人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用的制作方法

文档序号：12056440阅读：204来源：国知局

本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及人工合成的对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因基因序列及其应用。

背景技术：

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的10％左右，直接经济损失达100亿美元以上。过去几十年的防治主要依赖化学农药，在为农业生产做出巨大贡献的同时，化学农药却造成了环境污染、人畜中毒、生态失衡等严重后果。在这些巨大的代价面前，全球都在寻找和开辟新的病虫害防治策略和技术。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽胞的同时，能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology and Molecular Biology Review,62(3):775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又称δ-内毒素(Delta-endotoxin)，在昆虫中肠首先溶解，成为原毒素，之后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素，与中肠上特异的受体进行结合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，导致昆虫死亡，苏云金芽胞杆菌对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

目前人们已经克隆了825种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属318种模式基因(可参见http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt//holo2.html)。

1987年，Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草，开创了人类利用转基因技术防治害虫的先河(Vaeck et al,1987，Nature,328:33-37)。但是在转基因研究中人们发现将来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物，存在着表达产物不稳定、表达量少的缺陷(van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524)。具体问题包括：1)天然Bt基因高含AT，超过60％，在植物体内这样的基因表达的mRNA极易被植物降解；2)天然Bt基因中存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，从而造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密码子与植物存在较大差异，会造成蛋白翻译效率降低；4)天然Bt基因作为原核生物来源的基因，其结构与植物等真核生物差异显著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，这些关键问题的解决是实现Bt基因在植物中高效、稳定表达的重要保证。随着这些技术的改进和完善，自1996年以来的二十年内，转基因抗虫玉米、马铃薯、水稻等作物相继研制成功，并逐步进入应用阶段(James C，ISAAA Briefs，2016)。

来源于苏云金芽胞杆菌的杀虫基因cry2Ah1被证明对鳞翅目害虫玉米螟有体重抑制活性，对棉铃虫有生长抑制活性，同时对Cry1Ac抗性棉铃虫也有很好的生长抑制活性(Shu et al,Journal of Invertebrate Pathology,2013,114:31-33)。目前还未有对cry2Ah转入植物的相关报道。影响外源基因在植物中的表达因素很多，包括不同启动子、增强子(enhancer)的应用、基因的密码子优化形式及终止信号识别序列等，不同的调控元件及不同的基因密码子序列将会产生不同的转基因事件(event)，产生的抗虫效果也不尽相同。

技术实现要素：

本发明的目的是提供对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因的人工优化、改造并合成的新的DNA序列，以及通过转化使植物具有抗虫特性。

一种用于植物转化的mcry2Ah-vp的人工合成序列，其特征是该具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。

一种用于植物转化的mcry2Ah-sp的人工合成序列，其特征是该具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。

一种植物表达载体，其特征是该植物表达载体含有上述的人工合成序列和在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。

所述双元载体为pCAMBIA2300载体。

所述植物表达载体为pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN，其结构分别如图3、图4所示。

上述植物表达载体在转化植物使之生产抗虫特性方面的应用。

所述转化的方法为农杆菌介导法，所述植物为烟草或玉米。

所述抗虫为抗棉铃虫及鳞翅目害虫。

所述植物表达载体为pCSm2Ah-spN，所述植物为烟草。

本发明对Bt cry2Ah(SEQ ID NO：1)和它的两个突变体cry2Ah-vp,cry2Ah-sp的核苷酸序列进行了密码子优化，并通过人工合成的方式合成了新基因，构建植物表达载体转化植物，获得了高抗虫的转基因植物，提高Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因在转基因过程中的转化成功率，同时提高在转基因植物中的表达量和稳定表达的特性。与转mcry2Ah(SEQ ID NO：2)和mcry2Ah-vp(SEQ ID NO：3)植物相比，转mcry2Ah-sp(SEQ ID NO：4)基因的植物表现出对抗性害虫的高毒力，所以mcry2Ah-sp基因是用于延缓害虫对Bt基因产生抗性及抗性害虫治理的重要候选基因，有很好的应用潜力。

附图说明

图1植物表达载体pCS2AhN构建示意图，

图2植物表达载体pCSm2AhN构建示意图，

图3植物表达载体pCSm2Ah-vpN构建示意图，

图4植物表达载体pCSm2Ah-spN构建示意图，

图5转cry2Ah基因烟草的PCR检测，

其中M DNA分子量Marker；1以pCS2AhN质粒为模板的PCR扩增；2以非转基因烟草基因组DNA为模板的PCR扩增；3～6以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；7以H₂O为模板的空白对照；

