本发明涉及苦豆子碱二聚体a～d的发现及其在制备抗炎或抗肿瘤药物制剂中的应用。
背景技术：
：苦豆子是豆科槐属植物苦豆子(sophoraalopecuroidesl.)的干燥全草、根及种子，其别名又称苦甘草、苦豆根、苦豆草等(中国药学杂志，1993，26：328-329)，始载于《神农本草经》，谓其能安五脏，定志益精(宁夏医学院学报，2004，26：214-217)。苦豆子性寒、味苦、有毒，具有清热解毒、抗菌消炎作用，民间用其治疗胃痛、腹泻等症(时珍国医国药，2010，21：2217-2218)。该物种为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，全草均有毒。其主要分布在宁夏、甘肃、山西、青海、新疆、河南、内蒙古、河北、陕西等省区；国外分布于蒙古、哈萨克斯坦及欧洲部分地区(甘肃畜牧兽医，2008，6：36-37)。长期以来研究证明其具有抗炎、抗癌、保肝、抗病毒、抗心率失常、抑菌以及镇痛等多种药理作用。苦豆子的化学成分主要是蛋白质、糖类、有机酸、黄酮类、色素和生物碱等。苦豆子生物碱属于喹诺里西啶(quinolizidine)生物碱，由三价氮原子形成的稠合的二个哌啶环，又称双稠哌啶，仍属于哌啶或吡啶(piperdine)的衍生物。技术实现要素：本发明的目的是提供苦豆子碱二聚体a～d及其新用途，所述苦豆子碱二聚体a～d的化学结构如下：本发明的目的之一是提供苦豆子碱二聚体a～d在制备抗炎药物制剂的应用。本发明的目的之二是提供苦豆子碱二聚体a～d在制备抗肿瘤药物制剂的应用。本发明中所述的抗肿瘤药物制剂包括肺癌、结肠癌、鼻咽癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌和食道癌等各种肿瘤的药物制剂。具体地，所述抗肿瘤药物制剂可抑制人非小细胞肺癌细胞、人结肠癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人胃癌细胞、人白血病细胞、人食道癌细胞、人前列腺癌细胞、人黑色毒瘤细胞、人口腔上皮癌细胞的生长。所述药物制剂含有治疗有效量的苦豆子碱二聚体a或b或c或d，还包含药用辅料或其它可配伍的药物。所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种组合。所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的苦豆子碱二聚体a或b或c或d为药物原料，再配伍其它天然药物或化学药品。所述的抗炎药物制剂或抗肿瘤药物制剂均包括多种临床药物剂型，如胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片等。本发明目的之三是提供一种药物组合物。具体地，所述药物组合物，含有作为活性成分的权利要求1的苦豆子碱二聚体a或b或c或d、其药学上可接受的盐或它们的溶剂合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。作为本发明另一个实施例，所述药物组合物，其含有作为活性成分的权利要求2的苦豆子碱二聚体a或b或c或d、其药学上可接受的盐或它们的溶剂合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。其中，所述药用赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组合。本发明相对于现有技术具有如下的优点及技术效果：(1)本发明的苦豆子碱二聚体a～d具有良好的体内外抗炎、抗肿瘤活性，具有良好的药用前景。(2)本发明的苦豆子碱二聚体a～d在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用，尤其是对肝脏、肺和肾脏的毒副作用。附图说明图1是新型苦豆子碱二聚体a的x-射线晶体结构图。图2是新型苦豆子碱二聚体b的x-射线晶体结构图。图3是新型苦豆子碱二聚体c的x-射线晶体结构图。图4是新型苦豆子碱二聚体d的x-射线晶体结构图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实验例1苦豆子碱二聚体的分离取苦豆子的干燥全草150kg，粉碎成粗粉。置提取罐中加入95乙醇800l回流提取2小时，过滤，滤渣再加入95乙醇800l回流提取2小时，过滤。滤液合并，浓缩，得浸膏，浸膏加水混悬，用5％hcl调ph至2～3，加入氯仿萃取5次，每次200l。酸水层再加入氨水调ph至9-10，加入氯仿萃取5次，每次200l，合并氯仿层，回收至干，得浸膏1.95kg。取浸膏拌入80-100目的硅胶2.5kg，装柱5kg硅胶柱，用氯仿-甲醇(95:5,90:10,85:15,80:20,75:25,70:30,60:40,50:50和0:100)梯度洗脱，通过hplc-ms检测分子量为496的流份，回收至干，得到富含苦豆子碱二聚体的提取物323g。将富含苦豆子碱二聚体的提取物过sephadexlh-20柱，以hplc-ms检测，合并分子量为496的流份，回收至干，即得总苦豆子碱二聚体296g。取总苦豆子碱二聚体过ods柱，以甲醇-水(30:70～10:90)梯度洗脱，每250ml为一个流份，回收各流份至干，通过薄层层析(tlc)检识，合并相同斑点的流份，得到10个流份，分别为fr.1至fr.10。