水稻基因OsNF‑YC4及其应用的制作方法

本发明属植物基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及水稻基因osnf-yc4及其应用。

背景技术：

高等植物在发育过程中会受到高温、干早等非生物胁迫的影响，阻碍植物生长，甚至会导致死亡，制约着农业和经济的发展。水稻(oryza.satival.)是一种重要的经济及粮食作物，对水稻生长发育和产量造成影响的诸多因素中，高温干旱和盐碱地危害是最主要的逆境因素，研究水稻逆境应答机制对其产量和品质的提高具有重要意义。

随着生物科技的发展，人们对植物逆境胁迫机理的研究也不断深入，大量胁迫相关基因被鉴定和研究。但由于水稻自身遗传基础与胁迫下生理生化变化的复杂性，已鉴定的功能基因较为有限，相关的表达调控分子机制仍需进一步探讨。

在真菌和动物中，nf-y的每个亚基是由单基因负责编码，植物nf-y则有多个同源基因，它们可形成不同组合参与转录调控来发挥具体的生物功能，其调控模式可能更为复杂；现阶段关于nf-y在植物胁迫响应中作用的报道较少。利用基因工程手段来研究和改善植物抗逆性已成为现代农业的一项重要内容。

技术实现要素：

本发明的目的在于：克服现有技术中水稻的基因表达调控分子机制研究存在的缺陷，提供一种可以显著提高水稻千粒重并提升其抗逆性的水稻基因osnf-yc4。

为了实现上述发明目的，本发明提供了水稻基因osnf-yc4，其开放阅读框的dna序列如seqidno:1所示。

扩增本发明水稻基因osnf-yc4的正向引物序列如seqidno:3所示，反向引物序列如seqidno:4所示。

检测水稻基因osnf-yc4表达的正向引物序列如seqidno:5所示，反向引物序列如seqidno:6所示。

本发明水稻基因osnf-yc4编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno:2所示。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种重组过表达载体，其包含了水稻基因osnf-yc4。

构建上述重组过表达载体时，可以采用pubi-3ha载体作为受体载体，构建方式是：将水稻基因osnf-yc4的开放阅读框酶切连接插入到受体载体，得到重组过表达载体pubi-osnf-yc4-orf-3ha。

使用osnf-yc4构建重组过表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对表达载体进行加工，如抗生素标记物(潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种生物工程菌，其是将含有所述重组过表达载体的大肠杆菌转入根癌农杆菌eha105而得。

本发明水稻基因osnf-yc4可应用于培育抗逆植物品种和调节植物生长中。

相对于现有技术，本发明水稻基因osnf-yc4及其应用具有如下优点：

本发明从水稻基因组中克隆得到一个水稻基因osnf-yc4，并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，过量表达本发明osnf-yc4基因其植株增高、粒宽显著增宽，粒长变长，千粒重显著增加，同时增强了其抗逆性，说明osnf-yc4基因在植物生长和正调控抗逆性方面具有重要作用。因此，本发明的osnf-yc4对培育抗逆性水稻，减少高温干旱对水稻产量的影响具有重要意义，对研究水稻生长和抗逆性机理方面具有重要的作用，在作物育种方面具有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明水稻基因osnf-yc4及其应用以及有益效果进行详细说明。

图1为含有水稻基因osnf-yc4的植物过量表达载体pubi-osnf-yc4-orf-3ha的部分结构示意图。

图2为t1转基因水稻的pcr鉴定，其中，m为dna分子量dl2000(takara公司生产)；编号8#，17#，19#为osnf-yc4过表达所获得转基因株系。

图3为转基因水稻qrt-pcr鉴定图。

图4转基因水稻在高温干旱下表型，其中，实验处理为40℃高温，10％peg模拟干旱环境；经过两周的处理，过表达水稻株系表现出抗高温干旱的表型。

图5为转osnf-yc4水稻株系表型实验，其中，wt：野生型(zh11生态型)；osnf-yc4-oe-8,osnf-yc4-oe-17为过表达转基因植株；图4左上：水稻籽粒宽度比较；右上：水稻籽粒长度比较；左下：水稻籽粒宽度显著变宽；右下：水稻籽粒长度变长但没达到显著水平。为转基因水稻表型统计实验结果，其中，转基因稻和野生型对比，千粒重显著增加，根长变长，茎长增高(*,p≤0.05；**,p≤0.01)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1水稻osnf-yc4及其编码基因的cdna克隆与鉴定

实验材料为由中国科学院华南植物园植物激素调控组研究室提供，材料种植于温室，常规田间管理。

利用生物信息学的方法进行分析，设计引物，进行水稻基因osnf-yc4的克隆。具体方法如下：

osnf-yc4基因orf正向引物p1如seqidno.3所示。

osnf-yc4基因orf反向引物p2如seqidno.4所示。

取水稻材料两周嫩叶，置于液氮中研碎，rna提取依据tiangen总rna提取试剂盒rnaplantextractionkitdp417进行。cdna第一链合成依据takara试剂公司cdna第一链合成试剂盒takaraprimescript^tm1ststrandcdnasynthesiskitd6110a，具体详见操作说明。以得到的cdna片段为模板，用上述引物对进行pcr扩增反应。20μlpcr反应体系为：0.8μlcdna第一链(0.05μg)、1.6μl引物(seqidno.3和seqidno.4，5μm)、2μl10×pcr缓冲液、1.6μlmg²⁺、1.6μldntp和0.5uextaqdna聚合激酶，用超纯水补足20μl。反应在ecso型pcr仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共30个循环；然后72℃延伸10min；16℃保存。pcr产物回收后经连接pmd19-t载体(takara)、转化大肠杆菌top10、摇菌、测序、序列分析结果表明pcr产物具有seqidno.1所示的orf，命名为osnf-yc4，其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例2

