本发明涉及医用生物材料领域，具体为一种提取I型胶原蛋白的方法。
背景技术：
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%~30%。胶原蛋白是结缔组织普遍存在的成分，是器官和组织必不可少的构造骨架，目前已经发现27种以上不同类型的胶原蛋白。I型胶原蛋白广泛存在于动物的骨、角膜、皮肤、肌腱等组织中，分子量约300KD，其分子长度约为300nm，直径约1.5nm，呈棒状。显微结构上I型胶原蛋白由三条肽链组成，包括两条α(I)链和一条α(II)链。由于I型胶原蛋白具有可降解性、生物相容性和止血性等许多优良的生物学特性，因此被作为天然生物材料广泛应用于生物医学和组织工程学领域。
目前市场上出售的I型胶原蛋白主要从动物皮和跟腱组织中提取制备而成，由于现有的提取方法制备出的I型胶原蛋白受工艺条件的影响，提取产率较低，而且提取的胶原蛋白中含有的杂蛋白较多，严重影响胶原蛋白的质量，而在生物医学和化妆品行业等领域的广泛应用I型胶原蛋白的需求量与日俱增，因此，因此设计一种I型胶原蛋白提取方法以提高胶原蛋白的提取产率来满足I型胶原蛋白在在生物医学和化妆品行业等领域的应用显得十分必要。
本发明以动物跟腱组织为原料，采用酸性酶法技术制备出一种I型胶原蛋白。该方法不仅可以提高I型胶原蛋白的提取产率，而且提取的I型胶原蛋白的杂蛋白含量较低。本发明提取的I型胶原蛋白具有优良的生物相容性和生物活性，能够适应生物医学的应用，同时能够活化上皮细胞，促进上皮细胞增生和胶原酶生成，使皮肤紧致有弹力，在化妆品领域具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种提取I型胶原蛋白海绵的方法， 该制备工艺简单，能够提高I型胶原蛋白的提取产率，而且提取的I型胶原蛋白的杂蛋白含量较低。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
本发明以动物跟腱组织为原料，采用酸性酶法技术制备出一种I型胶原蛋白，其提取过程包括以下七个步骤：（1）将牛跟腱洗净后冷冻切片；（2）配置溶液将跟腱切片消毒脱脂；（3）将跟腱切片在碳酸钠溶液浸泡脱去杂蛋白后水洗至中性；（4）采用匀浆机对跟腱切片进行均将破碎；（5）向匀浆液中加入胃蛋白酶，15~25℃下搅拌消化；（6）将上清液进行盐析处理，再将沉淀溶解后进行透析处理；（7）将透析后的胶原原液进行冷冻干燥即得I型胶原蛋白，取出后真空封装。
实施的具体技术方案如下。
步骤一：清洗工艺
将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
步骤二：消毒脱脂工艺
称取100g跟腱片置于消毒脱脂溶液中浸泡，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次。
步骤三：脱杂蛋白工艺
将消毒脱脂后的跟腱片用碱性溶液浸泡进行脱杂蛋白，机械搅拌，间隔6~8h更换一次碱性溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次至跟腱片表面为中性（pH值为7）。
步骤四：破碎工艺
将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，并将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的酸性溶液中，采用匀浆机对其匀浆破碎若干次，每次匀浆5min。
步骤五：酶解消化工艺
将匀浆液置于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL酸性溶液，再向其中加入适量的活性酶，搅拌消化，离心15~30min。取上清液备用。
步骤六：盐析透析工艺
使用氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠进行搅拌盐析，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀若干次，沥干。将沥干的沉淀溶解于透析液中进行透析。
步骤七：干燥工艺
将透析后的胶原原液在-50℃进行干燥处理，取出后真空封装。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法所有步骤所使用的溶液及超纯水温度均为15~25℃。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤二中的消毒脱脂溶液为75%酒精和正己烷的混合溶液，75%乙醇与正己烷的体积比为1:1~5:1，优选75%乙醇：正己烷=3:1；消毒脱脂时间为6~24h，优选时间为12h。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤三中的脱杂蛋白的碱性溶液是选氢氧化钠、经氧化钾、碳酸钠、碳酸钾和碳酸氢钠中任意一种配制的溶液，优选碳酸钠；碳酸钠溶液的浓度为0.01~1.0mol/L，优选浓度为0.05mol/L。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤四中的酸性溶液为乙酸溶液和柠檬酸溶液中的任意一种或两种，优选乙酸溶液；溶液的浓度为0.01%~2.0%（质量分数），优选浓度为0.5%（质量分数）。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤五中的活性酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶和无花果蛋白酶中任意一种或两种及以上，优选胃蛋白酶；活性酶的浓度为20~1000mg/L，优选浓度为100mg/L；消化时间12~72h，优选消化时间为24h。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤六中的氯化钠浓度为1~5mol/L，优选浓度2 mol/L；盐析时间为1~24h，优选盐析时间为12h。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤六中的透析液为乙酸溶液，浓度为0.01mol/L；透析外液为0.001 mol/L的乙酸溶液或超纯水，优选超纯水。
所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤七中的干燥方式是辐射干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥；冷冻干燥温度为-50℃；冷冻干燥时间为24~72h，优选时间为48h。