fr.6经过hplc分析，并用制备型高效液相制备，流动相为62％的甲醇-水(万分之二的二乙胺溶液)，分别得到化合物1(13.5g)和化合物2(11.7g)。fr.8经过hplc分析，并用制备型高效液相制备，流动相为67％的甲醇-水(万分之二的二乙胺溶液)，得到化合物3(9.2g)。fr.9经过hplc分析，并用制备型高效液相制备，流动相为38％的乙腈-水(万分之二的二乙胺溶液)，别得到化合物4(8.1g)。实验例2苦豆子碱二聚体结构鉴定化合物1为无色块晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:493.3531(calcdfor[m+h]+:493.3537)，给出该化合物的分子式为c30h44n4o2。化合物1为三斜方晶系，空间群是p1，晶胞参数:z＝1，计算密度＝1.237g·cm-3，最终一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0617,wr2＝0.1656；一致性因子(alldata)r1＝0.0618,wr2＝0.1657；绝对构型的flack参数为0.00(8)。最后，单晶数据提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)数据库，ccdc号为1522189。通过cu-kαx-射线晶体衍射法鉴定了本化合物结构的绝对构型(图1)，并通过核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)对化合物的碳、氢信号进行了全归属(表1)，在hmbc谱中，可以观察到δh2.12(h-10)与δc132.9(c-2')有远程相关，δh5.54(h-2')与δc69.4(c-10)，δh1.92(h-5')与δc111.1(c-3')有远程相关，由此可以确定化合物1是一分子苦参碱与另一分子的苦参碱通过c10-c3'相连的，为具有新颖骨架的苦豆子碱二聚体，命名为苦豆子二聚体并命名为苦豆子二聚体a。表1化合物1的一维和2维核磁数据(cdcl3,δ)化合物2为无色块晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:493.3539(calcdfor[m+h]+:493.3537)，给出该化合物的分子式为c30h44n4o2。化合物2为三斜方晶系，空间群是p1，晶胞参数:z＝1，计算密度＝1.254g·cm-3，最终一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0403,wr2＝0.1063；一致性因子(alldata)r1＝0.0408,wr2＝0.1072；绝对构型的flack参数为0.16(12)。最后，单晶数据提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)数据库，ccdc号为1522203。通过cu-kαx-射线晶体衍射法鉴定了本化合物结构的绝对构型(图2)，并通过核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)对化合物的碳、氢信号进行了全归属(表2)，在hmbc谱中，可以观察到δh2.18,2.08(h-3')与δc109.6(c-9)有远程相关，δh5.54(h-10)与δc22.2(c-2')有远程相关，δh2.11(h-2')与δc134.0(c-10)，由此可以确定化合物2是一分子苦参碱与另一分子的苦参碱通过c9-c2'相连，为具有新颖骨架的苦豆子碱二聚体，命名为苦豆子二聚体b。表2化合物2的一维和2维核磁数据(cdcl3,δ)化合物3为无色块晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:497.3856(calcdfor[m+h]+:493.3850)，给出该化合物的分子式为c30h48n4o2。化合物2为三斜方晶系，空间群是p1，晶胞参数:z＝1，计算密度＝1.253g·cm-3，最终一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0283,wr2＝0.0741；一致性因子(alldata)r1＝0.0284,wr2＝0.0742；绝对构型的flack参数为0.01(7)。最后，单晶数据提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)数据库，ccdc号为1502007。通过cu-kαx-射线晶体衍射法鉴定了本化合物结构的绝对构型(图3)，并通过核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)对化合物的碳、氢信号进行了全归属(表3)，在hmbc谱中，可以观察到δh2.03,2.68(h-2)与δc35.1(c-2')有远程相关，δh2.28(h-2')与δc61.0(c-2)，由此可以确定化合物3是一分子苦参碱与另一分子的苦参碱通过c3-c2'相连，为一具有新颖骨架的苦豆子碱二聚体，命名为苦豆子二聚体c。