本发明属于生物技术领域，涉及一种用于海藻糖合酶反应的反应液以及该反应液在海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖中的应用。
背景技术：
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α-1,1糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母及昆虫中，许多物种对外界恶劣环境（脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等）所表现出的抗逆耐受力与它们体内的海藻糖有直接关系，并且外源性的海藻糖同样对生物膜和生物大分子具有良好的非特异性保护作用，这一独特的生物学功能使海藻糖在食品、化妆品、分子生物学、医学、农业等领域拥有广阔的应用前景。例如，海藻糖可作为生物制品及活菌制剂的保护剂和稳定剂；也可作为一种能有效改善食品质量和风味的天然食品添加剂；还可用于化妆品中，保护皮肤免受日晒和冷冻伤害，防止皮肤干燥等。美国食品和药物管理局于2000年10月授予海藻糖gras（公认为安全）的地位，并批准它进入美国食品的各领域。2001年9月，欧盟委员会作出决议，批准海藻糖在欧盟国家中作为新型食品使用。2005年3月，中国卫生部批准海藻糖为新资源食品。
目前规模化生产海藻糖的方法是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶协同催化麦芽寡糖生成海藻糖，生产出的海藻糖价格较高，限制了海藻糖的广泛应用，迫切需要研发新的技术。
海藻糖合酶可以催化麦芽糖发生分子内转糖苷反应生成海藻糖，反应底物麦芽糖由淀粉酶解而得，来源充足，有希望利用该酶低成本制取海藻糖。因此国内外在产酶菌株筛选、工程菌构建、酶反应等方面开展了许多工作。
但是海藻糖合酶在转化麦芽糖生成海藻糖的过程中产生葡萄糖副产物，反应温度越高，葡萄糖的生成速度越快，生成量越高。这样不仅会降低海藻糖转化率，而且葡萄糖是海藻糖合酶的抑制剂，会显著降低海藻糖合酶转化反应速度。此外，由于葡萄糖的存在，还会增加产物分离纯化的难度与成本。上述问题制约了海藻糖合酶的规模化应用。
技术实现要素：
为解决上述技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供一种用于海藻糖合酶反应的反应液，在该反应液中，葡萄糖可被去除；本发明的第二个目的是将该反应液用于海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖，提高海藻糖合酶的反应效率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于海藻糖合酶反应的反应液，所述反应液除了含有海藻糖合酶、麦芽糖和缓冲液以外，还含有葡萄糖氧化酶。
所述反应液含有过氧化氢酶。
所述反应液的ph值为5~8。
所述的反应液在海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖中的应用。
本发明与己有技术相比，具有如下优点:
本发明反应液含有葡萄糖氧化酶，在用于海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖时，反应液中的葡萄糖氧化酶能够将海藻糖合酶反应产生的副产物葡萄糖氧化为葡萄糖酸，从而去除葡萄糖，避免葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制，加快反应进程，提高反应效率和海藻糖转化率。此外，反应结束后，产物中仅含海藻糖和麦芽糖两种糖，海藻糖在两种糖中所占比例大，便于进一步对海藻糖分离纯化。上述优势可降低利用海藻糖合酶制取海藻糖的生产成本，为实现利用海藻糖合酶规模化制备海藻糖奠定基础。
具体实施方式
结合实施例对本发明进一步说明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。
