示，本发明方法检测出H10N7核酸阳性3份。

综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法敏感性好、特异性高、准确可靠。

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<110> 解码（上海）生物医药科技有限公司

<120> 一种人感染H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法

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