利用takara公司的nde1和ecr1内切酶和takara公司t4-dna连接酶将实施例1克隆基因osnf-yc4正向插入到表达载体pubi载体中，转化大肠杆菌top10，转化液涂布于含50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得到植物过量pubi-osnf-yc4表达载体(图1)。用冻融法将pubi-osnf-yc4转入根癌农杆菌菌株eha105(biovectorco.,ltd)中。通过农杆菌eha105介导分别转化野生型水稻zh11。提取转基因水稻的基因组dna作为模板，以野生型水稻基因组和水作为阴性对照，pubi-osnf-yc4质粒作为阳性对照，用目的基因内部引物进行pcr初步鉴定阳性转基因水稻，方法如下：

设计目的基因内部引物p3：seqidno.5和p4：seqidno.6进行pcr扩增，10μlpcr反应体系为：5μlmix，上、下游引物(5pmol)各1μl，模板2μl(大约含0.03μg)，加ddh2o1μl。其程序为95℃变性4min；再94℃40sec，56℃1min，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。pcr鉴定结果见图2。

用目的基因内部上游引物和下游引物进行rt-pcr对阳性转基因水稻二次鉴定，方法如下：

用目的基因内部上游引物p3：seqidno.5和下游引物p4：seqidno.6，以转基因水稻rna为模板进行rt-pcr扩增，10μlpcr反应体系为：5μlmix，引物(5pmol)各1μl，模板2μl(大约含0.03μg)，加ddh2o1μl。其程序为95℃变性5min；再94℃50sec，56℃90sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。rt-pcr鉴定结果见图3。

实施例3osnf-yc4基因的功能验证

将t1代转基因水稻种子消毒后播种于组培瓶里，培养温度为28℃，昼夜时间12/12h；待水稻生长3周，40℃高温和10％peg模拟干旱处理水稻野生型zh11和过表达株系osnf-yc4-oe-8、osnf-yc4-oe-17，10d后可明显观察过表达水稻苗叶片鲜绿不变，野生型苗叶片枯死，如图4。

进一步对生长于温室的过表达水稻株系进行籽粒统计发现，相比于野生型zh11，过表达株系osnf-yc4-oe-8、osnf-yc4-oe-17的水稻籽粒宽度显著变宽，长度增长，除此之外，两个过表达株系的籽粒千粒重相比于野生型zh11均达到极显著水平，茎长伸长，osnf-yc4-oe-8株系的茎长显著长于野生型，但是根长没有明显变化，如图5。

结果可见：

克隆osnf-yc4基因并构建osnf-yc4植物过表达载体，转化获得转基因水稻，通过高温干旱实验评估其抗逆性。发现过表达osnf-yc4表现出抗高温干旱的表型。并且转基因水稻株系的籽粒变大，千粒重显著增加，说明水稻osnf-yc4调控水稻籽粒发育，对于水稻高产育种提供一定的理论指导。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110>中国科学院华南植物园

<120>一个水稻基因osnf-yc4及其应用

<160>6

<210>1

<211>753

<212>dna

<213>禾本科水稻属（oryza.satival.）

<220>

<223>osnf-yc4基因开放阅读框（orf）

<400>1

4145atggagccatcatcacaacctcagccggcaattggtgttgttgctggtggatcaca

4201agtgtaccctgcataccggcctgcagcaacagtgcctacagctcctgctgtcattcctgc

4261cggttcacagccagcaccgtcgttccctgccaaccctgatcaactgagtgctcagcacca

4321gctcgtctatcagcaagcccagcaatttcaccagcagcttcagcagcagcaacagcgtca

4381actccagcagttttgggctgaacgtctggtcgatattgaacaaactactgacttcaagaa

4441ccacagcttgccacttgctaggataaagaagatcatgaaggcagatgaggacgttcgcat

4501gatctccgcagaggctcctgtgatctttgcgaaagcatgtgagatattcatactggagct

4561gaccctgagatcatggatgcacacggaggagaacaagcgccgtaccttgcagaagaatga

4621catagcagctgccatcaccaggacggatatgtacgatttcttggtagatatagttcccag

4681ggatgacttgaaggaggagggagttgggctccctagggctggattgccgcccttgggtgt

4741ccctgctgactcatatccgtatggctactatgtgccacagcagcaggtcccaggtgcagg

4801aatagcgtatggtggtcagcaaggtcatccggggtatctgtggcaggatcctcaggaaca

4861gcaggaagagcctcctgcagagcagcaaagtgattaa

<210>2

<211>174

<212>prt

<213>禾本科水稻属（oryza.satival.)

<220>

<223>osnf-yc4氨基酸序列

<400>2

mepssqpqpaigvvaggsqvypayrpaatvptapavipagsqpapsfpanpdqlsaqhqlvyqqaqqfhqqlqqqqqrqlqqfwaerlvdieqttdfknhslplarikkimkadedvrmisaeapvifakaceifileltlrswmhteenkrrtlqkndiaaaitrtdmydflvdivprddlkeegvglpraglpplgvpadsypygyyvpqqqvpgagiayggqqghpgylwqdpqeqqeeppaeqqsd

<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成<220><223>osnf-yc4基因orf正向引物p1

<400>3

atgatggagccatcatcacaacc

<210>4<211>17<212>dna<213>人工合成<220><223>osnf-yc4基因orf反向引物p2

<400>4

tcactttgctgctctgc17

<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<220><223>转基因水稻表达鉴定用目的基因内部引物之上游引物p3

<400>5

gccctgccttcatacgctat20

<210>6<211>18<212>dna<213>人工合成<220><223>转基因水稻表达鉴定用目的基因内部引物之下游引物p4

<400>6

gataatcatcgcaagacc18