一种基于2‑硝基咪唑‑1‑烷基醇的低氧激活前药的制作方法

本发明涉及一种药物，尤其是一种通式i所示的2-硝基咪唑-1-烷基醇类的低氧激活前药及其合成方法，该类前药具有良好的体内、外的稳定性，能够被低氧肿瘤组织中高表达的特异性酶还原释放药物，提高抗肿瘤疗效和靶向性。

背景技术：

恶性肿瘤严重的威胁了人类生命健康，化学家们致力于研发高效、低毒的抗肿瘤药物。传统抗肿瘤药物，如紫杉醇、喜树碱等，作用位点分别是微管和拓扑异构酶，其对于血管相对丰富的正常区域中快速生长分化的细胞具有明显的抑制作用，但对于生长缓慢的低氧区域细胞作用有限，故临床效果不理想。

肿瘤组织中普遍存在低氧区域，低氧能引起肿瘤产生保护蛋白，因此低氧肿瘤组织对传统放、化疗具有较强的抵抗性和耐受性。现阶段的一些抗肿瘤药物的前药由于同时作用于肿瘤细胞和正常细胞，对实体瘤疗效差、毒副作用大、生物利用度低、易产生耐药性。

硝基咪唑类化合物在抗癌领域有着良好的发展潜力和前景，也已有许多研究取得了显著成果。根据其结构特点在一些先导化合物的基础上进行改造，有望获得靶向性强、高效、低毒的硝基咪唑类药物。

含羟基的药物，尤其是抗肿瘤药物，可以制备成各种碳酸酯类前药，以减少各种毒副作用。然而碳酸酯前药在人体内并不能完全地转化为药物的原药形式。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于2-硝基咪唑-1-烷基醇的低氧激活前药，利用2-硝基咪唑类化合物容易在低氧环境下转化为2-氨基咪唑类化合物，然后利用氨基催化碳酸酯水解，获得在低氧环境下容易离解的抗肿瘤前药。

本发明的前药在低氧条件下，经硝基还原酶还原形成氨基咪唑烷醇前药，释放出原药。

所涉及的2-硝基咪唑-1-烷基醇包括但不限于2-(2-硝基咪唑基)乙醇、3-(2-硝基咪唑基)丙醇、4-(2-硝基咪唑基)丁醇、2,2-二甲基-3-(2-硝基咪唑基)丙醇，优选2-(2-硝基咪唑基乙醇)、3-(2-硝基咪唑基)丙醇。抗肿瘤药物包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、sn-38、多柔比星、吉西他滨，优选紫杉醇、sn-38。

所述基于2-硝基咪唑-1-烷基醇的低氧激活前药具有通式i所示结构：

其中，n为0、1、2或3；

其中，r1、r2、r3、r4包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、c1～c6烷基、c1～c6含烯基的烷基、c1～c6含炔基的烷基。

本发明所采用的2-硝基咪唑化合物为2-硝基咪唑-1-烷基醇类化合物，2-硝基咪唑-1-烷基醇具有通式ii所示结构，其中，n为0、1、2或3；r1、r2、r3、r4包括但不限于以下结构：氢、羟基、氯、溴、氟、c1～c6烷基、c1～c6含烯基的烷基、c1～c6含炔基的烷基。

其中优选结构为：

该类化合物合成是以2-硝基咪唑为原料，在1位上进行烷基化得到的，合成方法如下：

a)化合物1碱性条件下与化合物2反应，得到化合物3。碱为碳酸钠，碳酸钾，碳酸铯等，优选碳酸铯；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选n,n-二甲基甲酰胺；温度0～100℃，优选50℃。

b)化合物4在碱性条件下与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到化合物5。碱为咪唑，三乙胺等，优选咪唑；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选n,n-二甲基甲酰胺；温度0～100℃，优选25℃。

c)化合物5在碱性条件下与化合物2反应，得到化合物6。碱为碳酸钠，碳酸钾，碳酸铯等，优选碳酸铯；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选n,n-二甲基甲酰胺；温度0～100℃，优选50℃。

d)化合物6在酸性条件下反应得到化合物7。酸为盐酸，硫酸，醋酸等，优选盐酸；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，甲醇等，优选甲醇。温度0～60℃，优选25℃。