一种用于海藻糖合酶反应的反应液，该反应液除了含有海藻糖合酶、麦芽糖和缓冲液以外，还含有葡萄糖氧化酶。海藻糖合酶与葡萄糖氧化酶可以是游离酶，也可以是固定化酶。所述固定化酶是指酶分子与其它物质结合、或酶分子彼此结合、或酶分子包含在其它物质内而形成的不溶于水的酶。对反应液中海藻糖合酶的含量与麦芽糖浓度不作限定，可根据需要确定。反应液中葡萄糖氧化酶的含量应足够，以便能够充分降解海藻糖合酶反应时产生的副产物葡萄糖，可通过试验确定适宜的葡萄糖氧化酶含量。对缓冲液的种类和浓度没有限制，只要不影响或基本不影响海藻糖合酶与葡萄糖氧化酶的活性即可，通常可为0.01~0.1m的磷酸盐缓冲液。
海藻糖合酶与葡萄糖氧化酶的含量可用单位体积的酶活表示，酶活测定方法及酶活单位（u）的定义如下：
海藻糖合酶的酶活测定方法为：将lml液体酶（或lml固定化酶悬浮液）加入到lml以10mm、ph6.5的磷酸缓冲液配制的20%（w/v）的麦芽糖溶液中，混匀后，将该混合物溶液于50℃保温60min，然后于100℃加热10min中止该酶促反应。反应混合物冷却后，离心（8000r/min，15min），取上清液，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量。酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟转化麦芽糖生成1μmol海藻糖所需的酶量为1个酶活单位（u）。
葡萄糖氧化酶的酶活按下述方法测定：取0.1ml酶液，加入0.1ml、0.5%（w/v）的葡萄糖（以50mm、ph6.5磷酸盐缓冲液配制），在50℃下反应10min，用高效液相色谱法测定葡萄糖含量。酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟分解1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位（u）。
高效液相色谱法测定海藻糖、麦芽糖和葡萄糖的条件如下：
色谱柱：hypersilnh2，4.6mm×250mm，填料粒径5μm；检测器：示差折光检测器；流动相：乙腈/水＝75/25（体积比）；柱温：室温；进样量：20μl；流速：1.0ml/min。
本发明的反应液中还含有过氧化氢酶。过氧化氢酶的含量应足够，以便能够充分降解葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化时生成的过氧化氢，避免过氧化氢影响海藻糖合酶与葡萄糖氧化酶的活性。可通过试验确定适宜的过氧化氢酶含量。过氧化氢酶的含量可用单位体积的酶活表示，酶活测定方法及酶活单位（u）的定义如下：
石英比色杯中加入2.9ml、0.1mol/l的过氧化氢溶液（以20mm、ph6.5的磷酸盐缓冲液配制）和0.1ml酶液，于240nm处用比色法测定过氧化氢的分解速率。酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟分解1μmol的过氧化氢所需的酶量为1个酶活单位（u）。
反应液中过氧化氢的含量可采用“gb5009.226-2016食品安全国家标准食品中过氧化氢残留量的测定”方法进行检测。
本发明反应液的ph值为5~8。该ph值由反应液含有的缓冲液来实现。在该ph值范围内，海藻糖合酶、葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶可保持全部或大部分活性。优选ph值为海藻糖合酶的最适反应ph值，通常为6~7。
在利用本发明的反应液进行海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖的反应时，先将反应液置于反应器中。可选用搅拌式、鼓泡式或流化床反应器。可用的反应温度为不会使海藻糖合酶、葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶迅速失活的温度，优选温度范围为70℃以下。反应过程中，反应液的ph值用ph-stat法维持恒定。反应所用时间根据反应条件和所需海藻糖转化率而选择，通常可选择海藻糖转化率达到较高值时的反应时间。海藻糖转化率定义为反应生成的海藻糖与反应起始所用麦芽糖的浓度百分比。反应结束后，可采用任何已知的方法分离、纯化海藻糖。
实施例一
一种用于海藻糖合酶反应的反应液：