表3化合物3的一维和2维核磁数据(cdcl3,δ)position13c1h1h-1hcosyhmbc261.02.03,2.68h-3h-2'334.11.58h-2,h-2',h-4430.51.56,1.81,h-3,h-5h-17535.61.69h-6,h-17664.52.02h-5,h-7h-17743.81.48h-8,h-11828.11.56,1.71h-7,h-9921.31.42,1.71h-8,h-101057.91.88,2.76,h-91155.83.73h-7,h-12h-61227.91.492.10,h-11,h-131319.11.60,1.79h-12,h-141433.02.04,2.40h-1315169.1-h-171742.22.97,4.36h-5h-62'35.12.28,1.69h-3,h-3'h-23'21.91.41,1.53h-4',h-2'4'35.21.56,1.71h-5',h-6'5'47.11.69h-6',h-17'6'54.72.83h-5',h-7'h-17'7'47.11.39h-6',h-8'8'27.01.10,1.43h-7',h-9'9'26.31.30h-8',h-10'10'47.9.2.57,3.11h-9'11'55.23.39h-7',h-12'h-6'12'27.81.43,2.03h-11',h-13'13'19.01.60,1.79h-14',h-12'14'32.92.04,2.40h-15',h-13'15'169.6-h-17'17'40.14.41,3.10h-5',h-6'化合物4为无色块晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:534.3432(calcdfor[m+h]+:534.3439)，给出该化合物的分子式为c31h43n5o3。化合物4为单斜方晶系，空间群是p21，晶胞参数:z＝2，计算密度＝1.320g·cm-3，最终一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0375,wr2＝0.1013；一致性因子(alldata)r1＝0.0378,wr2＝0.1017；绝对构型的flack参数为0.07(8)。最后，单晶数据提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)数据库，ccdc号为1522211。通过cu-kαx-射线晶体衍射法鉴定了本化合物结构的绝对构型(图4)，并通过核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)对化合物的碳、氢信号进行了全归属(表4)，在hmbc谱中，可以观察到δh4.28(h-2'),2.56(h-4')与δc56.3(c-10')有远程相关，δh1.35(h-9),2.21(h-5')与δc61.0(c-3')有远程相关，可以确定化合物4为c10-c3'相连；δh4.28(h-2')与δc114.2(c-18')有相关，确定了cn基团连接在c2'位置；c-3'(δc61.0)和c4'(δc51.1)比正常的c3(δc21.2)和c4(δc27.8)往低场位移了30ppm左右，可推测该两个碳原子与o杂原子相连，结合高分辨质谱可知该处为3元环氧杂环。综上，可以确定化合物4是一分子苦参碱与另一分子的苦参碱通过c10-c3'相连，同时c2'-c3'处含有3元环氧杂环，c4'连有cn基团，为一罕见的具有新颖骨架的苦豆子碱二聚体，命名为苦豆子二聚体d。表4化合物4的一维和2维核磁数据(cdcl3,δ)实验例3苦豆子碱二聚体a～d对lps致raw264.7细胞炎症的抑制作用试验方法：取5x106个对数生长期raw264.7细胞，接种于96孔培养板，每孔100μl，设空白组、对照组和不同浓度的样品组，每组设8个平行孔。置37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养，培养24h后，加入脂多糖lps(1μg/ml)预处理1h后，加入苦豆子碱二聚体a～d(10μm)，继续培养24h。采用elisa法检测细胞培养上清中的il-6和tnf-α。试验结果苦豆子碱二聚体a～d对lps所致raw264.7细胞炎症具有显著的抑制作用(表5)。表5苦豆子碱二聚体对lps所致raw264.7细胞炎症的抑制作用实验例4苦豆子碱二聚体a～d对lps致大鼠急性肺损伤的抑制作用试验方法：雄性wistar大鼠(180克-220克)随机分为：对照组，苦豆子碱二聚体a～d组。对照组使用生理盐水(1ml/天)灌胃；苦豆子碱二聚体a～d组使用苦豆子碱二聚体a～d(40mg/kg/天)腹腔注射。5天之后，苦豆子碱二聚体a～d组使用脂多糖lps(5mg/kg)进行气管滴注，制造急性肺损伤模型。用灌洗液灌洗肺泡后，将灌洗液离心(3000rpm，4℃)10min，elisa法检测灌洗液中il-6、tnf-α。试验结果苦豆子碱二聚体a～d对lps所致大鼠急性肺损伤炎症具有显著的抑制作用(表6)。表6苦豆子碱二聚体对lps所致大鼠急性肺损伤炎症的抑制作用实验例5苦豆子碱二聚体a～d对肿瘤细胞增殖的抑制作用试验方法：取106个对数生长期细胞，接种于96孔培养板，每孔100μl，设空白组、对照组和不同浓度的样品组，每组设8个平行孔。置37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养，培养24h后，加入不同浓度苦豆子碱二聚体a～d，继续培养48h。