上述2-硝基咪唑-1-烷基醇类化合物，使用碳酸酯的方法和药物相链接，采用的方法有两种：

第一种方法是利用对硝基苯酚氯甲酸酯，将2-硝基咪唑-1-烷基醇活化，得到的活性酯和药物反应，得到前药，以紫杉醇为反应示例，合成路线如下：

a)化合物3在碱性条件下与化合物8反应，得到化合物9。碱为咪唑，三乙胺等，优选三乙胺；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选二氯甲烷；温度0～60℃，优选25℃。

b)化合物9在碱性条件下与紫杉醇反应，得到化合物10。碱为咪唑，三乙胺等，优选三乙胺；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选二氯甲烷；温度0～60℃，优选25℃。

c)化合物7在碱性条件下与化合物8反应，得到化合物11。碱为咪唑，三乙胺等，优选三乙胺；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选二氯甲烷；温度0～60℃，优选25℃。

d)化合物11在碱性条件下与紫杉醇反应，得到化合物10。碱为咪唑，三乙胺等，优选三乙胺；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选二氯甲烷；温度0～60℃，优选25℃。

第二种方法是将药物与三光气反应得到药物的氯甲酸酯，再和相应的2-硝基咪唑-1-烷基醇反应，得到相应前药。以7-乙基-10-羟基喜树碱类化合物反应示类，合成路线如下：

将10-tbs-sn38溶于无水溶剂，加入三光气和有机碱，反应0.1～1小时，搅拌下加入化合物3或化合物7，反应1～12小时，反应体系减压真空浓缩，得粗品。粗品溶解于醋酸、四丁基氟化铵、四氢呋喃的体系中，反应1～12小时，得化合物13或化合物14。碱为咪唑，三乙胺，4-二甲氨基吡啶等，优选4-二甲氨基吡啶；溶剂为二氯甲烷，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜等，优选二氯甲烷；温度0～60℃，优选25℃。

本发明所述的前药用于肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、头颈部癌、脑瘤、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、子宫癌癌症的治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一类新型低氧选择性碳酸酯抗肿瘤前药；该类低氧激活前药，提供了新的释药机理，增加了药物对低氧肿瘤区域的选择性；该类化合物在人血浆中代谢稳定，在硝基还原酶作用下，释放药物迅速，解决了碳酸酯类前药在人体内释药效率低的问题。

发明的一类前药能够靶向于肿瘤低氧区域，被低氧肿瘤组织中高表达的特异性酶还原，从而释放出原药。本发明所设计的前药，在体内外稳定，在低氧肿瘤组织中特异性还原释放药物，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，降低毒副作用，增强疗效和生物利用度。

附图说明

图1为本发明化合物10、12、13、14针对三种ph值5.0、6.5、7.4的pbs和人血浆及小鼠血浆的稳定性实验谱图；其中，a.ph5pbs；b.ph6.5pbs；c.ph7.4pbs；d.小鼠血浆；e.人血浆；

图2为化合物10、12、13、14的硝基还原酶稳定性实验谱图；其中，a.底物剩余率；b.药物释放率。

具体实施方式

本发明的2-硝基咪唑-1-烷基醇的低氧激活前药的制备方法在如下实施例中更详细地叙述，但实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

化合物3的制备

将碳酸铯(5.8g,17.70mmol)加入到化合物1(1g,8.85mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌5分钟，往体系中加入化合物2(1.4g,9.73mmol)，反应混合液于50℃反应12小时，反应体系油泵旋蒸浓缩，浓缩物利用柱层析(二氯甲烷：甲醇＝60：1)分离纯化得淡黄色固体(1.3g,88％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.17(s,1h),7.14(s,1h),4.59(t,j＝6.9hz,2h),3.68(t,j＝5.7hz,2h),2.16-2.05(m,2h),1.78(s,1h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ144.7,128.0,127.9,57.6,47.1,32.4.ms(esi)m/z＝172.06[m+h]⁺。