图6转mcry2Ah基因烟草的PCR检测，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2AhN质粒为模板的PCR扩增；2以非转基因烟草基因组DNA为模板的PCR扩增；3～6以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；7以H₂O为模板的空白对照；

图7转mcry2Ah-vp基因烟草的PCR检测，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2Ah-vpN质粒为模板的PCR扩增；2以非转基因烟草基因组DNA为模板的PCR扩增；3～10以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；11以H₂O为模板的空白对照；

图8转mcry2Ah-sp基因烟草的PCR检测，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2Ah-spN质粒为模板的PCR扩增；2以非转基因烟草基因组DNA为模板的PCR扩增；3～15以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；16以H₂O为模板的空白对照；

图9转基因烟草的southern blot检测

其中P以pCSm2AhN质粒中的mcry2Ah表达盒为正对照；1～3转mcry2Ah-sp基因烟草；4～5转mcry2Ah-vp基因烟草；6转mcry2Ah基因烟草；N非转基因烟草；B空白对照；

图10转基因烟草的ELISA检测

图11转基因烟草的qRT-PCR检测

图12转基因烟草对敏感棉铃虫的抗虫性鉴定

其中A非转基因烟草叶片和转cry2Ah基因烟草叶片的抗虫性检测；B转mcry2Ah1基因烟草叶片的抗虫性检测；C转mcry2Ah1-vp基因烟草叶片的抗虫性检测；D转mcry2Ah1-sp基因烟草叶片的抗虫性检测；

图13转基因烟草对Cry1Ac抗性棉铃虫的抗虫性鉴定

其中A非转基因和转cry2Ah基因烟草叶片的抗虫性检测；B转mcry2Ah1基因烟草叶片的抗虫性检测；C转mcry2Ah1-vp基因烟草叶片的抗虫性检测；D转mcry2Ah1-sp基因烟草叶片的抗虫性检测；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

下面所涉及的生物材料在本申请人的实验室均有保藏，可以对外发放。

1、Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因的密码子改造和优化

Bt cry2Ah1基因(GenBank No.ACL13555.1)是中国农业科学院植物保护研究所张杰课题组从国内分离的Bt菌株中克隆的基因，基因的编码区有1899bp，核酸序列见SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质由632个氨基酸残基组成，通过对Cry2Ah1蛋白序列结构域分析，存在三个保守的结构域：结构域Ⅰ(Endotoxin_N)、结构域Ⅱ(Endotoxin_M)和结构域Ⅲ(Endotoxin_C)。按照植物偏好的密码子对cry2Ah1基因序列的632个氨基酸的编码序列进行了优化，原始cry2Ah1基因GC含量34％，改造后基因的GC含量为61.6％，与原始cry2Ah1核酸序列的相似性为65.82％，有535个氨基酸的编码碱基发生改变，核酸序列见SEQ ID NO 2。Cry2Ah-vp突变体蛋白是将Cry2Ah1蛋白354位缬氨酸(Val)后增加一个脯氨酸(Pro)，核酸序列上在mcry2Ah序列的1062bp位后增加3个碱基CCC，编码脯氨酸。Cry2Ah-sp突变体蛋白是将Cry2Ah1蛋白354位缬氨酸(Val)突变为丝氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)，核酸序列上在mcry2Ah序列的1059bp后去掉3个碱基GTG并增加6个碱基AGCCCC，编码丝氨酸-脯氨酸。mcry2Ah-vp和mcry2Ah-sp基因的核酸序列见SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。

2、植物表达载体的构建

在Btcry2Ah1基因、人工合成的mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因的两端分别增加了多克隆位点，5’端含有HindIII、XbaI、XmaI、SmaI和BamHI，3’端含有KpnI、XhoI和EcoRI，原始基因和合成的基因构建到pUC57载体，分别称为pU2Ah、pUm2Ah、pUm2Ah-vp和pUm2Ah-sp(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)。pE35SN是一个中间载体，载体含有两个enhancer的CaMV35S启动子和一个nos终止子(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切pU2Ah、pUm2Ah、pUm2Ah-vp和pUm2Ah-sp，分别回收2Kb的片段，连接到用同样酶切的pE35SN上，再将四个载体的表达盒转入pCSN载体上(pCSN载体是由商用载体pCAMBIA2300改造而来，在pCAMBIA2300载体的BstXI和EcoRI之间引入一对T-DNA LR序列，质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，构建获得的载体称为pCS2AhN、pCSm2AhN、pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN(载体构建示意图见图1，图2，图3和图4)。