于终止前每孔加30μlmtt(5g/l)，作用4h后除去上清液并添加100μldmso溶解反应产物，使用酶标仪在570nm波长处检测各孔od值，按下公式计算抑制率：生长抑制率％＝(1-实验组平均od值/对照组平均od值)×100％试验结果苦豆子碱二聚体a～d对多种肿瘤细胞及其耐药株的生长均具有显著抑制作用，并且对不同细胞具有选择性的抑制作用(表7)。表7mtt法测定新型苦豆子碱二聚体对多种肿瘤细胞的生长抑制作用实验例6苦豆子碱二聚体a～d体内抗肿瘤作用试验方法：取体重18-22g的裸鼠(购自南方医科大学)，随机分组，每组8只。分别在其右前肢腋下接种人肝癌细胞huh71×107个，24小时后腹腔注射给药，苦豆子碱二聚体a～d每天给药一次，5-氟尿嘧啶(5-fu，购于北京百灵威科技有限公司)隔天给药，连续注射21天后停药，处死动物，取瘤称重。抑瘤率按如下公式计算：抑瘤率(％)＝(1–给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。统计分析采用t检验处理，p<0.05认为有显著性差异。结果见表8。表8苦豆子碱二聚体对人肝癌细胞huh7裸鼠移植瘤生长的抑制作用(n＝8)与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01有显著性差异试验结果：结果表明，苦豆子碱二聚体a～d(20mg/kg/day)对人肝癌细胞huh7裸鼠移植瘤生长有明显的抑制作用。给药组和对照组小鼠体重无明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面异常，且肝脏、肺及肾脏组织未见明显变化，说明苦豆子碱二聚体a～d的毒副作用较小。实施例7胶囊剂的制备苦豆子碱二聚体2g，乳糖20g，羟甲基淀粉钠0.1g，淀粉浆适量，硬脂酸镁0.1g混合，过筛制粒，干燥后混匀装入胶囊，每个胶囊含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.02g，每日口服1-2粒，每日两次。实施例8片剂的制备苦豆子碱二聚体5g，乳糖200g，淀粉浆适量，硬脂酸镁1g，混合，过筛，干燥后压片。每片含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.02g。每日口服1-2片，每日两次。实施例9注射液的制备苦豆子碱二聚体a或b或c或d2g，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加入注射用水至1000ml，调ph值5.5-6.5，滤过，灌封，灭菌，即得1000支注射用针剂。实施例10脂质体纳米粒的制备苦豆子碱二聚体1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵灵脂500mg溶于25ml环己烷中，混合搅拌均匀。于37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg,搅拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超声10min，定容至250ml，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研磨24小时，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。每袋含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.005g。口服，一次一袋，每日两次。实施例11缓释剂的制备将苦豆子碱二聚体50g，羟丙基甲基纤维素30g，乳糖10g，加适量粘合剂制备软材，过20目筛制粒。干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.3g，混合均匀，压片。每片含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.005g。每日口服1-2片，每日一次。实施例12控释剂的制备苦豆子碱二聚体1g，乳糖40g和淀粉浆适量直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗粒，将稀释到15％固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到苦豆子碱二聚体颗粒的旋转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣苦豆子碱二聚体颗粒，形成平均颗粒度大约为450μm的持续释放的颗粒。混匀装入胶囊，每个胶囊含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.005g，每日口服1-2粒，每日两次。实施例13分散片的制备取苦豆子碱二聚体50g，羟乙酸淀粉钠50g，预凝胶淀粉340g，低取代羧丙基纤维素25g，糖精钠3g，薄荷香精3g，混合均匀制粒，并控制粒度在35-80μm范围内，直接压片。每片含苦豆子碱二聚体a或b或c或d0.005g。每日口服1-2片，每日两次。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12