实施例2

化合物5的制备

冰浴下将叔丁基二甲基氯硅烷(6.4g,42mmol)分批加入到化合物4(5g,40mmol)和咪唑(5.5g,80mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应2小时，反应体系用二氯甲烷稀释，饱和碳酸钠水溶液洗涤，水洗，饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得黄色油状物(6.7g,70％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.88(t,j＝6.5hz,2h),3.38(t,j＝6.5hz,2h),0.91(s,9h),0.08(s,6h).ms(esi)m/z＝238.04[m+h]⁺。

实施例3

化合物6的制备

将碳酸铯(7g,21.24mmol)加入化合物1(1.2g,10.62mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌下加入化合物5(2.8g,11.68mmol)，反应混合液60℃下反应12小时，反应混合液加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相旋干得黄色固体(2g,70％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.38(s,1h),7.25(s,1h),4.67(t,j＝4.9hz,2h),4.07(t,j＝4.9hz,2h),0.95(s,9h),0.06(s,6h).ms(esi)m/z＝272.83[m+h]⁺。

实施例4

化合物7的制备

将化合物6(1g,3.69mmol)溶解于甲醇中，冰浴下加入1m盐酸(0.5ml,5.54mmol)甲醇溶液，室温反应2小时，反应混合液加入三乙胺调节ph＝8，减压真空浓缩，浓缩物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝40：1)分离纯化得黄色固体(1.8g,70％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.66(s,1h),7.22(s,1h),5.07(s,1h),4.64-4.43(m,2h),3.96-3.62(m,2h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ128.5,127.6,59.8,51.8,40.2,40.0,39.8,39.6,39.4,39.2,39.1.ms(esi)m/z＝158.15[m+h]⁺。

实施例5

化合物9的制备

将无水三乙胺(118mg,1.17mmol)加入化合物3(100mg,0.58mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应10分钟，搅拌下加入化合物8(130mg,0.64mmol)，反应混合液室温反应12小时，反应混合液用二氯甲烷稀释，饱和氯化铵水溶液洗涤，水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，浓缩物利用柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：2)分离纯化得黄色固体(100mg，60％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(d,j＝8.4hz,2h),7.40(s,1h),7.38(s,1h),7.18(d,j＝6.8hz,2h),4.62(t,j＝6.6hz,2h),4.72-4.57(m,2h),4.46-4.25(m,2h).ms(esi)m/z＝337.16[m+h]⁺。

实施例6

化合物10的制备

将三乙胺(20mg,0.22mmol)加入化合物9(40mg,0.12mmol)的二氯甲烷溶液中，搅拌下加入紫杉醇(90mg,0.11mmol)，反应混合液室温反应12小时，反应混合液减压真空浓缩，浓缩物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)分离纯化得白色固体(80mg,71％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.15(d,j＝7.6hz,2h),7.79(d,j＝7.5hz,2h),7.62-7.59(m,1h),7.55-7.26(m,10h),7.06(s,2h),7.00(d,j＝9.3hz,1h),6.23-6.27(m,2h),6.01(d,j＝8.8hz,1h),5.69(d,j＝6.7hz,1h),5.40-5.29(m,2h),4.97(d,j＝9.2hz,1h),4.55-4,13(m,7h),3.81(d,j＝6.6hz,1h),2.68-2.34(m,6h),2.23-2.18(m,6h),2.06-1.83(m,4h),1.80-1.68(m,3h),1.25(s,3h),1.14(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ203.8,171.4,169.9,167.9,167.3,167.1,153.9,142.6,136.6,133.8,133.5,133.0,132.2,130.3,129.3,129.2,128.8,128.81,128.7,127.3,126.7,126.1,115.7,84.5,81.2,79.2,77.4,77.1,76.8,76.5,75.6,75.12,72.3,72.2,65.3,58.6,52.8,46.9,45.6,43.3,35.6,29.8,29.4,26.9,22.8,22.2,20.9,14.89,9.7.hrms(esi):m/zcalcdforc54h58n4nao18[m+na]⁺:1073.3638,found:1073.3635。

实施例7

化合物11的制备

将无水三乙胺(128mg,1.27mmol)加入化合物7(100mg,0.64mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应10分钟，搅拌下加入化合物8(140mg,0.70mmol)，反应混合液室温反应12小时，反应混合液用二氯甲烷稀释，饱和氯化铵水溶液洗涤，水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，浓缩物利用柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：2)分离纯化得黄色固体(100mg，60％).¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.16(d,j＝9.1hz,2h),7.26(s,1h),7.23(d,j＝8.9hz,2h),7.14(s,1h),4.85-4.73(m,2h),4.66-4.55(m,2h).ms(esi)m/z＝323.36[m+h]⁺。