3、转基因烟草的获得

用农杆菌转化法将构建的pCS2AhN、pCSm2AhN、pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN转化烟草，转化方法是常规的农杆菌转化双子叶植物方法，首先将烟草无菌苗的叶片切成大小0.4x0.6cm²的小块，放在农杆菌侵染液里10min，取出烟草叶片，用灭菌滤纸吸干菌液，放置到铺有一层滤纸的MS培养基中，在黑暗中继续共培养3d，3d后将烟草叶片移至MS筛选分化培养基(MS盐+100mg/L卡那霉素+500mg/L Cab(羧苄青霉素)+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L sugar(蔗糖)+7g/L agar(琼脂),pH 5.8)两周，经过两周的筛选，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，一周后愈伤点分化成小植株，在生根培养基生根。将生根状态良好的植株在温室炼苗1～2d后，移入营养钵中，保湿，待苗子成活后移到大花盆生长，获得抗性植株。

4、转基因植株PCR鉴定

提取转化植株的基因组DNA，按照cry2Ah1原始基因以及mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp序列设计引物，cry2Ah1引物序列：cry2Ah1F：5’-TTTAATATTTCCTAG-3’，cry2Ah1R：5’-GTCGTGTTGCTTTGT-3’；mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp共用引物序列：mcry2AhF：5’-CCTCATCTTCCCGTC-3’，mcry2AhR：5’-GTGTTGCTCTGCTCG-3’，扩增转cry2Ah1基因和mcry2Ah1基因烟草获得片段大小为1350bp，扩增转mcry2Ah1-vp基因和转mcry2Ah1-sp基因烟草获得片段大小为1353bp；

反应体系为：

反应条件：

94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30cycles；72℃10min，4℃pause。

PCR产物结果图见图5，6，7，8。

在转cry2Ah1，mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因的烟草转化中，分别获得10株、29株、45株和62株转化植株，经过PCR检测阳性植株分别为4株、15株、28株、46株，阳性率为40％、51.7％、62.2％和74.2％。

5、转基因烟草的Southern blot检测

选取部分转基因阳性植株提取基因组DNA，HindIII完全酶切基因组DNA后进行琼脂糖凝胶电泳并将DNA转移至尼龙膜(N+)上。mcry2Ah表达盒(3.1Kb)为阳性对照,非转基因烟草基因组DNA为阴性对照，水为空白对照。检测探针为mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因共有的一段862bp序列，通过PCR DIG Probe Synthesis Kit扩增并标记DIG-11-dUTP，扩增引物序列：mcry2Ah-probe-F:5’-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3’，mcry2Ah-probe-R为：5’-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3’。Southern blot检测结果见图9。

6、转基因烟草的ELISA检测

提取转基因阳性植株叶片的可溶性蛋白，利用QuantiPlateTM Kit for Cry2A(Envirologix)对转基因植株中的Cry2Ah1蛋白进行定量。不同浓度梯度的纯化Cry2Ah1蛋白绘制标准曲线。ELISA检测结果见图10。

4株cry2Ah1转基因烟草植株没有检测到Cry2Ah1蛋白表达，15株mcry2Ah转基因烟草植株中有4株表达Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表达量4.41-10.27μg/g鲜重,28株mcry2Ah-vp转基因烟草植株中有8株表达Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表达量8.32-36.35μg/g鲜重,46株mcry2Ah-sp转基因烟草植株中有24株表达Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表达量5.26-40.28μg/g鲜重(表1)。统计分析表明mcry2Ah-sp与mcry2Ah-vp转基因烟草植株Cry2Ah1蛋白表达量差异不显著，但两者与mcry2Ah转基因烟草植株Cry2Ah1蛋白表达量差异显著，转cry2Ah1原始基因烟草外源蛋白表达量低于可检测到水平，说明未进行密码子优化的基因难以在植物中高表达外源蛋白。

7、转基因烟草的qRT-PCR检测

提取转基因阳性植株叶片的总RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA。Actin基因为内参基因，引物序列为：actin-qF：GGCATCATACATTTTACAACGAA，actin-qR：ATGGCGACATACATAGCAGGAGT。mcry2Ah1，mcry2Ah1-vp，mcry2Ah1-sp基因共同的检测引物为：mcry2Ah1-qF：AGGGCGTACATGGTGAGC，mcry2Ah1-qR：GGATGGGGGAGATGGTGA。

