调控蓝莓果实中花青素含量的蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种调控蓝莓果实中花青素含量的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：蓝莓是杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vaccinium)植物，果实中含有丰富的花青素，具有防止脑神经老化、强心、抗癌软化血管、增强人机体免疫等保健功能。蓝莓可鲜食，也可加工成果汁饮料、果酒饮等，具有极高的经济价值。随着人类保健意识的提高，越来越表现出对富含花青素类食物的青睐，因此蓝莓在世界范围内，特别是在我国的需求量逐年上升，消费者对蓝莓果实的品质要求也越来越高。因此寻找与花青素生物合成有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。早期研究植物花青素生物合成主要集中在花青素生物合成途径中的相关基因上，通过异源转化单个或多个功能基因来提高植物花青素的含量，虽然转基因植株的花青素生物合成和积累量有所提高，但效果不太明显。最近，许多调节花青素生物合成的转录因子从许多植物中分离出来。研究结果表明通过这些转录因子调节后期的许多功能基因的表达，可以大大提高转基因植株的花青素产量，从而很大程度上促进了植物花青素调控方面的研究工作并取得突破性进展。myb是最大的植物转录因子家族成员之一，包括r2r3-myb、bhlh结构以及wdr蛋白,这些蛋白通过形成mbw复合体结构激活转录，mbw复合体通过一些特定的作用元件直接作用于dna的启动子区，进而调控目的基因的表达。对myb的转录调控机制的研究主要集中在调控植物生长以及相应逆境胁迫上。技术实现要素：本发明的目的是提供一种调控蓝莓果实中花青素含量的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，来源于蓝莓，命名为vcmyb5，具体是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且来源于蓝莓并与植物果实中花青素含量相关的由序列1衍生的蛋白质；(c)与(a)或(b)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于蓝莓并与植物果实中花青素含量相关的蛋白质。为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；3)与1)或2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pcambia1300、pcubi1390、pchf3、pgreen0029、pcambia3301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：(a)调控植物果实中花青素含量；(b)调控植物果实成熟时间；(c)调控植物果皮着色时间；(d)调控植物果实中花青素合成途径相关基因的表达；(e)选育果实中花青素含量提高或降低的植物品种；(f)选育果实成熟时间提前或延后的植物品种；(g)选育果皮着色时间提前或延后的植物品种。其中，所述调控植物果实中花青素含量、所述调控植物果实成熟时间、所述调控植物果皮着色时间具体体现为：在所述植物果实中所述蛋白质(或所述基因)vigs后，在所述植物果实(尤其是果肉)中，所述蛋白质(或所述基因)的表达量越低，所述植物果实中花青素含量越高，所述植物果实成熟时间越提前，所述植物果皮着色时间越提前。在所述植物果实(尤其是果肉)中，所述蛋白质(或所述基因)的表达量越高，所述植物果实中花青素含量越低。其中，所述选育果实中花青素含量提高/果实成熟时间提前/果皮着色时间提前的植物品种的方法，具体可包括将所述植物果实(尤其是果肉)中所述蛋白质(或所述基因)表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。所述选育果实中花青素含量降低/果实成熟时间延后/果皮着色时间延后的植物品种的方法，具体可包括将所述植物果实(尤其是果肉)中所述蛋白质(或所述基因)表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。本发明还提供了一种培育果实中花青素含量提高和/或果实成熟时间提前和/或果皮着色时间提前的植物的方法，以及一种培育果实中花青素含量降低和/或果实成熟时间延后和/或果皮着色时间延后的植物的方法。本发明所提供的培育果实中花青素含量提高和/或果实成熟时间提前和/或果皮着色时间提前的植物的方法，可包括如下步骤：降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，从而得到果实中花青素含量提高和/或果实成熟时间提前和/或果皮着色时间提前的植物。本发明所提供的培育果实中花青素含量降低和/或果实成熟时间延后和/或果皮着色时间延后的植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，从而得到果实中花青素含量降低和/或果实成熟时间延后和/或果皮着色时间延后的植物。本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下(a)或(b)：(a)培育具有如下(a1)-(a3)所示性状中至少一种的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：抑制受体植物中所述蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；从所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(a1)-(a3)所示性状中至少一种的转基因植物：(a1)果实中花青素含量提高；(a2)果实成熟时间提前；(a3)果皮着色时间提前。