本发明提供的优点如下：（1）本发明提供的一种提取I型胶原蛋白的方法提高了I型胶原蛋白的提取产率，且胶原蛋白中杂蛋白的含量较少。（2）本发明提取的I型胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，还能够促进上皮细胞的增生和胶原酶的生成，满足临床生物医学工程领域和化妆品行业的需求。（3）本发明的制备工艺简单、可实现大规模生产，是一种经济有效的提取方法。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明。
实施案例1
（1）清洗工艺：将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脱脂工艺：称取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。
（3）脱杂蛋白工艺：用0.05mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性（pH值为7）。
（4）破碎工艺：将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的0.5%（质量分数）乙酸溶液，溶液温度15~25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。
（5）酶解消化工艺：将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL 0.5%（质量分数）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为100mg/L， 15~25℃下搅拌消化24h，离心15~30min。取上清液备用。
（6）盐析透析工艺：使用1mol/L 氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠至氯化钠浓度为2mol/L，搅拌盐析12h，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀3次，沥干备用。将沥干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超纯水作为透析外液进行透析，透析液温度15~25℃。
（7）干燥工艺：将透析后的胶原原液置于冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，取出后真空封装。
对实施案例1所提取的I型胶原蛋白进行力学产率检测，经检测，实施例1中I型胶原蛋白的提取产率达到82.6%。
实施案例2
（1）清洗工艺：将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脱脂工艺：称取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。
（3）脱杂蛋白工艺：用0.5mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性（pH值为7）。
（4）破碎工艺：将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的0.5%（质量分数）乙酸溶液，溶液温度15~25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。
（5）酶解消化工艺：将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL 0.5%（质量分数）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为100mg/L， 15~25℃下搅拌消化24h，离心15~30min。取上清液备用。
（6）盐析透析工艺：使用1mol/L 氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠至氯化钠浓度为2mol/L，搅拌盐析12h，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀3次，沥干备用。将沥干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超纯水作为透析外液进行透析，透析液温度15~25℃。
（7）干燥工艺：将透析后的胶原原液置于冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，取出后真空封装。
实施案例3
（1）清洗工艺：将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脱脂工艺：称取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。
（3）脱杂蛋白工艺：用0.05mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15~25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性（pH值为7）。
（4）破碎工艺：将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的0.5%（质量分数）乙酸溶液，溶液温度15~25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。
（5）酶解消化工艺：将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL 0.5%（质量分数）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为200mg/L， 15~25℃下搅拌消化24h，离心15~30min。取上清液备用。
（6）盐析透析工艺：使用1mol/L 氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠至氯化钠浓度为2mol/L，搅拌盐析12h，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀3次，沥干备用。将沥干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超纯水作为透析外液进行透析，透析液温度15~25℃。
（7）干燥工艺：将透析后的胶原原液置于冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，取出后真空封装。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的详细说明，不能认定本发明具体实施仅限于以上说明。在不背离本发明的构思下，本领域的技术人员根据本发明做出的各种修饰和替换，都应当视为本发明的保护范围。