反应体系为：

反应条件：

94℃30s；94℃5s，60℃30s，40cycles；

qRT-PCR产物结果图见图11，转基因烟草可以检测到外源mcry2Ah1基因、mcry2Ah1-vp基因和mcry2Ah1-sp基因在转录水平的表达。

8、转基因烟草的抗虫性鉴定

选取敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫初孵幼虫，用于转基因植株与对照植株的离体叶片饲喂。每天统计幼虫的死亡数。发现饲喂3d后，转基因植株对敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫都表现出明显的抗虫性，其叶片仅被取食几个小孔后，幼虫成黑色中毒状态死亡，少数未死亡幼虫，呈现一种僵化状态，对叶片不再有损害(图12，13)。而非转基因植株(WT)和转cry2Ah基因的植株叶片对敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫完全没有抗虫作用，其叶片被大量取食(图12，13)。对4株转mcry2Ah基因烟草用离体叶片饲喂敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫校正死亡率为95.30-100％和90.84-100％。8株转mcry2Ah-vp基因烟草用离体叶片饲喂敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫校正死亡率为100％和92.09-100％。24株转mcry2Ah-sp基因烟草用离体叶片饲喂敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫校正死亡率为100％和96.34-100％(表1)。统计分析表明对于敏感型棉铃虫而言，mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp转基因烟草的抗虫性没有显著差异。对于Cry1Ac抗性棉铃虫而言，mcry2Ah与mcry2Ah-sp转基因烟草的抗虫性有显著差别，mcry2Ah-sp抗虫性高于mcry2Ah；mcry2Ah-vp活性大于mcry2Ah，mcry2Ah-sp的抗虫活性高于mcry2Ah-vp，但在统计学上分析无显著性差异。综上所述mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp对敏感型或Cry1Ac抗性棉铃虫都有明显的抗虫性，其中mcry2Ah-sp对Cry1Ac抗性棉铃虫的抗性最高，可以用于抗虫植物的培育及延缓害虫抗药性的产生。

表1转基因烟草Cry2Ah蛋白表达量和抗虫性统计结果

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用

<130> PP17022-SWJ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1899

<212> DNA

<213> Bt cry2Ah1原始序列

<400> 1

atgaataatg tattgaatag cggaagagct actaatggtg atgcgtataa tgtagtggct 60

catgatccat ttagttttca acataaatca ttagatacca tacaagaaga atggatggag 120

tggaaaaaag ataatcatat tttatatgta gatcctattg ttggaactgt ggctagcttt 180

cttttaaaga aagtggggag tcttgttgaa aaaagaatat taagtgagtt acggaattta 240

atatttccta gtggcagtac aaatctaatg caagatattt taagagagac agaaaaattc 300

ctgaatcaaa gacttaatac agacactctt gcccgtgtaa atgcggaatt gacagggctg 360

caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaat 420

gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc agcaattatt tctaaataga 480