反应液中海藻糖合酶的含量为300u/l（即每升300个酶活单位），麦芽糖浓度为50g/l，葡萄糖氧化酶的含量为200u/l（即每升200个酶活单位），过氧化氢酶的含量为230u/l（即每升230个酶活单位），磷酸盐缓冲液的浓度为50mm，反应液的ph值为6.5。
实施例二
一种用于海藻糖合酶反应的反应液：
反应液中葡萄糖氧化酶的含量为600u/l（即每升600个酶活单位），过氧化氢酶的含量为690u/l（即每升690个酶活单位），其它同实施例一。
实施例三
本发明反应液在海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖中的应用：
用实施例一的反应液，于搅拌式反应器中在30℃下反应72h，搅拌转速为50r/min，期间分别于4h、12h、24h、48h和72h取样，检测反应液中葡萄糖、海藻糖和过氧化氢含量，计算海藻糖转化率。结果表明，反应4h、12h、24h、48h和72h时，反应液中均未检测出葡萄糖和过氧化氢。此外，反应24h时，海藻糖转化率为64.3%；反应48h时，海藻糖转化率达到最高，为66.2%；反应72h时，海藻糖转化率为60.8%。因此，30℃反应时，反应48h为宜。
实施例四
本发明反应液在海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖中的应用：
用实施例二的反应液，于搅拌式反应器中在50℃下反应72h，搅拌转速为50r/min，期间分别于4h、12h、24h、48h和72h取样，检测反应液中葡萄糖、麦芽糖、海藻糖和过氧化氢含量，计算海藻糖转化率。结果表明，反应4h、12h、24h、48h和72h时，反应液中均未检测出葡萄糖和过氧化氢。反应12h时，海藻糖转化率为60.9%；反应24h时，海藻糖转化率达到最高，为62.9%；反应48h和72h时，海藻糖转化率均下降。因此，50℃反应时，反应24h为宜。此外，反应24h时，反应液中仅含海藻糖和麦芽糖两种糖，海藻糖在两种糖中占75%，便于进一步对海藻糖分离纯化。
对比例一
在本对比例中，采用的反应液除了不含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶以外，其它同实施例三。用该反应液进行反应，反应条件同实施例三。结果表明，随着反应时间的延长，反应液中葡萄糖含量逐渐增加。反应24h时，反应液中葡萄糖含量约1.6g/l；反应48h时，葡萄糖含量约2.7g/l；反应72h时，葡萄糖含量达到3.5g/l。说明海藻糖合酶在转化麦芽糖生成海藻糖的过程中产生了葡萄糖副产物。此外，反应24h时，海藻糖转化率为53.5%；反应72h时，海藻糖转化率最高，约63%。与实施例三比较可知，在本对比例中由于海藻糖合酶反应副产物葡萄糖的存在，减慢了海藻糖合酶转化反应速度，影响了反应效率，还降低了海藻糖转化率。
对比例二
在本对比例中，采用的反应液除了不含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶以外，其它同实施例四。用该反应液进行反应，反应条件同实施例四。结果表明，随反应时间的延长，反应液中葡萄糖含量显著增加。反应12h时，反应液中葡萄糖含量约2.2g/l；反应24h时，葡萄糖含量约3.9g/l；反应72h时，葡萄糖含量达到10g/l。说明海藻糖合酶在转化麦芽糖生成海藻糖的过程中不仅产生葡萄糖副产物，并且由于反应温度提高（与对比例一比较），葡萄糖的生成速度加快。
此外，本对比例中，反应24h时，反应液中含有葡萄糖、海藻糖和麦芽糖三种糖，海藻糖在三种糖中占53%。与实施例四比较可知，本对比例糖种类多，并且海藻糖在总糖中所占比例低，这就会增加分离纯化海藻糖的难度与成本。
还有，本对比例中，反应12h时，海藻糖转化率为46.9%；反应24h时，海藻糖转化率达到最高，为53%；反应48h和72h时，海藻糖转化率均下降。而在实施例四中，反应12h时，海藻糖转化率就达到了60.9%。说明本发明反应液中由于含有足够量的葡萄糖氧化酶，能够充分去除海藻糖合酶在转化麦芽糖生成海藻糖过程中产生的副产物葡萄糖，从而避免了葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制，加快了反应速度，提高了反应效率和海藻糖转化率。