(b)培育具有如下(b1)-(b3)所示性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中转入所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；从所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(b1)-(b3)所示性状中至少一种的转基因植物：(b1)果实中花青素含量降低；(b2)果实成熟时间延后；(b3)果皮着色时间延后。在方法(a)中，所述蛋白质在所述转基因植物果实(尤其是果肉)中的表达量低于所述受体植物。在方法(b)中，所述蛋白质在所述转基因植物果实(尤其是果肉)中的表达量高于所述受体植物。所述基因具体可为如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；3)与1)或2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。在方法(a)中，抑制所述受体植物中所述蛋白质的编码基因的表达具体可通过如下实现：向所述受体植物中导入ptrv2-vcmyb5载体和ptrv1载体；所述ptrv2-vcmyb5载体为将所述基因插入到ptrv2载体的酶切位点ecori和bamhi之间后得到的重组载体。在方法(b)中，所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述转基因植物。所述重组表达载体为将所述基因插入到植物表达载体的多克隆位点后得到的能够表达所述基因的重组载体。在上述两种方法中，均可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将相应载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。在本发明中，所述果实中花青素含量具体为果肉中花青素含量。在本发明中，所述调控植物果实中花青素合成途径相关基因的表达具体为调控植物果肉中花青素合成途径相关基因的表达。其中，所述花青素合成途径相关基因为如下中任一种或任几种：vcpal基因、vcc4h基因、vc4cl基因、vcchs基因。相应的，在本发明中，所述调控植物果实中花青素合成途径相关基因的表达具体体现为：在所述植物果实中，所述蛋白质(或所述基因)的表达量越高，所述pal基因、所述vcc4h基因、所述vc4cl基因、和/或所述vcchs基因的表达量越低；在所述植物果实中，所述蛋白质(或所述基因)的表达量越低，所述vcpal基因、所述vcc4h基因、所述vc4cl基因、和/或所述vcchs基因的表达量越高。在本发明中，所述植物可为越橘属植物，如蓝莓。在本发明的一个实施例中，所述蓝莓具体为蓝莓品种‘喜来(sierra)’。本发明的实验证明，将本发明发现的新基因vcmyb5构建到ptrv2载体中，通过所述vigs沉默体系的方法注入蓝莓果实中，得到vcmyb5基因沉默的蓝莓果实，转基因的蓝莓果实成熟期提前，果皮表现为提前着色，所述转基因蓝莓果实花青素含量显著高于对照组蓝莓果实的花青素含量。上述结果表明vcmyb5基因及其编码的蛋白负调控蓝莓果实中花青素的生物合成。本发明对于培育花青素含量更高的蓝莓新品种具有重要意义。附图说明图1为正常生长与vcmyb5基因vigs后蓝莓果实生长发育曲线。图2为vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后的果实表型。其中“水、侵染液、空载体、vcmyb5”分别表示利用所述vigs体系在所述植物果实中注入“无菌水、侵染液、空ptrv1+空ptrv2、空ptrv1+ptrv1-vcmyb5”的所述植物果实表型变化图。图3为vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默的载体检测。其中，a为ptrv1载体检测；b为ptrv2载体检测。m：dna分子量标准；“1、2、3、5”分别表示利用所述vigs体系在所述植物果实中注入“无菌水、侵染液、携带空ptrv1+空ptrv2的农杆菌侵染液、携带空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的农杆菌侵染”的所述植物果实中所述载体的检测情况。图4为vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后vcmyb5基因在蓝莓果皮和果肉中的表达量变化。其中“ck-水、ck-侵染液、ck-空载体、vcmyb5”分别表示利用所述vigs体系在所述植物果实中注入“无菌水、侵染液、携带空ptrv1+空ptrv2的农杆菌侵染液、携带空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的农杆菌侵染”的所述植物果皮和果肉中所述vcmyb5基因的表达量变化，所述“ck”表示对照组。图中，不同小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。图5为vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后花青素合成途径中的相关基因在蓝莓果皮和果肉中的表达量变化。图中，“ck”表示的是注射“携带空ptrv1+空ptrv2的农杆菌侵染液”的所述植物的果皮和果肉；不同小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。图6为vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后，蓝莓果皮和果肉中的花青素含量变化。