ttaccccagt ttcagatgca aggataccaa ttgttattat tacctttatt tgcacaggca 540

gccaatttac atctttcttt tattagagat gttattctta atgcagatga atggggaatt 600

tcagcagcaa cattacgtac gtatcaaaat cacctgagaa attatacaag agagtactct 660

aattattgta taactacgta tcaaactgcg tttagaggtt taaacacccg tttacacgat 720

atgttagaat ttagaacata tatgttttta aatgtatttg aatatgtatc tatctggtcg 780

ttgtttaaat atcaaagcct tctagtatct tctggcgcta atttatatgc aagtggtagt 840

ggaccacagc agacccaatc atttacttca caagactggc catttttata ttctcttttc 900

caagttaatt caaattatgt gttaaatggc tttagtggcg ctagacttac gcagactttc 960

cctaatattg ttggtttacc tggtactact acaactcacg cattgcttgc tgcaagggtc 1020

aattacagtg gaggagtttc gtctggtgat ataggcgctg tgtttaatca aaattttagt 1080

tgtagtacat ttctcccacc tttgttaaca ccatttgtta gaagttggct agattcaggt 1140

tcagatcggg gggggattaa taccgttacc aattggcaaa cagaatcctt tgagacaact 1200

ttaggtttaa ggagtggtgc ttttacagct cgaggtaatt caaactattt cccagattat 1260

tttatccgta atatttctgg agttccttta gttgttagaa atgaagattt aagaagaccg 1320

ttacactata atcaaataag aaatatagaa agtccttcag gaacacctgg tggattacga 1380

gcttatatgg tatctgtgca taacagaaaa aataatatct atgccgttca tgaaaatggt 1440

actatgattc atttagcgcc ggaagattat acaggattta ctatatcgcc gatacatgca 1500

actcaagtga ataatcaaac gcgaacattt atttctgaaa aatttggaaa tcaaggtgat 1560

tccttaagat ttgaacaaag caacacgaca gctcgttata cccttagagg gaatggaaat 1620

agttacaatc tttatttaag agtatcttca ataggaaatt ccactattcg agttactata 1680

aacggtagag tttatactgc ttcaaatgtt aatactacta caaataacga tggagttaat 1740

gataatggag ctcgtttttc agatattaat atcggtaatg tagtagcaag tgataatact 1800

aatgtaccgt tagatataaa tgtgacatta aattcgggta ctcaatttga gcttatgaat 1860

attatgtttg ttccaactaa tcttccacca ctttattaa 1899

<210> 2

<211> 1899

<212> DNA

<213> 人工改造的mcry2Ah序列

<400> 2

atgaacaacg tcctcaacag cggcagggct acgaacggcg acgcgtacaa cgtggtcgcc 60

cacgacccct tctccttcca gcacaagagc ctcgacacca tccaggagga gtggatggag 120

tggaagaagg acaaccacat cctctacgtg gacccgatcg tgggcaccgt cgcctccttc 180

ctcctgaaga aggtcggcag cctcgtcgag aagcgcatcc tctccgagct gaggaacctc 240

atcttcccgt ccggcagcac gaacctcatg caggacatcc tgcgcgagac cgagaagttc 300

ctgaaccagc gcctcaacac ggacaccctg gctagggtca acgctgagct gaccggcctc 360

caggctaacg tcgaggagtt caaccgccag gtggacaact tcctcaaccc gaacaggaac 420

gccgtccccc tgtccatcac gtccagcgtg aacaccatgc agcagctctt cctgaacagg 480

ctcccccagt tccagatgca gggctaccag ctcctgctcc tgccactgtt cgctcaggct 540

gcgaacctcc acctgtcctt catccgcgac gtgatcctga acgctgacga gtggggcatc 600

agcgctgcta cgctcaggac ctaccagaac cacctgcgca actacacgag ggagtactcc 660

aactactgca tcaccacgta ccagacggcg ttccgcggcc tgaacaccag gctccacgac 720

atgctggagt tccgcaccta catgttcctc aacgtgttcg agtatgtgtc catctggagc 780

ctgttcaagt accagagcct cctggtctcc agcggcgcca acctctacgc ttccggcagc 840

ggcccacagc agacgcagtc cttcaccagc caggactggc cgttcctgta ctccctcttc 900

caggtgaaca gcaactacgt cctcaacggc ttctccggcg ctaggctgac gcagaccttc 960

ccaaacatcg tgggcctgcc aggcaccacg accacgcacg cgctcctggc tgctagggtg 1020

aactactccg gcggcgtctc cagcggcgac atcggcgctg tgttcaacca gaacttctcc 1080

tgcagcacgt tcctcccacc actcctgacc ccattcgtcc gcagctggct ggactccggc 1140

agcgacaggg gcggcatcaa cacggtgacc aactggcaga cggagagctt cgagaccacg 1200

ctcggcctgc gctccggcgc cttcaccgcg aggggcaaca gcaactactt cccggactac 1260

ttcatccgca acatctccgg cgtgcccctc gtggtcagga acgaggacct ccgcaggccg 1320

ctgcactaca accagatcag gaacatcgag tccccaagcg gcaccccagg cggcctcagg 1380

gcgtacatgg tgagcgtcca taacaggaag aacaacatct acgcggtcca cgagaacggc 1440

acgatgatcc acctggcccc ggaggactac acgggcttca ccatctcccc catccacgcg 1500

acccaggtga acaaccagac gcgcaccttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac 1560

tccctcaggt tcgagcagag caacaccacg gctaggtaca ccctgagggg caacggcaac 1620

tcctacaacc tctacctgcg cgtctccagc atcggcaaca gcacgatccg cgtgaccatc 1680

aacggcaggg tctacaccgc ctccaacgtg aacaccacga ccaacaacga cggcgtgaac 1740

gacaacggcg cgaggttctc cgacatcaac atcggcaacg tggtcgccag cgacaacacg 1800

aacgtccccc tcgacatcaa cgtgacgctg aacagcggca cccagttcga gctgatgaac 1860

atcatgttcg tgccgaccaa cctgccgccc ctctactga 1899

<210> 3

<211> 1902

<212> DNA

<213> 人工改造的mcry2Ah-vp序列

<400> 3