实施例8

化合物12的制备

将三乙胺(11mg,0.113mmol)加入化合物11(20mg,0.062mmol)的二氯甲烷溶液中，搅拌下加入紫杉醇(50mg,0.056mmol)，反应混合液室温反应12小时，反应混合液减压真空浓缩，浓缩物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)分离纯化得白色固体(30mg,51％).¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.15(d,j＝7.8hz,2h),7.72(d,j＝7.6hz,2h),7.63-7.59(m,1h),7.56–7.34(m,10h),7.11(s,1h),7.06(s,1h),6.85(d,j＝9.6hz,1h),6.30-6.27(m,2h),6.02(d,j＝9.5hz,1h),5.70(d,j＝7.0hz,1h),5.39(d,j＝2.3hz,1h),4.97(d,j＝8.6hz,1h),4.83–4.71(m,1h),4.66–4.17(m,7h),3.81(d,j＝6.9hz,1h),2.62–2.37(m,6h),2.29–2.18(m,4h),1.93-1.87(m,4h),1.69-1.64(m,3h),1.25(s,4h),1.15(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ203.7,171.2,169.9,167.8,167.2,167.0,153.7,144.6,142.3,136.0,133.7,133.5,133.1,132.2,130.3,129.3,129.2,128.7,128.6,127.1,127.1,126.6,84.4,81.1,79.0,77.4,77.1,76.8,76.4,75.6,75.1,72.4,72.1,66.5,66.2,58.5,52.6,50.7,48.5,45.6,43.2,35.6,26.9,22.7,22.1,20.9,14.8,9.7.hrms(esi):m/zcalcdforc53h56n4nao18[m+na]⁺:1059.3482,found:1059.3468。

实施例9

化合物13的制备

将4-二甲氨基吡啶(50mg,0.39mmol)加入10-tbs-sn38(50mg,0.1mmol)和三光气(15mg,0.05mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应0.5小时，搅拌下加入化合物3(20mg,0.12mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时，反应体系用二氯甲烷稀释，减压真空浓缩得黄色固体，将该浓缩物(100mg,0.14mmol)溶于四氢呋喃溶液中，搅拌下加入冰醋酸(10mg,0.14mmol)和四丁基氟化铵(130mg,0.43mmol)，室温反应2小时，反应体系加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，饱和氯化钠水溶液洗涤，减压真空浓缩，浓缩物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝60：1)分离纯化得黄色固体(30mg，52％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ10.45(s,1h),8.03(d,j＝9.6hz,1h),7.70(s,1h),7.47-7.45(m,2h),7.22(s,1h),7.04(s,1h),5.57(s,2h),5.36(s,2h),4.62-4.41(m,2h),4.18(s,2h),3.15-3.13(m,2h),2.21-2,20(m,4h),1.34(t,j＝7.3hz,3h),0.98(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ167.2,156.8,156.5,152.9,148.5,147.2,144.9,144.6,143.5,142.8,131.4,128.2,127.9,127.7,122.4,118.0,104.7,93.4,77.9,66.3,65.9,49.5,48.5,46.5,40.1,39.9,39.7,39.5,39.3,39.0,38.8,30.1,28.5,22.2,13.3,7.5.hrms(esi):m/zcalcdforc29h27n5nao9[m+na]⁺:612.1701,found:612.1723。