其中“ck-水、ck-侵染液、ck-空载体、vcmyb5”分别表示利用所述vigs体系在所述植物果实中注入“无菌水、侵染液、携带空ptrv1+空ptrv2的农杆菌侵染液、携带空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的农杆菌侵染”的所述植物果皮和果肉中的花青素含量变化，所述“ck”表示对照组。图中，不同小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。ptrv2载体和ptrv1载体：由北京农学院沈元月教授馈赠。均记载于“jiahf,shenyy,(2013)virus-inducedgenesilencinginstrawberryfruit.methodsinmolecularbiology.975:211-218.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。蓝莓品种‘喜来(sierra)’：取材于秦皇岛天硕农业科技开发有限公司。实施例1、转录因子vcmyb5及其编码基的获得提取蓝莓品种‘喜来(sierra)’的总rna，并反转录得到cdna，然后以所得cdna为模板，采用引物f和引物r进行pcr扩增，。引物f：5’-atgaattatctgagaccag-3’；引物r：5’-tcaaatcaacaatgattcgg-3’。对扩增产物进行测序，可知所得cdna核苷酸序列为序列表中序列2，与genbank中的序列进行比较，确定它属于蓝莓r2r3-myb类转录因子，将其所示的基因命名为vcmyb5，编码的蛋白命名为vcmyb5，其氨基酸序列为序列表中序列1。上述cdna(序列1)也可以通过人工合成获得。实施例2、基因瞬时vigs沉默体系在蓝莓果实中的建立以及vcmyb5基因的功能研究一、重组表达载体的获得将实施例1所得的pcr产物与peasy-t载体(全式金公司产品)相连接，得到的连接产物用限制性内切酶ecori和bamhi(赛默飞世尔科技公司产品)进行双酶切，得到酶切产物(含有上述vcmyb5基因的dna片段，核苷酸序列为序列表中序列3(序列3仅是在序列2两端添加酶切位点)，酶切产物与经相同酶切的ptrv2载体相连接，连接产物转化大肠杆菌dh5a感受态细胞(天根公司产品)，并涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上培养过夜。挑取白色单菌落，在lb液体培养基中培养过夜并进行菌落pcr鉴定；同时碱法提取质粒dna进行序列测定。测序结果表明，所得重组载体为将序列表中序列2所示的vcmyb5基因的dna片段插入ptrv2载体的酶切位点ecori和bamhi间后得到的重组载体，命名为ptrv2-vcmyb5。二、以vcmyb5为对象在蓝莓果实中建立vigs基因沉默体系将ptrv1载体、ptrv2载体以及上述步骤一制备的重组载体ptrv2-vcmyb5转化农杆菌gv3101的感受态细胞，得到重组菌gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2和gv3101/ptrv2-vcmyb5。对于gv3101/ptrv2-vcmyb5，提取质粒送去测序，证实其中含有重组载体ptrv2-vcmyb5。具体vigs步骤如下：1.活化：将上述重组菌gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2以及gv3101/ptrv2-vcmyb5单克隆接种于含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的lb液体培养基中，28℃振荡培养两天。2.摇菌：将步骤1所述活化的gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2以及gv3101/ptrv2-vcmyb5农杆菌转接到含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素、20mm/l2-吗啉乙醋酸(mes)和10mm/l乙酰丁香酮(as)的lb液体培养基中，28℃振荡培养4-6h使菌液浓度od600≈0.6。3.侵染液培养：将步骤2所述的菌液在20℃条件下，5000rpm/min离心5min。将上述所得农杆菌沉淀用含有20mm/l2-吗啉乙醋酸(mes)和10mm/l乙酰丁香酮(as)的10mm/lmgcl2侵染液重悬并用所述侵染液调节菌液浓度至od600≈1.0。将gv3101/ptrv1与gv3101/ptrv2(或gv3101/ptrv2-vcmyb5)按照1:1的比例混匀后静置2-4h。4.注射：用0.45mm的1ml注射器将重组菌gv3101/ptrv2(或gv3101/ptrv2-vcmyb5)与gv3101/ptrv1的混合液小心地注入白果期‘喜来(sierra)’蓝莓的果实。待果实成熟(20天左右)后采样，观察表形，并进行相关的分子和生理检测。(1)转vcmyb5蓝莓果实的发育曲线统计自注射后蓝莓果实的生长发育时间曲线，绘制生长发育曲线图。每个发育时期随机取10个蓝莓果实，称重后取平均值。每个处理组的蓝莓取样按上述称重方法重复3次，最后取上述3次取样后果实重量均值的平均数绘制生长发育曲线。结果如图1所示，vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后，蓝莓果实注射部分果皮提前着色，成熟期提前14天左右，果实重量与对照组无显著差异。(2)将vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后的果实横向切开。结果如图2所示发现基因vigs沉默部分在蓝莓完全成熟后(对应图1所述实验组花后59天果实)果肉着色，由原来的绿色变为红色表现为花青素积累量的上升。(2)对vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后的病毒载体进行检测。