实施例10

化合物14的制备

将4-二甲氨基吡啶(50mg,0.39mmol)加入10-tbs-sn38(50mg,0.1mmol)和三光气(17mg,0.06mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应0.5小时，搅拌下加入化合物11(20mg,0.12mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时，反应体系用二氯甲烷稀释，减压真空浓缩得黄色固体，将该浓缩物(40mg,0.06mmol)溶于四氢呋喃溶液中，搅拌下加入冰醋酸(5mg,0.06mmol)和四丁基氟化铵(30mg,0.09mmol)，室温反应两小时，反应体系加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，饱和氯化钠水溶液洗涤，减压真空浓缩，浓缩物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)分离纯化得黄色固体(20mg，61％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ10.41(s,1h),8.13(d,j＝8.8hz,1h),7.69(s,1h),7.51-7.48(m,2h),7.21(s,1h),6.96(s,1h),5.55(s,2h),5.37(s,2h),4.75-4.73(m,2h),4.59(s,2h),3.16(d,j＝7.6hz,2h),2.20(d,j＝6.9hz,2h),1.34(t,j＝7.5hz,3h),0.95(t,j＝7.1hz,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ167.0,156.9,156.5,152.7,148.5,147.2,144.6,144.5,143.6,142.9,131.5,128.3,128.1,127.7,122.5,118.1,104.8,93.4,78.0,66.6,66.4,49.5,48.6,48.2,40.1,39.9,39.7,39.5,39.3,39.0,38.8,30.2,22.3,13.3,7.5.hrms(esi):m/zcalcdforc28h25n5nao9[m+na]⁺:598.1544,found:598.1543。

hplc色谱条件

agilent1200四元泵(g1311aquatpump)，自动进样系统(g1329a，als)、恒温箱(g1316a，tcc)、紫外检测器(g1314b，vwd)、(g1321a，fld)，chemstationb工作站；色谱柱：diamonsilc18(4.6*250mm，5ul)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃，波长227、365nm；流动相:5％乙腈/95％水——95％乙腈/5％水，梯度洗脱15min，95％乙腈/5％水，5min。

pbs稳定性实验

本发明针对化合物10(3c-ptx)、12(2c-ptx)、13(3c-sn38)、14(2c-sn38)设计了三种ph值(5.0、6.5、7.4)的pbs的稳定性实验。将这四个化合物加入到一定浓度的pbs的缓冲液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，每个固定的实验间隔取样后用有机溶剂淬灭，并用高效液相色谱测定底物的含量。

将化合物10、12、13、14配成dmso溶液(10um/l)，各取10ul加入到1ml的三种ph值(5.0、6.5、7.4)的缓冲液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h取样100ul，加入100ul甲醇混合均匀，精密量取50ul注入液相色谱仪。

人血浆和小鼠血浆的稳定性实验

人血浆制备：取成年男子血液10ml，离心机离心，取上层血浆即得；

小鼠血浆制备：取10只km小鼠的血液共11ml，离心机离心，取上层血浆即得。

将化合物10、12、13、14配成dmso溶液(10um/l)，各取10ul加入到800ul的人/小鼠血浆中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h取样100ul,加入100ul甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50ul上清液注入液相色谱仪。

硝基还原酶稳定性实验

为了验证四个化合物在硝基还原酶条件下药物的释放，本发明设计了体外酶实验，将这四个化合物加入到一定浓度的硝基还原酶储备液中，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，每个固定的实验间隔取样后用有机溶剂淬灭，并用高效液相色谱测定底物的含量和药物的释放量。

硝基还原酶储备液的制备

取硝基还原酶1mg,溶于1mlph＝7.4的pbs缓冲液中即得。

将化合物10、12、13、14配成dmso溶液(10um/l)，各取10ul加入到1ml的硝基还原酶储备液中，取样100ul加入100ul甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50ul上清液注入液相色谱仪测定0时刻色谱图；测定完毕分别加入1umol/ml的nadph，在37℃实验温度下于恒温振荡器中反应，并分别于10min、20min、0.5h、1h取样100ul，加入100ul甲醇混合均匀，离心机离心，精密量取50ul上清液注入液相色谱仪。

细胞毒测试

方法：细胞种板后，分别放置正常培养箱和低氧培养箱(1％o2,5％co2,94％n2)培养24h，使细胞贴壁。然后加入相应药物，分别放入正常培养箱和乏氧培养箱中，作用72h后，mtt测定ic50，结果如下：

实验结果：

以2-硝基咪唑烷醇连接的前药，在低氧条件下，能够被特异性还原，促进碳酸酯前药的水解，进而释放药物，该机理经过生物还原的验证，通过稳定性实验，以及细胞毒性实验，证明该类前药具有可靠的稳定性，且对低氧肿瘤细胞具有一定的选择性，是具有一定潜力的低氧肿瘤治疗药物，有进行深入研究的价值。