具体操作如下：用ctab法提取上述整个蓝莓果实中的dna，用于病毒载体检测：病毒载体pcr检测引物：rnai引物(扩增产物560bp)正义引物：5’-ttacaggttatttgggctag-3’；反义引物：5’-ccgggttcaattccttatc-3’。rna2引物(扩增产物300bp)正义引物：5’-ttacgacgaaccaagggagtactac-3’；反义引物：5’-agtcacaattagccctatttagatgt-3’。病毒检测进行35个循环。结果如图3所示，结合图2表明携带基因的载体成功转入蓝莓果实并随果实发育表达并转移。4、通过荧光定量pcr实验监测vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后其在蓝莓果皮和果肉中的表达量变化。具体操作如下：通过plantrnakit试剂盒(omega，北京)提取各样品的总rna，并利用primescripttmrtreagentkit反转录试剂盒(tiangen，北京)合成第1链cdna作为模板，用于荧光定量检测。以蓝莓ubc28基因为内参基因，通过abisteponeplus荧光实时定量pcr仪检测vcmyb5基因在上述蓝莓果实和果皮的表达量。每个处理的样品设3个生物学重复。荧光染料使用sybrgreen(tiangen，北京)。反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性30s，60℃退火30s，40个循环。具体引物序列如表1所示：表1用于检测vcmyb5基因以及内参基因ubc28的引物序列结果如图4所示，表明vcmyb5基因在蓝莓果皮和果肉中的表达量均显著下降但在蓝莓果肉中的表达量下降更显著。5、通过荧光定量pcr实验监测vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后花青素合成途径中相关基因(vcpal、vcc4h、vc4cl、vcchs、vcchi、vcdfr、vcf3h、vcrh8、vcans、vcufgt基因)在蓝莓果皮和果肉中的表达量变化。以蓝莓ubc28基因为内参基因，具体操作如步骤4所述，所用引物如表2所示：表2用于检测花青素合成途径中相关基因以及内参基因ubc28的引物序列结果如图5所示，表明vcmyb5基因vigs沉默后果肉中vcpal、vcc4h、vc4cl、vcchs基因的表达量显著上升。6、利用液相色谱法检测vcmyb5基因在蓝莓果实中vigs沉默后，蓝莓果皮和果肉中的花青素含量变化。具体操作如下：样品处理：选取10个完全成熟且成熟度一致的蓝莓果实，切片后放于液氮中，然后于磨样仪进行粉碎。称取1g左右的粉末，加入5ml1％的hcl-甲醇，于4℃黑暗条件下浸提过夜，离心，残渣再用5ml1％的hcl-甲醇浸提2次，合并上清液，定容至20ml，经微孔滤膜(0.22μm有机滤膜)过滤后，进行液相检测。液相检测：所用仪器为agilent产品1200系列液相色谱仪，采用waterssymmetryc18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)，流动相a为10％甲酸，流动相b为乙腈。线性梯度洗脱设计为:0～13min，乙腈为0～20％；20min，乙腈为40％；25min，乙腈为0。检测波长为520nm，进样量为每针20μl，柱温25℃，流速为1ml·min-1。花青素总量以标样天竺葵-3-葡萄糖苷的相应面积计算浓度，所述蓝莓花青素总量以矢车菊定-3-葡萄糖苷的相应面积计算浓度，其中标样购买于上海安谱实验科技股份有限公司。结果如图6所示，蓝莓基因vcmyb5vigs沉默后，蓝莓果皮中的花青素含量有上升的趋势但不显著，而蓝莓果肉中的花青素含量显著增加。上述结果表明，vcmyb5基因或其编码的蛋白具备负调控蓝莓果实中花青素生物合成的功能。<110>北京林业大学<120>调控蓝莓果实中花青素含量的蛋白及其编码基因与应用<130>gncln170824<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>213<212>prt<213>蓝莓<400>1metasntyrleuargproaspilelysargglyasnilethrproasp151015gluaspaspleuileileargmethisalaleuleuglyasnargtrp202530serleuilealaglyargleuproglyargthraspasngluilelys354045asntyrtrpasnthrhisleuserlysargleuargaspglnglythr505560aspproserthrhislyslysleuserglutyrproasnaspglnpro65707580prolyslysargargasnasnasnarglyslysasnlysserasnleu859095glualaarglysglnlysvalhisasnprolysprolysargilethr100105110serleuserserleusermetserargasnserserpheaspcyspro115120125prolysgluglyleuaspvalglnleuserlyspheaspglyasngly130135140aspglyaspglyvalglypheleuvalglyasnaspglnaspproasp145150155160metvalasnglyseraspileglnargglnserglyleuprovalval165170175serasphisasnasnthrglulysleutyrgluglutyrleuglnleu180185190leuileargthrgl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